Name: Monitoreo del crecimiento del cáncer de mama y la formación de colonias metastásicas en ratones utilizando bioluminiscencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Aprende a monitorear el crecimiento tumoral y la metástasis en cáncer de mama mediante bioluminiscencia en ratones. Este método no invasivo utiliza luciferasa y GFP para estudios preclínicos en oncología.

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Agradecemos a los miembros del laboratorio Y.D.S. Nos gustaría agradecer al Instituto Wohl de Medicina Traslacional en el Centro Médico Hadassah, Jerusalén, por proporcionar la instalación de imágenes de animales pequeños. Este estudio fue apoyado por el Premio de Desarrollo de Carrera de Investigación del Fondo de Investigación del Cáncer de Israel.

Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo bajo el protocolo MD-21-16429-5 aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Hebrea. Además, la Universidad Hebrea está certificada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC).
1. Mantenimiento de la línea celular
NOTA: Las líneas celulares de cáncer de mama humano (MCF-7, MDA-MB-468 y MDA-MB-231) se utilizaron en este protocolo.
<ol><li>Cultive todas las líneas celulares de cáncer de mama en el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco, suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10% y penicilina-estreptomicina al 37 °C en una incubadora de dióxido de carbono humidificado (5% CO2). NOTA: Compruebe la densidad celular con regularidad; dividir y expandir para uso futuro cuando alcancen el 70% de confluencia.</li>
</ol>2. Preparación del virus
<ol><li>Trate las células HEK293T con 1 ml de tripsina hasta que se desprendan.</li>
	<li>Agregue 10 ml de DMEM (10% FBS) para neutralizar la actividad de tripsina y transfiera la suspensión celular a un nuevo tubo centrífugo de 15 ml.</li>
	<li>Centrifugar a 150 × g durante 5 min para sedimentar las células. Deseche el sobrenadante después de la centrifugación y agregue 1 ml de medio DMEM fresco.</li>
	<li>Determine la concentración celular y la semilla 1.2 × 106 células / pozo en una placa de seis pocillos.</li>
	<li>Al día siguiente, precalentar todos los reactivos necesarios, incluido el reactivo de transfección, el DMEM sin suero, el plásmido de la envoltura (VSV-G), el plásmido de empaque de lentivirus (ΔVPR) y el plásmido blástico pLX304 Luciferase-V5 o el plásmido FUW GFP.</li>
	<li>En un tubo centrífugo en autoclave de 1,5 ml, mezcle 50 μL de DMEM sin suero con 0,3 μg de plásmido VSV-G, 1 μg de ΔVPR y 1,2 μg de plásmido blásico pLX304 Luciferasa-V5 o plásmido FUW GFP.</li>
	<li>Después de mezclar bien estos plásmidos con el medio, agregue 5 μL del reactivo de transfección, mezcle suavemente e incube la mezcla a temperatura ambiente durante 15 min.</li>
	<li>Después de la incubación, agregue la mezcla gota a gota a las células HEK293T.</li>
	<li>Después de 24 h, reemplace el medio de crecimiento con 2 ml de (30% FBS) DMEM. Al día siguiente (48 h después de la transfección), recolecte el medio que contiene los virus ("pLX304 Luciferase-V5 o los virus FUW GFP"). NOTA: El uso de 30% de FBS mejora la eficiencia de producción de virus.</li>
	<li>Para evitar cualquier residuo de células HEK293T, pase el medio que contiene el virus a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm o centrífuga a 150 × g durante 5 min, y recoja el sobrenadante. NOTA: Para el almacenamiento a largo plazo, mantenga las alícuotas de trabajo del virus a -80 °C.</li>
</ol>3. Establecimiento de células que expresen de manera estable GFP y luciferasa ("células GFP + Luc+")
<ol><li>El día antes de infectar las células, sembra 8 × 105 células por pozo en una placa de seis pocillos.</li>
	<li>Después de la incubación durante la noche, reemplace el medio de crecimiento con un medio fresco que contenga 8 μg / ml de polibreno. Agregue 200 μL de virus FUW GFP gota a gota a las células.</li>
	<li>Opcional: Para mejorar la eficiencia del virus, centrífuga la placa a 560 × g durante 30 min (37 °C) (infección por espín).</li>
	<li>Incubar las células durante 48 h, y verificar la expresión de GFP por microscopía de fluorescencia.</li>
	<li>Clasificar las células que expresan GFP por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) (GFP+) (Figura 1A).</li>
	<li>Infectar las células clasificadas por GFP con los virus blastocitos pLX304 Luciferasa-V5 como se describe en el paso 3.2.</li>
	<li>Tratar las células con blasticidina (10 μg/mL) 30 h después de la infección para enriquecer las células que expresan blastos de luciferasa-V5 pLX304 (células GFP+, Luc+ ). Luego, cada dos días, reemplace con un medio fresco que contenga blasticidina. Además, como control, trate las células naïve con el mismo medio que contiene blasticidina. NOTA: Se debe observar una clara diferencia entre las células infectadas y las células de control después de unos días de tratamiento con blasticidina. Este efecto depende de la línea celular y generalmente toma ~ 8-10 días. Una tasa de supervivencia pobre indicará un bajo rendimiento de producción viral. Si es así, produzca un nuevo lote de virus, ya que la baja eficiencia puede afectar a futuros experimentos.</li>
</ol>4. Validación de la actividad de la luciferasa in vitro
<ol><li>Cultive las células MCF-7, MDA-MB-468 y MDA-MB-231 GFP+ Luc+ en una placa de 15 cm con una confluencia del 80%. Cosechar las células por tripsinización, como se describe en los pasos 2.1-2.2.</li>
	<li>Sembra un número creciente de células en cada pozo (0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4 × 104) en una placa negra de 96 pocillos. NOTA: Las placas negras de 96 pocillos son más adecuadas para medir los niveles de luciferasa, ya que las placas blancas o transparentes producirán señales de autoluminiscencia. Como control, use solución salina tamponada con fosfato (PBS) sola en un pozo para asegurarse de que no haya autoluminiscencia de PBS.</li>
	<li>Llene todos los pozos con 100 μL de DMEM e incube durante 16-24 h.</li>
	<li>Preparar la solución de luciferina en PBS a una concentración de 1,5 mg/ml a partir del caldo de 30 mg/ml. Alícuota el caldo de solución de luciferina y guárdelo a -20 °C.</li>
	<li>Lave las células una vez con PBS suavemente, agregue 100 μL de solución de luciferina en cada pocillo y espere 2 min. Finalmente, mida la actividad de la luciferasa en todas las células de cáncer de mama utilizando bioluminiscencia. NOTA: Examinar la expresión in vitro de GFP y luciferasa antes de los experimentos con animales es crucial. Además, se utilizan pozos en blanco para restar el fondo.</li>
</ol>5. Inyectar ratones con células GFP+ Luc+
<ol><li>Transfiera 5 × 106 (MCF-7 y MDA-MB-468) o 2 × 106 (MDA-MB-231) células GFP+ Luc+ a 200 μL o 100 μL PBS, respectivamente.</li>
	<li>Antes de la inyección, limpie la campana biológica estéril con una solución desinfectante al 5% (consulte la Tabla de materiales). Luego, anestesiar a los ratones con aire filtrado (0,2 μm) que contenga 4% de isoflurano a una velocidad de flujo de aire de 1 L / min durante 2-3 min. NOTA: Es esencial confirmar la anestesia adecuada; pellizque el dedo del pie del ratón y busque cualquier respuesta.</li>
	<li>Coloque un cono sobre la cabeza del ratón anestesiada en posición supina. Aplique ungüento veterinario en sus ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.</li>
	<li>Limpie el área abdominal del ratón, por encima de la glándula mamaria, con etanol usando un hisopo de algodón y levante la4ª glándula mamaria con fórceps.</li>
	<li>Inserte la aguja 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm) debajo de la almohadilla de grasa e inyecte lentamente 100 μL de la suspensión celular. NOTA: Aparecerá una protuberancia redonda debajo de la piel. Además, una inyección inadecuada puede conducir a una desviación en la tasa de crecimiento del tumor o a la ausencia de tumor en el mismo grupo experimental.</li>
	<li>Después del procedimiento de inyección, saque a los ratones de la capucha y transfiéralos a una nueva jaula. Monitorea a los ratones hasta que vuelvan a la conciencia. NOTA: Asegúrese de que todas las agujas y jeringas usadas se desechen en la caja de objetos punzantes.</li>
</ol>6. Medición de los niveles de luciferasa en ratones GFP+ Luc+
<ol><li>Antes de la detección de bioluminiscencia, sujete al ratón consciente sosteniendo su cuello con la mano izquierda. Luego, incline la mano hacia la izquierda, lo que resulta en la cara del ratón hacia arriba con la parte inferior del cuerpo en posición supina.</li>
	<li>Inyecte 100 μL de luciferina (30 mg/ml) por vía intraperitoneal (i.p.) en la superficie abdominal del ratón en el cuadrante abdominal inferior izquierdo con una jeringa de 1,0 ml con aguja de tamaño 27 G x 3/4 (0,4 x 19 mm). NOTA: La punta de la aguja no debe insertarse a más de 3-5 mm de la pared abdominal, ya que podría penetrar en los órganos viscerales. Además, se recomienda realizar la inyección i.p. sin anestesia, ya que la distribución de luciferina en el cuerpo de ratones anestesiados es más lenta que en ratones conscientes. Por lo tanto, el monitoreo de los niveles de luciferasa en ratones conscientes es un procedimiento más rápido.</li>
	<li>Mantenga al ratón durante 7 minutos sin anestesia seguido de 3 minutos dentro de la cámara de anestesia antes de medir la cinética del tumor. NOTA: El tiempo de incubación varía entre los diferentes experimentos, líneas celulares y de una especie a otra. Por lo tanto, se recomienda calibrar el tiempo de incubación antes de comenzar los experimentos.</li>
	<li>Anestesiar a los ratones como se describe en los pasos 5.2-5.3.</li>
	<li>Abra el software (Tabla de materiales) durante la incubación, inicialice el sistema de imágenes y haga clic en el botón Inicializar . NOTA: Tenga en cuenta que la cámara tardará ~ 10 minutos en enfriarse y alcanzar los -90 ° C. Además, como control de fondo, mida los niveles de luciferasa en ratones ingenuos (es decir, ratones GFP + inyectados con células que no expresan el gen de la luciferasa).</li>
	<li>Mantenga la configuración en exposición automática utilizando los siguientes ajustes: tiempo de exposición automático, 60 s; Medio de binificación, F/Stop 1; Filtro de excitación bloqueado; Filtro de emisión abierto. Cuando finalice la inicialización , seleccione Asistente para imágenes | Bioluminiscencia y, a continuación, haga clic en Siguiente | Abrir | de filtro seleccione Ratón en el asunto de la imagen.</li>
	<li>En la vista de campo, seleccione la etapa C (10 cm) y la altura del sujeto: 1,50 cm.</li>
	<li>Haga clic en Etapa de configuración de imagen en C y, antes de hacer clic en el botón Adquirir , asegúrese de que el mouse esté colocado en el escenario en la posición supina adecuada.</li>
	<li>Cierre la puerta, haga clic en el botón Adquirir y espere a que aparezca una imagen en la pantalla. NOTA: Con la opción de exposición automática, una señal fuerte tarda de 5 a 20 s dependiendo de la señal; una señal débil tardará alrededor de 60 s.</li>
	<li>Repita este paso para los otros ratones.</li>
	<li>Para detectar metástasis pulmonares, cubra la señal fuerte del tumor primario con papel de cartón negro grueso y exponga solo el lado ventral de los pulmones hacia la cámara. Capture la imagen utilizando los mismos parámetros descritos anteriormente.</li>
</ol>7. Adquisición de imagen ex vivo mediante bioluminiscencia y fluorescencia
<ol><li>Sacrificar a los ratones usando la inhalación de dióxido de carbono (CO2) en el desecador y diseccionar a los ratones usando tijeras y fórceps en autoclave.</li>
	<li>Perfundir a los ratones usando solución salina al 0.9%, cosechar los órganos y enjuagar con 1x PBS para eliminar las manchas de sangre del órgano.</li>
	<li>Transfiera el órgano enjuagado a una placa de Petri y colóquelo en la etapa de la máquina de bioluminiscencia. Aplique el mismo ajuste de bioluminiscencia que se describe en los pasos 6.2-6.6. NOTA: Debido a la disminución de la señal de luciferasa, este paso limita el tiempo. Por lo tanto, después de la eutanasia de ratones, visualice inmediatamente el órgano por bioluminiscencia.</li>
	<li>Para las imágenes GFP, aplique la misma configuración que se describe en el paso 6.3, utilizando el filtro GFP de fluorescencia en lugar de Bioluminiscencia.</li>
	<li>Tome imágenes pulmonares con un microscopio estereoscópico para examinar la presencia de colonias de GFP+ .</li>
</ol>8. Análisis de datos de bioluminiscencia
<ol><li>Haga doble clic en el software y seleccione Abrir en el menú Archivo .</li>
	<li>Abra todos los archivos y minimícelos. Asegúrese de que todas las unidades sean Radiancia (Fotones).. Además, haga clic en Aplicar a todos para mantener los mismos parámetros para todas las imágenes.</li>
	<li>En el menú Ver , seleccione la Paleta de herramientas, que abrirá una nueva ventana.</li>
	<li>En la ventana Paleta de herramientas , seleccione la pestaña Herramientas de ROI y, en Tipo, elija el ROI promedio de Bkg.</li>
	<li>En las herramientas de ROI, seleccione Círculo y dibuje un círculo pequeño en el área torácica del mouse.</li>
	<li>Haga doble clic en el círculo, seleccione la opción Usar como BKG para futuros ROI en la pestaña ROI en segundo plano y haga clic en Listo.</li>
</ol>9. Medición del flujo total
<ol><li>En la ventana Paleta de herramientas , seleccione la pestaña Herramientas de ROI y, en Tipo, elija La medición del ROI.</li>
	<li>En las herramientas de ROI, seleccione Círculo y dibuje un círculo grande en el tumor primario del ratón.</li>
	<li>Haga clic con el botón derecho en Copiar ROI y haga clic con el botón derecho en Pegar ROI en cada archivo individual de cada mouse.</li>
	<li>Haga clic en Medir ROI en la pestaña Herramientas de ROI , que abrirá una nueva ventana denominada Mediciones de ROI. En esta pestaña, mantenga los tipos de medición como radiancia (fotones) y los atributos de imagen como todos los valores rellenados.</li>
	<li>Exporte el archivo como formato de archivo de medidas (*.txt) o Csv (*.csv).</li>
	<li>Abra los datos exportados en una hoja de cálculo y tome el flujo total (p / s) y los valores de las semanas. NOTA: Este paso se puede utilizar para medir diferentes grupos. Por ejemplo, los ratones tratados con un vehículo frente a los tratados con un medicamento.</li>
	<li>Genere una gráfica XY, donde el Tiempo se presenta a lo largo del eje X y el Flujo Total (p/s) a lo largo del eje Y. Para cada semana, tome el parámetro flujo total (p / s) para cada grupo de muestra y determine cualquier diferencia significativa utilizando la prueba t de Student no paramétrica.</li>
</ol>

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<li>Bajikar, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-suppressor+inactivation+of+GDF11+occurs+by+precursor+sequestration+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor-suppressor inactivation of GDF11 occurs by precursor sequestration in triple-negative breast cancer.</a> Developmental Cell. 43 (4), 418-435 (2017).</li>
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</ol>

Todos los autores han revelado que no tienen ningún conflicto de intereses.

Los experimentos con animales son obligatorios para la investigación del cáncer 7,8,9, y de hecho se han desarrollado muchos protocolos 3,6,10,11,12,13,14. Sin embargo, la mayoría de estos estudios ...

Los cánceres de mama son tipos frecuentes de cáncer en todo el mundo, con aproximadamente 250,000 nuevos casos diagnosticados cada año en los Estados Unidos1. A pesar de su alta incidencia, un nuevo conjunto de medicamentos contra el cáncer ha mejorado significativamente los resultados de las pacientes con cáncer de mama2. Sin embargo, estos tratamientos siguen siendo inadecuados, ya que muchos pacientes experimentan recaída de la enfermedad y diseminación metastásica a órganos vitales2, que es la causa principal de morbilidad y mortalidad del paciente. Por lo tanto, uno de los principales desafíos en la investigación del cáncer de mama es identificar los mecanismos moleculares que regulan la formación de metástasis distales para desarrollar nuevos medios para inhibir su desarrollo.
La metástasis del cáncer es un proceso dinámico en el que las células se desprenden del tumor primario e invaden los tejidos vecinos a través de la circulación sanguínea. Así, los modelos animales en los que las células sufren una cascada metastásica similar pueden facilitar la identificación de los mecanismos que rigen este proceso 3,4. Además, estos modelos in vivo son esenciales para el desarrollo de agentes terapéuticos contra el cáncer de mama 5,6. Sin embargo, estos modelos ortotópicos no pueden indicar la cinética real del crecimiento tumoral, ya que el efecto solo se determina al finalizar. Por lo tanto, establecimos una herramienta basada en luciferasa para detectar el desarrollo tumoral y la colonización metastásica en tiempo real. Además, estas células expresan GFP para detectar las colonias metastásicas. Este enfoque es relativamente simple y no implica ningún procedimiento invasivo3. Por lo tanto, la combinación de la luciferasa y la detección de fluorescencia es una estrategia útil para avanzar en los estudios preclínicos de la terapéutica del cáncer de mama y el manejo de la enfermedad.

<table><tbody><tr><td>Tubos eppendorf de 1,7 mL Lifegene</td><td></td><td>LMCT1.7B-500</td><td></td></tr><tr><td>10 y micro; Puntas L</td><td>Lifegene</td><td>LRT10</td><td></td></tr><tr><td>1000 &micro; Puntas en L</td><td>Lifegene LRT1000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubos de 15 mL</td><td>Lifegene</td><td>LTB15-500</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; Puntas L</td><td>Lifegene</td><td>LRT200</td><td></td></tr><tr><td>placa de cultivo celular de 6 pocillos</td><td>COSTAR</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 pocillos NEGRO Fondo plano</td><td>Barra Naor BN30496</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contadores de celdas automatizados</td><td>Thermofisher</td><td>A50298</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria III clasificador</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD BD Microlance 3 Agujas 27 G (3/4'')</td><td>BD</td><td>302200</td><td></td></tr><tr><td>BD Plastipak Jeringas 1 mL x 120</td><td>BD</td><td>303172</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm x 20 mm Plato</td><td>estilo CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Corning 150 mm x 20 mm Plato estilo</td><td>CORNING</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>Countess portaobjetos de cámara de recuento de células</td><td>Thermofisher</td><td>C10228</td><td></td></tr> Medio de águila <tr><td>modificado de Dulbecco (DMEM), alto en glucosa, sin glutamina</td><td>Biological Industries</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Eclipse 80i</td><td>Centrífuga Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5810 R</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EP5820740000</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-127-1A</td><td></td></tr><tr><td>FUW GFP</td><td></td><td></td><td>Obsequiado por el laboratorio del Dr. Yossi Buganim (Universidad Hebrea de Jerusalén)</td></tr><tr><td>HEK293T</td><td></td><td></td><td>Otorgado por el laboratorio del Dr. Lior Nissim (Universidad Hebrea de Jerusalén)</td></tr><tr><td>Isoflurano, USP Terrell</td><td>Piramal</td><td>NDC 66794-01-25</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagen in vivo IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr> solución <tr><td>de L-glutamina</td><td>Industrias biológicas</td><td>03-020-1A</td><td></td></tr><tr><td>Living Image Software</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>bioluminiscencia medición</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-468</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB-132</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur</td><td>NORMAX</td><td>2430-475</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hylabs</td><td>BP655/500D</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-dR8.2-dvpr</td><td>Addgene</td><td>#8455</td><td>Proporcionado por David M. Sabatini' s lab (Whitehead Institute, Boston, EE.UU.)</td></tr> <tr><td>pCMV-VSV-G</td><td>Addgene</td><td>#8454</td><td>Proporcionado por David M. Sabatini' s lab (Instituto Whitehead, Boston, EE. UU.)</td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri 90 mm (90x15)</td><td>MINI PLAST</td><td>820-090-01-017</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas 10ml</td><td>Lifegene</td><td>LG-GSP010010S</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas 25ml</td><td>Lifegene</td><td>LG-GSP010050S</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas 5ml</td><td>Lifegene</td><td>LG-GSP010005S</td><td></td></tr><tr><td>pLX304 Luciferasa-V5 plásmido de explosión</td><td>Addgene</td><td>#98580</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#107689</td><td></td></tr><tr><td>Prisma 9</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reservorios de reactivos</td><td>Bar Naor BN20621STR200TC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SMZ18 Microscopios estereoscópicos</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Bio-Lab</td><td></td><td></td>190359400</tr><tr><td>Filtros de jeringa</td><td>Lifegene</td><td>LG-FPV403030S</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue 0,5%</td><td>solución Industrias biológicas</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA Solución B (0,25%), EDTA (0,05%)</td><td>Industrias Biológicas</td><td>03-052-1a</td><td></td></tr><tr><td>Filtros accionados por vacío</td><td>SOFRA LIFE SCIENCE</td><td>SPE-22-500</td><td></td></tr><tr><td>Virusolve</td><td></td><td>desinfectante</td><td></td></tr><tr><td>VivoGlo Luciferin, In Vivo Grade</td><td>Promega</td><td>P1043</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA Reactivo de transfección</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#6366236001</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoreo del crecimiento del cáncer de mama y la formación de colonias metastásicas en ratones utilizando bioluminiscencia

Monitoring Breast Cancer Growth and Metastatic Colony Formation in Mice using Bioluminescence

El cáncer de mama es una neoplasia maligna heterogénea frecuente y la segunda causa de mortalidad en las mujeres, principalmente debido a la metástasis de órganos a distancia. Se han generado varios modelos animales, incluidos los modelos de ratón ortotópicos ampliamente utilizados, donde se inyectan células cancerosas en la almohadilla de grasa mamaria. Sin embargo, estos modelos no pueden ayudar a monitorear la cinética de crecimiento tumoral y la colonización metastásica. Las herramientas de vanguardia para monitorear las células cancerosas en tiempo real en ratones avanzarán significativamente en la comprensión de la biología del tumor. 
Aquí, se establecieron líneas celulares de cáncer de mama que expresan de manera estable luciferasa y proteína fluorescente verde (GFP). Específicamente, esta técnica contiene dos pasos secuenciales iniciados por la medición de la actividad de la luciferasa in vitro y seguidos por la implantación de las células cancerosas en almohadillas de grasa mamaria de ratones de inmunodeficiencia combinada (NOD-SCID) diabéticos-graves no obesos. Después de la inyección, tanto el crecimiento del tumor como la colonización metastásica son monitoreados en tiempo real por el sistema de imágenes de bioluminiscencia no invasiva. Luego, la cuantificación de las metástasis que expresan GFP en los pulmones se examinará mediante microscopía de fluorescencia para validar los resultados de bioluminiscencia observados. Este sofisticado sistema que combina luciferasa y herramientas de detección basadas en fluorescencia evalúa la metástasis del cáncer in vivo, que tiene un gran potencial para su uso en la terapéutica del cáncer de mama y el manejo de enfermedades.

Generamos líneas celulares de cáncer de mama (MDA-MB-231, MCF-7 y MDA-MB-468) que expresan vectores de GFP y luciferasa. Específicamente, esto se logró mediante una infección secuencial. Primero, las líneas celulares de cáncer de mama se infectaron con un vector de lentivirus que expresa GFP fluorescente. Las células GFP-positivas (GFP+) se clasificaron 2 días después de la infección (Figura 1A, B) y se infectaron con el vector pLX304 Luciferasa-V5. Luego, se util...

Aquí, describimos un método de monitoreo no invasivo que involucra la expresión de luciferasa y proteína fluorescente verde en varias líneas celulares de cáncer de mama. Este protocolo proporciona una técnica para monitorizar la formación tumoral y la colonización metastásica en tiempo real en ratones.

Monitoreo del crecimiento del cáncer de mama y la formación de colonias metastásicas en ratones utilizando bioluminiscencia

Breast cancer is a frequent heterogeneous malignancy and the second leading cause of mortality in women, mainly due to distant organ metastasis. Several ...

Utilizando esta sofisticada herramienta no invasiva, podemos monitorear en tiempo real la cinética de crecimiento tumoral y la colonización metastásica en ratones, lo que tiene un gran potencial en la terapéutica del cáncer de mama y el manejo de la enfermedad. La combinación de luciferasa y detección de fluorescencia es una estrategia útil para avanzar en los estudios preclínicos de progresión del cáncer de mama y manejo de la enfermedad. Esto se puede aplicar para estudios de medicamentos contra el cáncer.Este protocolo no se limita al cáncer de mama y podría aplicarse a otros carcinomas, como el de pulmón y de páncreas. Comience por cultivar las células MCF-7, MDA-MB-468 y MDA-MB-231 GFP y luciferasa positivas por separado en una placa de 16 centímetros al 80% de confluencia. Después de cosechar las células por tripsinización, sembra un número creciente de células en cada pozo en una placa negra de 96 pocillos.Luego, llene todos los pozos con 100 microlitros de DMEM e incube durante 16 a 24 horas en una incubadora de 37 grados Celsius, 5% co2. Prepare la solución de luciferina en PBS a una concentración de 1.5 miligramos por mililitro y almacene la solución a menos 20 grados Cel

monitoring-breast-cancer-growth-metastatic-colony-formation-mice

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Un modelo experimental de ratón de las metástasis óseas se estableció después de la entrega intracardíaca de luciferasa que expresan las células del tumor mamario. El desarrollo de tumores y dio lugar a lesión osteolítica fueron controlados longitudinalmente con bioluminiscencia y micro TC.

Monitoreo metástasis tumorales y lesiones osteolíticas con bioluminiscencia y Micro Imágenes de TC

Imágenes de bioluminiscencia de inducible por hipoxia-1α factor de actividad se aplica al seguimiento del desarrollo de la hipoxia tumoral intracraneal en un modelo de ratón de cáncer de mama metástasis cerebrales.

Imágenes in vivo de tumores bioluminiscencia Dinámica hipoxia de la metástasis cerebral cáncer de mama en un modelo de ratón

Fuente:Marina Arantes Radicchi1, Victor Carlos Mello1,Victória Paz Machado1, Márcia Cristina Oliveira da Rocha1, Jaqueline Vaz de Oliveira1, Luana Cristina Camargo1,2, Luís Alexandre Muehlmann1, Ricardo Bentes Azevedo1, Sônia Nair Bao1, João Paulo Figueiró Longo11Instituto de Ciencias Biológicas, Universidad de Brasilia, 2Departamento de Procesos Psicológicos Básicos, Instituto de Psicología, Universidad de BrasiliaEste video demuestra el procedimiento para rastrear la progresión tumoral in...

Imágenes bioluminiscentes de la progresión del tumor de mama en un modelo de ratón hembra

Imágenes de bioluminiscencia es una herramienta bien conocida para la localización de tumores y metástasis, pero la cuantificación de estas imágenes a menudo requiere cálculos complejos e instrumentos particulares. Se describe el método luminoscore de usar fácil, sobre la base de condiciones de adquisición precisas, que no requiere de cálculos, y que permite la carga tumoral y la respuesta al tratamiento a ser monitoreados en modelos de ratón.

Método de cuantificación del tumor bioluminiscencia-base para la progresión tumoral Monitoreo y efectos del tratamiento en modelos de ratón linfoma

Un modelo de tumor primario de cáncer de mama ortotópico y la extirpación quirúrgica del tumor primario para extender la vida del ratón para generar metástasis espontánea se describen. El crecimiento del tumor y la progresión se supervisan y se cuantificaron por imágenes de fluorescencia de la luciferasa.

Un modelo de ratón ortotópico de cáncer de mama metástasis espontánea

Presentamos un modelo de cáncer de mama Murino ortotópico y mastectomía radical modelo con tecnología de bioluminiscencia para cuantificar la carga del tumor para imitar la progresión del cáncer de mama humano.

Generación de un modelo Murino ortotópico de cáncer de mama metastásico y la realización de mastectomía Radical murino

Este protocolo describe el establecimiento de un modelo de ratón con tumores para monitorear la progresión tumoral y la angiogénesis en tiempo real mediante imágenes de bioluminiscencia dual.

Imagen de bioluminiscencia dual de la progresión tumoral y la angiogénesis

Este trabajo preestablece un protocolo avanzado para evaluar con precisión la carga del tumor mediante la detección de señales de proteína fluorescente verde y bioluminiscencia, así como la integración de la técnica de detección molecular cuantitativa.

Estudio del triple cáncer de mama negativo con el modelo de cáncer de mama ortotópico

El enfoque descrito combina ensayos experimentales de metástasis de la vena de cola con imágenes animales vivos in vivo para permitir el monitoreo en tiempo real de la formación y el crecimiento de metástasis de cáncer de mama, además de la cuantificación del número y tamaño de metástasis en los pulmones.

Uso combinado de ensayos de metástasis de vena de cola e imágenes en tiempo real en vivo en vivo para cuantificar la colonización metastásica del cáncer de mama y la carga en los pulmones

El manuscrito describe una metodología para el establecimiento y seguimiento longitudinal del crecimiento de las metástasis pulmonares espontáneas de tumores de mama inyectados ortotópicamente, susceptibles de intervención en todas las etapas de la cascada metastásica.

In vivo Diagnóstico por imágenes para medir la metástasis pulmonar espontánea de células tumorales de mama inyectadas ortotópicamente

Aquí, describimos el protocolo para la administración in vivo de nanopartículas magnéticas de óxido de hierro portadoras de oligómeros de ARN al cáncer de mama metastásico en modelos animales, proporcionando un enfoque clínicamente viable para el silenciamiento terapéutico de ácidos nucleicos oncogénicos.

Monitorización de la acumulación de nanofármacos en metástasis de cáncer de mama murino

Aprende a monitorear el crecimiento tumoral y la metástasis en cáncer de mama mediante bioluminiscencia en ratones. Este método no invasivo utiliza luciferasa y GFP para estudios preclínicos en oncología.

Monitoreo del crecimiento del cáncer de mama y la formación de colonias metastásicas en ratones utilizando bioluminiscencia

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