Name: Métodos espectrofotométricos para el estudio del metabolismo del glucógeno eucariota (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Aprenda métodos espectrofotométricos para estudiar el metabolismo del glucógeno eucariota sin isótopos radiactivos. Estas técnicas económicas permiten medir la actividad de enzimas clave con un espectrofotómetro simple.

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El autor desea agradecer a Karoline Dittmer y Andrew Brittingham por sus ideas y muchas discusiones útiles. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones del Fondo de Educación e Investigación Osteopática de Iowa (IOER 03-17-05 y 03-20-04).

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No hay conflictos de intereses conocidos asociados con este trabajo y no ha habido apoyo financiero para este trabajo que podría haber influido en su resultado.

En general, las ventajas clave de todos los métodos presentados son su bajo costo, facilidad, velocidad y falta de dependencia de equipos especializados. La principal desventaja que todos comparten es la sensibilidad en comparación con otros métodos disponibles. La sensibilidad de los procedimientos que implican la producción o el consumo de NADH/NADPH es fácil de estimar. Dado que el coeficiente de extinción de NADH/NADPH es 6.22 M-1 cm-1 , la aritmética simple indica que ~ 10-20 μM cambios en la c...

El glucógeno está ampliamente distribuido en la naturaleza, y el compuesto se encuentra en bacterias, muchos protistas, hongos y animales. En los microorganismos, el glucógeno es importante para la supervivencia celular cuando los nutrientes son limitantes y, en organismos superiores como los mamíferos, la síntesis y degradación del glucógeno sirven para amortiguar los niveles de glucosa en sangre 1,2,3. El estudio del metabolismo del glucógeno es, por lo tanto, de importancia para campos tan diversos como la microbiología y la fisiología de los mamíferos. Comprender el metabolismo del glucógeno requiere estudiar las enzimas clave de la síntesis de glucógeno (glucógeno sintasa y la enzima ramificante) y la degradación del glucógeno (glucógeno fosforilasa y enzima desramificante). Los ensayos estándar de oro de glucógeno sintasa, fosforilasa, ramificación y actividades enzimáticas de desramificación emplean isótopos radiactivos. Por ejemplo, la glucógeno sintasa se mide generalmente en un ensayo radioquímico detenido siguiendo la incorporación de glucosa de UDP-[14 C]glucosa (en el caso de enzimas animales y fúngicas) o ADP-[14C]glucosa (en el caso de enzimas bacterianas) en glucógeno 4,5. Del mismo modo, la glucógeno fosforilasa se mide en la dirección de la síntesis de glucógeno, después de la incorporación de glucosa de [14C] glucosa-1-fosfato en glucógeno6. La enzima de ramificación se ensaya midiendo la capacidad de esta enzima para estimular la incorporación de [14 C]glucosa de glucosa-1-fosfato en cadenas ligadas a α1,4 por la glucógeno fosforilasa7, y la actividad enzimática de desramificación se determina siguiendo la capacidad de la enzima para incorporar [14C]glucosa en glucógeno8 . Si bien son muy sensibles, lo que permite su uso en extractos de células crudas con bajos niveles de actividad enzimática, los sustratos radiactivos son caros y están sujetos a los requisitos reglamentarios relacionados con el uso de radioisótopos. Estas barreras ponen el uso de ciertos ensayos fuera del alcance de muchos trabajadores. Sin embargo, a lo largo de muchos años, se ha descrito una impresionante variedad de enfoques espectrofotométricos para la medición de estas enzimas. En general, estos enfoques se basan en última instancia en la medición de la producción o el consumo de NADH / NADPH, o la generación de complejos coloreados entre el glucógeno y el yodo. Por lo tanto, son sencillos y se pueden llevar a cabo utilizando espectrofotómetros simples equipados solo con lámparas de flash de tungsteno o xenón.
Los ensayos espectrofotométricos de glucógeno sintasa se basan en la medición del nucleósido difosfato liberado por el donante de nucleótido de azúcar a medida que la glucosa se agrega a la creciente cadena de glucógeno 9,10. El procedimiento para medir la actividad de la glucógeno sintasa descrito en la sección 1 del protocolo, a continuación, es una modificación de la descrita por Wayllace et al.11, y el esquema de acoplamiento se muestra a continuación:
(Glucosa) n + UPD-glucosa → (glucosa)n+1 + UDP
UDP + ATP → ADP + UTP
ADP + fosfoenolpiruvato → piruvato + ATP
Piruvato + NADH + H+ → Lactato + NAD+
La glucógeno sintasa agrega glucosa de UDP-glucosa al glucógeno. El UDP generado en este proceso se convierte en UTP por nucleósido difosfato quinasa (NDP quinasa), en una reacción que genera ADP. El ADP, a su vez, sirve como sustrato para la piruvato quinasa, que fosforila el ADP utilizando fosfoenolpiruvato como donante de fosfato. El piruvato resultante se convierte en lactato por la enzima lactato deshidrogenasa en una reacción que consume NADH. Por lo tanto, el ensayo se puede realizar de manera continua, monitoreando la disminución de la absorbancia a 340 nm a medida que se consume NADH. Se adapta fácilmente para su uso con enzimas que requieren ADP-glucosa como donante de glucosa. Aquí, los pasos de acoplamiento son más simples ya que el ADP liberado por la acción de la glucógeno sintasa es directamente actuado por la piruvato quinasa.
Hay una variedad de ensayos espectrofotométricos disponibles para la determinación de la actividad de la glucógeno fosforilasa. En la versión clásica, la enzima es impulsada hacia atrás, en la dirección de la síntesis de glucógeno, como se muestra a continuación:
(Glucosa) n + Glucosa-1-fosfato → (Glucosa)n+1 + Pi
A intervalos de tiempo, se eliminan las alícuotas de la mezcla de reacción y se cuantifica la cantidad de fosfato liberado12,13. En nuestras manos, este ensayo ha sido de uso limitado debido a la presencia de fosfato libre fácilmente medible en muchas preparaciones comerciales de glucosa-1-fosfato, combinado con las altas concentraciones de glucosa-1-fosfato requeridas para la acción de la fosforilasa. Más bien, hemos empleado rutinariamente un ensayo alternativo que mide la glucosa-1-fosfato liberada a medida que el glucógeno es degradado por la fosforilasa13. Se emplea un esquema de reacción acoplada, ilustrado a continuación.
(Glucosa) n + Pi → (Glucosa)n-1 + Glucosa-1-fosfato
Glucosa-1-fosfato → Glucosa-6-fosfato
Glucosa-6-fosfato + NADP+ → 6-fosfogluconolactona + NADPH + H+
La glucosa-1-fosfato se convierte en glucosa-6-fosfato por la fosfoglucomutasa, y la glucosa-6-fosfato se oxida a 6-fosfogluconolactona, con la reducción concomitante de NADP + a NADPH. El procedimiento detallado en la sección 2 del protocolo, a continuación, se deriva de los métodos descritos por Mendicino et al.14 y Schreiber & Bowling 15. El ensayo se puede realizar fácilmente de manera continua, con el aumento de la absorbancia a 340 nm con el tiempo, lo que permite la determinación de la velocidad de reacción.
La determinación espectrofotométrica de la actividad enzimática desramificante se basa en la medición de la glucosa liberada por la acción de la enzima sobre la dexforilasa límite de dextrina16. Este compuesto se elabora tratando el glucógeno exhaustivamente con glucógeno fosforilasa. Dado que la acción de la glucógeno fosforilasa detiene 4 residuos de glucosa lejos de un punto de ramificación α1,6, el límite de dextrina contiene glucógeno, cuyas cadenas externas se han acortado a ~ 4 residuos de glucosa. La preparación de la dextrina límite de fosforilasa se describe aquí, utilizando un procedimiento derivado de los desarrollados por Taylor et al.17 y Makino & Omichi18.
La desramificación es un proceso de dos pasos. La actividad de la 4-α-glucanotransferasa de la enzima desramificante bifuncional transfiere primero tres residuos de glucosa desde el punto de ramificación al extremo no reductor de una cadena de glucosa cercana ligada a α1,4. El único residuo de glucosa ligado a α1,6 que queda en el punto de ramificación es hidrolizado por la actividad de la α1,6-glucosidasa19. El ensayo generalmente se realiza de manera detenida, la glucosa liberada después de un tiempo determinado (o serie de veces) se mide en un ensayo enzimático acoplado como se muestra a continuación:
(Glucosa) n → (Glucosa)n-1 + Glucosa 
Glucosa + ATP → Glucosa-6-fosfato + ADP
Glucosa-6-fosfato + NADP+ → 6-fosfogluconolactona + NADPH + H+
La determinación de NADPH producido da una medida de la producción de glucosa. El procedimiento descrito en la sección 3 del protocolo, a continuación, se basa en uno descrito por Nelson et al.16. Al igual que los otros métodos que dependen del consumo o la generación de NADH / NADPH, el ensayo es bastante sensible. Sin embargo, la presencia de amilasas u otras glucosidasas, que también pueden liberar glucosa libre de la dextrina límite fosforilasa, causará interferencia significativa (ver Discusión).
La determinación colorimétrica de la actividad enzimática ramificada se basa en el hecho de que las cadenas de glucosa α1,4 adheridas adoptan estructuras helicoidales que se unen al yodo, formando complejos coloreados20. El color del complejo formado depende de la longitud de las cadenas enlazadas α1,4. Por lo tanto, la amilosa, que consiste en cadenas largas, en gran parte no ramificadas, de glucosa ligada a α1,4, forma un complejo azul profundo con yodo. En contraste, los glucógenos, cuyas cadenas externas son generalmente del orden de solo 6 a 8 residuos de glucosa de largo, forman complejos de color rojo anaranjado. Si una solución de amilosa se incuba con enzima ramificada, la introducción de ramas en la amilosa da como resultado la generación de cadenas de glucosa ligadas a α1,4 más cortas. Por lo tanto, el máximo de absorción de los complejos amilosa / yodo se desplaza hacia longitudes de onda más cortas. El procedimiento discutido aquí se deriva del detallado por Boyer & Preiss21 y la actividad enzimática de ramificación se cuantifica como una reducción en la absorción del complejo amilosa / yodo a 660 nm con el tiempo.
Como debería ser fácilmente evidente a partir de la discusión anterior, el hecho de que los colores de los complejos formados entre las cadenas de yodo y α1,4-glucosa varíen con la longitud de la cadena significa que los espectros de absorbancia de los complejos glucógeno/yodo deberían variar con el grado de ramificación del glucógeno. Este es de hecho el caso, y los glucógenos / glucógenos menos ramificados con cadenas externas más largas absorben la luz a una longitud de onda más larga que los glucógenos que son más ramificados / tienen cadenas externas más cortas. Por lo tanto, la reacción de tinción de yodo puede utilizarse para obtener datos rápidos y cualitativos sobre el grado de ramificación del glucógeno22. El color marrón anaranjado se forma cuando los complejos de glucógeno con yodo no son particularmente intensos. Sin embargo, el desarrollo del color puede mejorarse con la inclusión de una solución saturada de cloruro de calcio22. Esto aumenta la sensibilidad del método unas 10 veces y permite un análisis rápido de cantidades de microgramos de glucógeno. El ensayo para la determinación de la ramificación descrito en la sección 4 del protocolo, a continuación, está adaptado de un procedimiento desarrollado por Krisman22. Se lleva a cabo simplemente combinando la muestra de glucógeno con solución de yodo y cloruro de calcio en una cubeta y recogiendo el espectro de absorción de 330 nm a 800 nm. El máximo de absorbancia cambia hacia longitudes de onda más largas a medida que disminuye el grado de ramificación.
En conjunto, los métodos descritos aquí proporcionan medios simples y confiables para evaluar las actividades de las enzimas clave del metabolismo del glucógeno y para obtener datos cualitativos sobre el alcance de la ramificación del glucógeno.

<table><tbody><tr><td>Amilopectina (libre de amilosa) de maíz ceroso</td><td>Fisher Scientific</td><td>A0456</td><td></td></tr><tr><td>Amilosa</td><td>Biosynth Carbosynth YA10257</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP, sal disódica</td><td>MilliporeSigma</td><td>A3377</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa-1,6-bisfosfato, sal de potasio</td><td>MilliporeSigma</td><td>G6893</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa-6-fosfato, sal sódica</td><td>MilliporeSigma</td><td>G7879</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, Grado I, de levadura</td><td>MilliporeSigma</td><td>10127655001</td><td></td></tr><tr><td>Glucógeno, Tipo II de ostra</td><td>MilliporeSigma</td><td>G8751</td><td></td></tr><tr><td>Hexoquinasa</td><td>MilliporeSigma</td><td>11426362001</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas de metacrilato, 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-128</td><td>Se requiere metacrilato ya que algunos procedimientos son conducido a 340 nm o menos</td></tr><tr><td>&beta;-Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato sodio</td><td>sal MilliporeSigma</td><td>N0505</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-nicotinamida adenina dinucleótido, sal disódica reducida</td><td>MilliporeSigma</td><td>43420</td><td></td></tr><tr><td>Nucleósido 5'-difosfato quinasa</td><td>MilliporeSigma</td><td>N0379</td><td></td></tr><tr><td>Fosfoenolpiruvato, sal</td> <td>monopotásicaMilliporeSigma</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>Fosfoglucomutasa del músculo de conejo</td><td>MilliporeSigma</td><td>P3397</td><td></td></tr><tr><td>Fosforilasa A del músculo de conejo</td><td>MilliporeSigma</td><td>P1261</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato quinasa/enzimas lácticas deshidrogenasas del músculo de conejo</td><td>MilliporeSigma</td><td>P0294</td><td></td></tr><tr><td>UDP-glucosa, sal disódica</td><td>MilliporeSigma</td><td>U4625</td><td></td></tr></tbody></table>

métodos espectrofotométricos para el estudio del metabolismo del glucógeno eucariota

Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism

El glucógeno se sintetiza como una forma de almacenamiento de glucosa por una amplia gama de organismos, que van desde bacterias hasta animales. La molécula comprende cadenas lineales de residuos de glucosa ligados a α1,4 con ramas introducidas mediante la adición de enlaces α1,6. Comprender cómo se regulan la síntesis y la degradación del glucógeno y cómo el glucógeno alcanza su estructura ramificada característica requiere el estudio de las enzimas de almacenamiento de glucógeno. Sin embargo, los métodos más comúnmente utilizados para estudiar estas actividades enzimáticas suelen emplear reactivos o técnicas que no están disponibles para todos los investigadores. Aquí, discutimos una batería de procedimientos que son técnicamente simples, rentables y, sin embargo, capaces de proporcionar información valiosa sobre el control del almacenamiento de glucógeno. Las técnicas requieren acceso a un espectrofotómetro, que opera en el rango de 330 a 800 nm, y se describen asumiendo que los usuarios emplearán cubetas de plástico desechables. Sin embargo, los procedimientos son fácilmente escalables y pueden modificarse para su uso en un lector de microplacas, lo que permite un análisis altamente paralelo.

Determinación de la actividad de la glucógeno sintasa La Figura 1 muestra resultados representativos de ensayos de glucógeno sintasa utilizando enzimas purificadas. En el panel A, después de un ligero retraso, hubo una disminución lineal en la absorción a 340 nm con el tiempo durante un período de alrededor de 12 minutos. La tasa de cambio en la absorción en la Figura 1A fue ~0.12 unidades de absorbancia/min. Una tasa de cambio en la absorban...

Se presentan técnicas para medir la actividad de enzimas clave del metabolismo del glucógeno, utilizando un espectrofotómetro simple que opera en el rango visible.

Métodos espectrofotométricos para el estudio del metabolismo del glucógeno eucariota

Glycogen is synthesized as a storage form of glucose by a wide array of organisms, ranging from bacteria to animals. The molecule comprises linear chains ...

Los protocolos son significativos, porque evitan el uso de isótopos radiactivos y eliminan una barrera que puede impedir que muchos trabajadores estudien las enzimas del metabolismo del glucógeno. Los procedimientos descritos son económicos y solo requieren acceso a un espectrofotómetro simple. Para comenzar con la determinación de la actividad de la glucógeno sintasa, descongele las soluciones madre previamente preparadas de glucosa UDP, ATP, fosfoenolpiruvato y NDP quinasa en hielo.Precaliente un baño de agua a 30 grados centígrados. Cuando las soluciones madre estén listas, prepare suficiente mezcla de ensayo de acuerdo con el número de ensayos de glucógeno sintasa agregando los reactivos a un tubo de 15 mililitros, como se describe en el protocolo de texto. Prepare una reacción en blanco reemplazando el NADH de la mezcla de reacción con el agua y transfiera la reacción a una cubeta de metacrilato desechable.Utilice la reacción en blanco para establecer cero en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 340 nanómetros. Tome una alícuota de 770 microlitros de la mezcla de reacción en un tubo de 1,5 mililitros, y agregue secuencialmente dos microlitros de mezcla de quinasa NDP

spectrophotometric-methods-for-study-eukaryotic-glycogen

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Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este video describe un ensayo espectrofotométrico para la estimación de la actividad de la glucógeno sintasa. El método se basa en la reducción de la absorbancia de NADH con el tiempo e indica la actividad de la glucógeno sintasa.

Ensayo espectrofotométrico para determinar la actividad de la glucógeno sintasa

En este video, describimos un ensayo espectrofotométrico cualitativo para determinar el grado de ramificación en una muestra de glucógeno con una estructura no caracterizada. La comparación de los máximos de absorbancia de la muestra no caracterizada con los de los polisacáridos con estructuras ramificadas conocidas indica la presencia de ramificación en la muestra no caracterizada.

Ensayo de ramificación de glucógeno para medir el grado de ramificación de glucógeno

Se describe aquí un método bioquímico exacta, reproducible y conveniente para la titulación de glucógeno in vitro. Esta técnica utiliza el kit de ensayo de Abcam glucógeno y se basa en la hidrólisis sucesivas de glucógeno en glucosa y la glucosa titulación por fluorescencia.

Titulación bioquímica de glucógeno<em&gt; In vitro</em

La tinción de Schiff con ácido peryódico es una técnica que visualiza el contenido de polisacáridos de los tejidos. Este artículo demuestra el protocolo de tinción de Schiff de ácido peryódico adaptado para su uso en células mononucleares de sangre periférica purificadas a partir de sangre venosa humana. Dichas muestras están enriquecidas con linfocitos y otros glóbulos blancos del sistema inmunitario.

La detección de glucógeno en las células mononucleares de sangre periférica con ácido periódico de Schiff tinción

Aquí, presentamos un ensayo fiable y fácil para medir el contenido de glucógeno en células de cianobacterias. El procedimiento implica precipitación, despolimerización seleccionable y la detección de residuos de glucosa. Este método es adecuado para cepas de tipo salvaje y genéticamente modificadas y puede facilitar la ingeniería metabólica de las cianobacterias.

Determinación del contenido de glucógeno en las cianobacterias

Se determinó una concentración óptima de sacarosa para la extracción de glucógeno hepático mediante centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. La adición de un paso de ebullición de 10 minutos para inhibir las enzimas que degradan el glucógeno resultó beneficiosa.

La extracción de moléculas de glucógeno hepático para la determinación de la estructura del glucógeno

Un procedimiento modificado posterior a la fijación aumenta el contraste de las partículas de glucógeno en el tejido. Este documento proporciona un protocolo paso a paso que describe cómo manejar el tejido, realizar las imágenes y utilizar métodos estereológicos para obtener datos imparciales y cuantitativos sobre la distribución de glucógeno subcelular específico del tipo de fibra en el músculo esquelético.

Cuantificación de la distribución de glucógeno subcelular en fibras musculares esqueléticas mediante microscopía electrónica de transmisión

El ensayo de tejido animal utiliza la detección de centelleo nuclear para determinar la actividad enzimática de la glucógeno sintasa midiendo la incorporación de glucosa radiomarcada en el glucógeno.

Evaluación radioquímica de la actividad de la enzima glucógeno sintasa en tejido animal

Describimos aquí un novedoso, robusto y eficiente método de purificación de afinidad en tándem (TAP) para la expresión, aislamiento y caracterización de complejos de proteínas de células eucariotas. Este protocolo podría utilizarse para la caracterización bioquímica de complejos discretos, así como para la identificación de nuevos interactores y modificaciones postraduccionales que regulen su función.

Tandem Affinity purificación de complejos de proteínas a partir de células eucariotas

Describimos una extracción en pequeña escala modificada y análisis colorimétricos de lactato y piruvato en el nematodo elegans C.. Cuando se utilizan kits de ensayo comerciales, el desarrollo técnico de su sensibilidad y su precisión es importante. Precipitación de proteínas en la extracción es el paso más crítico para la determinación cuantitativa de los metabolitos intracelulares.

Análisis colorimétrico de lactato intracelular en pequeña escala y del piruvato en el nematodo Caenorhabditis elegans

Aprenda métodos espectrofotométricos para estudiar el metabolismo del glucógeno eucariota sin isótopos radiactivos. Estas técnicas económicas permiten medir la actividad de enzimas clave con un espectrofotómetro simple.

Métodos espectrofotométricos para el estudio del metabolismo del glucógeno eucariota

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