Name: Determinación del gasto de energía basal y la capacidad de los adipocitos termogénicos para gastar energía en ratones obesos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Aprende a medir el gasto energético basal y la capacidad oxidativa de adipocitos termogénicos en ratones obesos mediante calorimetría indirecta. Este protocolo permite evaluar el balance energético y su relación con cambios de peso corporal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ML está financiado por el Departamento de Medicina de UCLA, subvenciones piloto de P30 DK 41301 (UCLA: DDRC NIH) y P30 DK063491 (UCSD-UCLA DERC).

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California, Los Ángeles (UCLA). A los ratones se les administró su dieta y agua ad libitum en la jaula metabólica, alojada en un ambiente de temperatura controlada (~ 21-22 o 30 ° C) con un ciclo de luz / oscuridad de 12 horas. Para este estudio se utilizaron ratones hembra de 8 semanas de edad alimentados con una dieta alta en grasas o dieta chow durante 8 semanas.
1. Medición de la tasa metabólica basal (TMB)
<ol><li>Mida el peso corporal total del ratón utilizando una báscula de peso con una precisión en el rango de 0,1 g. NOTA: Esto debe hacerse antes de alojar a los ratones en jaulas metabólicas y después de los 2-3 días del período de aclimatación a las jaulas metabólicas.</li>
	<li>Mida la composición corporal, incluida la grasa y la masa magra en ratones no anestesiados, utilizando un sistema de análisis de composición corporal apropiado (ver Tabla de materiales). NOTA: Estas mediciones son necesarias para determinar el gasto de energía y se ejecutan en paralelo a las mediciones del peso corporal total (paso 1.1).</li>
	<li>Configure las jaulas metabólicas y comience el período de aclimatación. NOTA: El sistema de jaulas metabólicas incluye un recinto que permite al usuario controlar la temperatura y la luz de la carcasa de 12 jaulas (Figura 1A, B). Cada jaula tiene una botella de agua, un comedero y una rejilla (Figura 1C). La rejilla separa el ratón de la parte inferior de la jaula, lo que permite la recolección de heces. Una vez que la jaula está instalada en cada espacio predeterminado, una tapa que sella la jaula incluye la ranura de la botella de agua, el tubo de muestreo de aire, el sistema de flujo de aire y el sensor de actividad física (Figura 1D).<ol>
<li>Encienda la carcasa de temperatura, el sistema de flujo de aire y la computadora 2 h antes de comenzar el ensayo.</li>
		<li>Después de 2 h, abra el software que controla la carcasa (consulte la Tabla de materiales) y el flujo de aire y deje que el software pruebe la comunicación de la computadora con el equipo. NOTA: Para el presente trabajo se utilizó el software Oxymax.</li>
		<li>Una vez establecida la comunicación, haga clic en Archivo, luego en Abrir configuración del experimento (Figura 2A) y seleccione la configuración del experimento prediseñada por el proveedor (o configurada a partir de un ensayo anterior).</li>
		<li>Haga clic en Experimento, luego haga clic en Propiedades, que abrirá la ventana Propiedades del experimento (Figura 2B).</li>
		<li>En la ventana Propiedades, configure los parámetros del recinto ambiental, incluidos los ciclos de temperatura ambiente (21 °C) y 12 h. NOTA: Mantener el software abierto y en funcionamiento permite que el aire fluya hacia las jaulas y el recinto para mantener la temperatura y los ciclos de luz seleccionados. Por lo tanto, todo el sistema puede funcionar con ratones dentro de las jaulas durante varios días, incluso sin medir oxígeno y CO2.
</li>
		<li>Haga clic en Experimento, luego haga clic en Configuración y se abrirá la ventana Configuración del experimento , donde se definen los parámetros de cada jaula metabólica.</li>
		<li>Asigne cada ID de ratón a la jaula individual donde se aloja el ratón (Figura 2C).</li>
		<li>Incluya la masa magra o el peso corporal total de cada ratón solo si no se observan diferencias en el peso corporal entre los grupos. NOTA: La obtención de valores brutos de consumo de oxígeno y gasto energético facilita los análisis de ANCOVA.</li>
		<li>Ajuste la tasa de flujo de aire a la jaula metabólica en 0.5-0.6 L / min.</li>
		<li>En la ventana Configuración del experimento, seleccione la ruta de acceso y el nombre de guardado del archivo. Seleccione el directorio de copia de seguridad (Figura 2D).</li>
		<li>Agregue una cantidad preponderada de alimentos a los comederos que cubra al menos la ingesta de alimentos durante 1 día. NOTA: Si las jaulas tienen escamas integradas, la comida se puede agregar directamente y el software la registrará.</li>
		<li>Añadir las botellas de agua. Compruebe que el frasco esté sellado correctamente y no tenga fugas.</li>
		<li>24 h después de agregar la comida, pesar la comida que queda en la jaula. NOTA: Los gramos de comida agregada menos los gramos de comida restantes medirán la ingesta de alimentos.</li>
		<li>Comience las mediciones de oxígeno, CO2 y actividad (paso 1.4.10) una vez que los valores de ingesta de alimentos sean los mismos que los de los ratones alojados en jaulas regulares. NOTA: Aquí, se completa el período de aclimatación (generalmente 2-3 días) y pueden comenzar las mediciones de gasto de energía.</li>
	</ol></li>
	<li>Calorimetría indirecta y mediciones de actividad para evaluar el gasto energético<ol>
<li>Mida el peso corporal, la grasa y la masa magra de todos los ratones antes de comenzar las mediciones. NOTA: Estos son los valores de peso corporal y masa magra utilizados para realizar los análisis de ANCOVA.</li>
		<li>Calibrar el detector basado en zirconia de O2 y CO2 del sistema CLAMS (ver Tabla de Materiales) con la concentración de oxígeno recomendada; siempre vuelva a calibrar el detector antes de comenzar un nuevo experimento.</li>
		<li>Utilizar un gas de calibración de composición conocida (20,50% de oxígeno y 0,50% de CO2). NOTA: Los proveedores de gas a menudo se refieren a este gas como "Grado estándar primario".</li>
		<li>Encienda y asegúrese de que la presión de salida del tanque sea de 5-10 psi.</li>
		<li>Abra el software de la Utilidad de calibración para calibrar y probar los sensores de gas (Figura 2E). Haga clic en Experimentar y, a continuación, en Calibrar.</li>
		<li>Pulse Inicio. Luego, espere a que se prueben los sensores y a que el software le pida al usuario que gire las perillas del sensor de gas (Figura 2F) hasta que el valor de la identidad de O2 sea 1 (Figura 2G-H). Haga clic en Siguiente cuando se complete el paso. NOTA: Si la Utilidad de calibración realiza todos los pasos actuales, la calibración pasará automáticamente al siguiente paso cuando se llene la barra de progreso.</li>
		<li>Verifique los resultados de la calibración cuando se hayan completado todos los pasos y se presenten los resultados.</li>
		<li>Apague el gas de calibración.</li>
		<li>Cambie los alimentos y agregue suficiente comida durante un período de 48-72 h. NOTA: Aunque las jaulas podrían abrirse durante las mediciones de gasto de energía para controlar el peso corporal y cambiar los alimentos diariamente, los ratones pueden estresarse por estas manipulaciones, y las mediciones se pierden cuando se abren las jaulas. Por lo tanto, se recomienda evitar cualquier manipulación durante el período de medición.</li>
		<li>En el software, haga clic en Experimento y luego en Ejecutar para iniciar las mediciones de oxígeno, CO2 y actividad (Figura 3A). NOTA: La ejecución de las mediciones se puede rastrear en tiempo real en un cuadro ubicado en la sección inferior izquierda del software (rectángulo rojo, Figura 3B). El rectángulo rojo de la Figura 3B muestra que el sistema mide la jaula #1 en el intervalo #3, es decir, la 3ª medición. Una medición en una jaula puede tomar aproximadamente 1 minuto. Así, con 12 jaulas conectadas, el consumo de oxígeno se puede medir aproximadamente cada 12 min. Se recomiendan mediciones continuas durante un mínimo de 48 h.</li>
		<li>Detenga el experimento haciendo clic en Experimento y, a continuación, en Detener (Figura 3C).</li>
		<li>Abra las jaulas, pese a los ratones y la comida. Recolecte las heces para calcular el número de calorías y lípidos excretados durante el período de medición de 48-72 h. NOTA: Las heces se pueden almacenar a -20 °C para análisis posteriores. Estas jaulas no se pueden usar de manera efectiva para recolectar orina.</li>
		<li>Haga clic en Experimentos, luego en Exportar y Exportar todos los temas como un archivo CSV (Figura 3D). NOTA: Para facilitar los análisis de ANCOVA, es esencial exportar los valores de consumo de oxígeno bruto (VO2) y producción de CO2 (VCO2) sin ser normalizados por el peso corporal.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de datos y control de calidad<ol>
<li>En la hoja CSV exportada (Figura 3D) (del paso 1.4.13), utilice los valores brutos del consumo de oxígeno (VO2) y la producción de CO2 (VCO2) medidos cada 12 minutos en el período de 2-3 días que el software enumera automáticamente e incluya una marca de tiempo, es decir, la hora y la fecha en que se midieron. NOTA: Los valores de VO2 y VCO2 se corregirán automáticamente si se agregan valores de peso corporal o masa magra.</li>
		<li>En la hoja CSV exportada, utilice los valores brutos de la relación de intercambio respiratorio (RER: VCO2/VO2) que el software calcula y enumera automáticamente de acuerdo con su marca de tiempo. NOTA: Los valores cercanos a 1 muestran que el ratón oxida principalmente los carbohidratos, mientras que los valores más cercanos a 0,7 representan que el ratón está oxidando principalmente la grasa. EL RER por encima de 1 puede ocurrir durante el ejercicio anaeróbico, ya que el cuerpo expulsa más CO2 para compensar la acidosis causada por el lactato. RER superior a 1 puede indicar estrés. El archivo CSV exportado también contiene los valores brutos del gasto de energía (EE) o la producción de calor en calorías por minuto por ratón, medidos cada 12 minutos en los 2-3 días. Aquí, todos los valores enumerados incluyen una marca de tiempo.</li>
		<li>Como se necesitan valores únicos de EE por ratón para un ANCOVA, promedie los valores de EE registrados entre las 09:00-16:00 para la fase de luz (día) y las 19:00-04:00 para la fase oscura (nocturna) por ratón y día. NOTA: Esto se puede hacer manualmente usando Excel o Graph Pad. La selección de estas ventanas de dos tiempos evita promediar los valores de EE intermedios, graduales e inestables asociados con la transición de fase claro-oscuro.</li>
		<li>Durante un período de 48 horas, calcule el promedio de los dos valores de luz diurna y los dos valores de fase oscura por mouse usando Excel o Graph Pad.</li>
		<li>Para cuantificar la actividad física total, use Excel o Graph Pad para sumar los recuentos de rotura de haz x, y y z medidos en las jaulas metabólicas y enumerados en el archivo CSV para cada mouse. NOTA: La actividad total x, y, z se calcula haciendo primero el valor promedio de cada X, Y, Z por mouse y ciclo. Luego, se determina la suma de cada valor promedio X, Y, Z por ratón y ciclo para trazar los datos como en la Figura 5E (siendo el promedio de 2 días).</li>
		<li>Alternativamente, represente los datos que muestran cada valor de medición a lo largo del tiempo, lo que genera curvas que ilustran los cambios en EE durante la transición de los ciclos de luz a oscuridad. NOTA: Consulte la sección de discusión sobre cómo y cuándo realizar los análisis de ANCOVA, y las diferentes fórmulas utilizadas para calcular el VO2, VCO2 y EE se proporcionan en el Archivo Complementario 1.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Medición de la capacidad de los adipocitos termogénicos para gastar energía
<ol><li>Configure las mediciones y los tratamientos con ratones. Consulte el paso 1 para obtener detalles sobre las preparaciones experimentales para controlar el consumo de oxígeno, ya que la capacidad termogénica en los adipocitos se determina indirectamente por el consumo de oxígeno siguiendo los pasos 2.1.1-2.2.2. NOTA: Este protocolo requiere anestesia en ratones y tratamiento agudo con el agonista del receptor beta-3 CL-316,243 (ver Tabla de Materiales), dando una evaluación rápida de la capacidad termogénica ba.<ol>
<li>Realizar análisis de composición corporal y pesar los ratones. Encienda las ALMEJAS, configure la temperatura a 30 °C (termoneutralidad) y espere 2 h a que todo el sistema se caliente.</li>
		<li>Configure el resto de las condiciones del ensayo, incluida la luz, asigne id de ratón a cada jaula y agregue el valor de peso corporal de cada ratón en la jaula correspondiente si no se observa ninguna diferencia en el peso corporal entre los grupos.</li>
		<li>Calibre el detector de oxígeno/CO2 como en los pasos 1.4.2-1.4.7.</li>
		<li>Inicie el experimento en el software.</li>
		<li>Inyecte a cada ratón pentobarbital (60-120 mg/kg) y coloque a cada ratón en su jaula metabólica asignada (paso 2.1.2). NOTA: La dosis de pentobarbital requerida para mantener a los ratones dormidos a la termoneutralidad (30 °C) varía con la cepa y el genotipo del ratón. Se recomienda probar diferentes dosis de pentobarbital de 50 a 120 mg/kg y elegir la que mantenga al ratón anestesiado durante 2-3 h a 30 °C. La anestesia eficiente es esencial para eliminar la contribución de la actividad física al gasto energético.</li>
		<li>Para asegurar la anestesia, observe a los ratones después de la inyección de pentobarbital hasta que estén completamente dormidos y sus tasas de consumo de oxígeno disminuidas se vuelvan constantes.</li>
		<li>Espere a obtener al menos 3 tasas de consumo de oxígeno consecutivas estables antes de inyectar CL-316,243. NOTA: Mientras espera la estabilización del consumo de oxígeno, prepare las jeringas con CL-316,243 para cada ratón (1 mg/kg).</li>
		<li>Abra la jaula # 1 e inyecte CL-316,243 por vía subcutánea inmediatamente después de que se produjo una medición de VO2 y VCO2 en la jaula # 1. Devuelva el ratón a la jaula #1 inmediatamente después de la inyección. NOTA: Las mediciones se indican en tiempo real en la sección inferior izquierda del software (Figura 3B, rectángulo rojo).</li>
		<li>Espere a que se mida la jaula # 2 (Figura 3B, rectángulo rojo) y luego continúe como en el paso 2.1.8 para la jaula # 2. NOTA: La inyección de CL-316,243 inmediatamente después de una medición permite mantener el tiempo constante entre inyecciones. Por ejemplo, si hay 12 ratones / jaulas en funcionamiento, con mediciones recopiladas en jaulas individuales secuencialmente y la colección que dura 55 s por jaula, entonces debe inyectar un ratón cada minuto. Con estas tasas de inyección, la primera medición ocurrirá después de 12 minutos después de la inyección en las 12 jaulas.</li>
		<li>Continúe las mediciones de gasto de energía hasta que los valores de gasto de energía se estabilicen durante 5-6 mediciones consecutivas, generalmente 90-180 minutos después de la inyección. NOTA: Los ratones podrían despertarse de la anestesia durante los experimentos. Estos ratones deben ser retirados del análisis. Por lo tanto, probar las dosis de pentobarbital de antemano aumentará la eficiencia de los estudios.</li>
		<li>Detenga las mediciones de gasto de energía, pero mantenga a los ratones en sus jaulas a 30 ° C, hasta que se despierten.</li>
		<li>Después de que los ratones estén completamente despiertos, inspeccione la salud de los ratones y devuélvalos a sus jaulas iniciales.</li>
		<li>Exporte los datos de cada ratón como un archivo CSV utilizando el software del equipo, tal como se describe en la sección 1.4.13.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de datos NOTA: El análisis de los datos fue realizado por Excel o Graphpad<ol>
<li>Trazar los 3-5 valores consecutivos de VO2, VCO2 y EE que son estables y constantes en el tiempo, ya que estos son los valores que representan la tasa metabólica cuando los ratones están completamente anestesiados.</li>
		<li>A continuación, trace la primera y las siguientes mediciones consecutivas de VO2, VCO2 y EE obtenidas después de la inyección. NOTA: Los valores absolutos de EE y el aumento de pliegue en EE inducido por inyección indican la función termogénica ba7.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Rolfe, D. F., Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+energy+utilization+and+molecular+origin+of+standard+metabolic+rate+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cellular energy utilization and molecular origin of standard metabolic rate in mammals.</a> Physiological Reviews. 77 (3), 731-758 (1997).</li>
<li>Heymsfield, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+energy+expenditure%3A+advances+in+organ-tissue+prediction+models%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+Reviews%22%5BJournal%5D)">Human energy expenditure: advances in organ-tissue prediction models.</a> Obesity Reviews. 19 (9), 1177-1188 (2018).</li>
<li>Kummitha, C. M., Kalhan, S. C., Saidel, G. M., Lai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relating+tissue%2Forgan+energy+expenditure+to+metabolic+fluxes+in+mouse+and+human%3A+experimental+data+integrated+with+mathematical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Relating tissue/organ energy expenditure to metabolic fluxes in mouse and human: experimental data integrated with mathematical modeling.</a> Physiological Reports. 2 (9), 12159(2014).</li>
<li>Tschop, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+analysis+of+mouse+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A guide to analysis of mouse energy metabolism.</a> Nature. 9 (1), 57-63 (2011).</li>
<li>Mina, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CalR%3A+A+Web-Based+Analysis+Tool+for+Indirect+Calorimetry+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">CalR: A Web-Based Analysis Tool for Indirect Calorimetry Experiments.</a> Cell Metabolism. 28 (4), 656-666 (2018).</li>
<li>Shum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCB10+exports+mitochondrial+biliverdin%2C+driving+metabolic+maladaptation+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">ABCB10 exports mitochondrial biliverdin, driving metabolic maladaptation in obesity.</a> Science Translational Medicine. 13 (594), (2021).</li>
<li>Assali, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NCLX+prevents+cell+death+during+adrenergic+activation+of+the+brown+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">NCLX prevents cell death during adrenergic activation of the brown adipose tissue.</a> Nature Communication. 11 (1), 3347(2020).</li>
<li>Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Special+Report%3A+The+1996+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> ILAR Journal. 38 (1), 41-48 (1997).</li>
<li>Schena, G., Caplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Everything+You+Always+Wanted+to+Know+about+beta3-AR+%2A+%28%2A+But+were+afraid+to+ask%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Everything You Always Wanted to Know about beta3-AR * (* But were afraid to ask).</a> Cells. 8 (4), 357(2019).</li>
<li>Granneman, J. G., Burnazi, M., Zhu, Z., Schwamb, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White+adipose+tissue+contributes+to+UCP1-independent+thermogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">White adipose tissue contributes to UCP1-independent thermogenesis.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 285 (6), 1230-1236 (2003).</li>
<li>Szentirmai, E., Kapas, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+brown+adipose+tissue+in+beta3-adrenergic+receptor+activation-induced+sleep%2C+metabolic+and+feeding+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The role of the brown adipose tissue in beta3-adrenergic receptor activation-induced sleep, metabolic and feeding responses.</a> Scientific Reports. 7 (1), 958(2017).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay conflicto de intereses en este documento de protocolo. M.L. es cofundador y consultor de Enspire Bio LLC.

La calorimetría indirecta se ha utilizado durante años para evaluar el gasto energético de todo el cuerpo4. Este protocolo descrito aquí proporciona un método sencillo para medir la tasa metabólica basal y determinar la capacidad termogénica de BA in vivo utilizando jaulas metabólicas.
El método de calorimetría indirecta descrito aquí confirma que dividir los valores de gasto de energía por los valores de peso corporal puede ser engañoso. Por ejemplo, se puede ...

El metabolismo se puede definir como la integración de las reacciones bioquímicas responsables de la absorción, almacenamiento, transformación y descomposición de nutrientes que las células utilizan para crecer y realizar sus funciones. Las reacciones metabólicas transforman la energía contenida en los nutrientes en una forma que puede ser utilizada por las células para sintetizar nuevas moléculas y ejecutar el trabajo. Estas reacciones bioquímicas son inherentemente ineficientes para transformar esta energía en una forma utilizable para sostener la vida1. Tal ineficiencia resulta en la disipación de energía en forma de calor, y esta producción de calor se utiliza para cuantificar la tasa metabólica estándar (SMR) de un organismo1. La condición estándar se definió clásicamente como la producción de calor que ocurre en un adulto despierto pero en reposo, que no ingiere ni digiere alimentos, en termoneutralidad y sin ningún tipo de estrés1. La tasa metabólica basal (TMB) o el gasto de energía basal en ratones se conoce como SMR, pero en individuos que ingieren y digieren alimentos bajo estrés térmico leve (temperatura ambiente 21-22 ° C)1. Los desafíos y dificultades de medir directamente la producción de calor hicieron que la calorimetría indirecta, es decir, el cálculo de la producción de calor a partir de las mediciones de consumo de oxígeno, se convirtiera en el enfoque más popular para determinar la TMB. Calcular la TMB a partir del consumo de oxígeno es posible porque la oxidación de nutrientes por parte de las mitocondrias para sintetizar ATP es responsable del 72% del oxígeno total consumido en un organismo, con un 8% del consumo total de oxígeno que también ocurre en las mitocondrias pero sin generar ATP (respiración desacoplada)1. La mayoría del 20% restante del oxígeno consumido se puede atribuir a la oxidación de nutrientes en otras ubicaciones subcelulares (oxidación de ácidos grasos peroxisomales), procesos anabólicos y formación de especies reactivas de oxígeno1. Así, en 1907, Lusk estableció una ecuación, basada en mediciones empíricas, ampliamente utilizada para transformar el consumo de oxígeno y la producción de CO2 en disipación de energía en forma de calor. En los seres humanos, el cerebro representa ~ 25% de la TMB, el sistema musculoesquelético para ~ 18.4%, el hígado para ~ 20%, el corazón para ~ 10% y el tejido adiposo para ~ 3-7%2. En ratones, la contribución del tejido a la TMB es ligeramente diferente, con el cerebro representando ~ 6.5%, el músculo esquelético ~ 13%, el hígado ~ 52%, el corazón ~ 3.7% y el tejido adiposo ~ 5%3.
Sorprendentemente, las reacciones bioquímicas que definen la TMB no son fijas y cambian en respuesta a diferentes necesidades, como el trabajo externo (actividad física), el desarrollo (crecimiento de tejidos), las tensiones internas (contrarrestar infecciones, lesiones, renovación de tejidos) y los cambios en la temperatura ambiente (defensa contra el frío)1. Algunos organismos reclutan activamente procesos para generar calor en la exposición al frío, lo que implica que el calor producido por el metabolismo no es solo un subproducto accidental. En cambio, la evolución seleccionó mecanismos reguladores que podrían regular específicamente la producción de calor al cambiar la tasa de reacciones metabólicas1. Por lo tanto, estas mismas mediciones de consumo de oxígeno se pueden utilizar para determinar la capacidad de un organismo para generar calor en respuesta al frío.
Dos procesos principales contribuyen a la generación de calor tras la exposición al frío. El primero es el escalofrío, que genera calor al aumentar la fosforilación oxidativa mitocondrial y la glucólisis en el músculo para cubrir el trabajo físico realizado por la contracción muscular involuntaria. Por lo tanto, la exposición al frío aumentará el consumo de oxígeno en los músculos1. El segundo es la termogénesis no temblorosa, que se produce a través de un aumento en el consumo de oxígeno en los adipocitos marrón y beige (BA). La disipación de energía en calor en BA está mediada por la proteína de desacoplamiento mitocondrial 1 (UCP1), que permite la reentrada de protones en la matriz mitocondrial, disminuyendo el gradiente de protones mitocondriales. La disipación del gradiente de protones mitocondrial por UCP1 aumenta la producción de calor por la elevación en la transferencia de electrones y el consumo de oxígeno y la energía liberada por disipación de protones per se sin generar ATP (desacoplado). Además, el BA termogénico puede reclutar mecanismos adicionales que elevan el consumo de oxígeno sin causar una gran disipación en el gradiente de protones, activando ciclos inútiles de síntesis y consumo de ATP oxidativo. Las jaulas metabólicas descritas aquí, a saber, el sistema CLAMS-Oxymax de Columbus Instruments, ofrecen la posibilidad de medir el gasto de energía a diferentes temperaturas ambientales. Sin embargo, para determinar la capacidad termogénica de BA utilizando mediciones de consumo de oxígeno de todo el cuerpo, se necesita: (1) eliminar la contribución de los escalofríos y otros procesos metabólicos no BA al gasto de energía, y (2) activar específicamente la actividad termogénica de BA in vivo. Por lo tanto, un segundo protocolo describe cómo activar selectivamente ba in vivo utilizando farmacología en ratones anestesiados a termoneutralidad (30 ° C), con anestesia y termoneutralidad limitando otros procesos termogénicos no BA (es decir, actividad física). La estrategia farmacológica para activar el BA es tratar ratones con el agonista del receptor β3-adrenérgico CL-316,246. La razón es que la exposición al frío promueve una respuesta simpática liberando norepinefrina para activar los receptores β-adrenérgicos en BA, que activa la UCP1 y la oxidación de grasas. Además, la expresión del receptor β3-adrenérgico está altamente enriquecida en el tejido adiposo en ratones.

<table><tbody><tr><td>Sistema CLAMS-Oxymax</td><td>Columbus Instruments</td><td>Alimentador central CLAMS-ENC</td><td>Incluye carcasa ambiental y sensor de oxígeno de circonio</td></tr><tr><td>PC de escritorio con software Oxymax</td><td>HP/Columbus</td><td>N/A</td><td>PC debe comprarse por separado</td></tr><tr><td>Jarra de drierita (indicador de sulfato de calcio con cloruro de cobalto)</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-116681</td><td>Necesario para secar el gas que ingresa al sensor de oxígeno, la humedad puede dañar el sensor</td></tr><tr><td>RMN para la composición corporal</td><td>Echo-MRI</td><td>Echo-MRI 100</td><td>Mida la masa magra y grasa en ratones vivos. Es necesario para los análisis de ANCOVA.</td></tr><tr><td>CL-316-243</td><td>Sigma</td><td>C5976</td><td>Inyectado a los ratones por vía subcutánea para activar la termogénesis</td></tr><tr><td>Dieta alta en grasas</td><td>Dietas de investigación</td><td>D12266B</td><td>se proporcionan a los ratones antes y durante las mediciones</td></tr><tr><td>Pentobarbital/Nembutal</td><td>Farmacia en DLAM</td><td>N/A</td><td>Anestesia para los ratones</td></tr><tr><td>Gas primario de grado estándar (tanque y regulador)</td><td>Praxair</td><td>NI CD5000O6P-K/PRS 2012-2331-590</td><td>20,50% de oxígeno, 0,50% de CO2 equilibrado con nitrógeno utilizado para la calibración</td></tr></tbody></table>

determinación del gasto de energía basal y la capacidad de los adipocitos termogénicos para gastar energía en ratones obesos

Determining Basal Energy Expenditure and the Capacity of Thermogenic Adipocytes to Expend Energy in Obese Mice

Las mediciones del gasto de energía son necesarias para comprender cómo los cambios en el metabolismo pueden conducir a la obesidad. El gasto de energía basal se puede determinar en ratones midiendo el consumo de oxígeno de todo el cuerpo, la producción de CO2 y la actividad física utilizando jaulas metabólicas. Los adipocitos termogénicos de color marrón/beige (BA) contribuyen significativamente al gasto energético de los roedores, particularmente a bajas temperaturas ambientales. Aquí, las mediciones del gasto de energía basal y la capacidad total de BA para gastar energía en ratones obesos se describen en dos protocolos detallados: el primero explica cómo configurar el ensayo para medir el gasto de energía basal utilizando el análisis de covarianza (ANCOVA), un análisis necesario dado que el gasto de energía covaria con la masa corporal. El segundo protocolo describe cómo medir la capacidad de gasto de energía de BA in vivo en ratones. Este procedimiento implica anestesia, necesaria para limitar el gasto causado por la actividad física, seguido de la inyección del agonista beta3-adrenérgico, CL-316,243, que activa el gasto de energía en BA. Estos dos protocolos y sus limitaciones se describen con suficiente detalle para permitir un primer experimento exitoso.

La Figura 4 muestra los valores de ACTIVIDAD física VO2, VCO2, Producción de calor/Gasto de energía (EE), Relación de Intercambio Respiratorio (RER) y X, Y, Z obtenidos utilizando las jaulas metabólicas del sistema CLAMS. El VO2 y VCO2 proporcionados por el sistema CLAMS es el volumen de gas (ml) por minuto y ya se puede dividir por el peso corporal o los valores de masa magra ingresando estos valores de peso en el software CLAMS antes de comenzar ...

Este manuscrito describe un protocolo para medir la tasa metabólica basal y la capacidad oxidativa de los adipocitos termogénicos en ratones obesos.

Determinación del gasto de energía basal y la capacidad de los adipocitos termogénicos para gastar energía en ratones obesos

Energy expenditure measurements are necessary to understand how changes in metabolism can lead to obesity. Basal energy expenditure can be determined in ...

Este protocolo permite a un investigador determinar si existen diferencias en el equilibrio energético de los ratones, lo que puede ayudar a identificar los procesos fisiológicos responsables de un cambio en el peso corporal. También se puede utilizar para determinar la capacidad de la grasa marrón para gastar energía. Esta técnica cuantifica el oxígeno consumido y el CO2 producido por un ratón individual en un entorno controlado.Permite a los usuarios calcular el gasto de energía en este ratón individual y determinar si diferentes tratamientos o manipulaciones genéticas pueden cambiar el gasto de energía. Para comenzar, abra el software que controla el gabinete y el flujo de aire y deje que el software pruebe la comunicación de la computadora con el equipo. Una vez establecida la comunicación, haga clic en archivo, luego abra la configuración del experimento y seleccione la configuración del experimento prediseñada por el proveedor o configurada a partir de un ensayo anterior.A continuación, haga clic en experimento, luego haga clic en propiedades para abrir la ventana de propiedades del experimento. En la ventana de propiedades, configure los parámetros del recinto ambiental, incluida la temperatura ambiente y los ciclos de luz de 12 horas. Luego haga clic en experimento, seguido de configuración para abrir la ventana de configuración del experimento donde se definen los parámetros de cada jaula metabólica.A continuación, agregue una cantidad de comida prepesada a los comederos en las jaulas metabólicas que albergan ratones hembra de ocho semanas de edad. Además, coloque las botellas de agua y verifique que las botellas estén selladas correctamente y no tengan fugas. Después de 24 horas, pese la comida que queda en las jaulas y pese a los ratones.Dos o tres días después de que los ratones hayan sido alojados en el sistema, comience la calorimetría indirecta y las mediciones de actividad. Primero, calibre el detector a base de oxígeno y dióxido de carbono a base de circonia de los sistemas CLAMS utilizando un gas de calibración de composición conocida. Después de encender y asegurarse de que la presión de salida del tanque esté entre 5 y 10 libras por pulgada cuadrada, abra el software de utilidad de calibración para calibrar y probar los sensores de gas.Haga clic en experimentar, luego calibre y presione inicio. Espere a que se prueben los sensores y a que el software le pida al usuario que gire las perillas del sensor de gas hasta que el valor de la identidad del oxígeno sea uno. Haga clic en Siguiente cuando se complete el paso.Después de medir el peso corporal y la composición de los ratones, comience las mediciones de oxígeno, dióxido de carbono y actividad haciendo clic en el experimento y ejecute. Después de un mínimo de 48 horas, detenga el experimento haciendo clic en experimento y, a continuación, deténgalo. Para exportar los datos, haga clic en el archivo, luego exporte y exporte todos los temas como un archivo CSV.Durante la fase oscura, los ratones tienen un mayor consumo de oxígeno y producción de dióxido de carbono, y por lo tanto tienen un mayor gasto de energía. Los ratones con una dieta regular y un estado alimentado con ingestión de alimentos que ocurre en el ciclo oscuro se caracterizan por valores de relación de rango de intercambio respiratorio cercanos a uno, lo que indica una preferencia por usar carbohidratos. Durante el ciclo de luz, cuando los ratones duermen principalmente y, por lo tanto, rápido, hay un cambio a la oxidación de grasas con valores de RER más cercanos a 0.7.En consecuencia, la actividad física medida como recuentos de roturas de rayos láser XYZ aumenta durante la fase oscura y disminuye durante la fase de luz. La alimentación dietética alta en grasas aumenta el peso corporal y la masa grasa sin cambiar la masa magra. Los ratones alimentados con dieta alta en grasas comieron más kilocalorías por día, principalmente debido a una mayor densidad calórica por gramo de alimento.Sin embargo, la actividad física es similar entre el chow y los ratones alimentados con dieta alta en grasas, incluso durante el período oscuro. Los valores más bajos de relación de coeficiente respiratorio de los ratones alimentados con dieta alta en grasas indican una preferencia por usar grasa como sustrato primario para la oxidación. El consumo de oxígeno, pero no la producción de dióxido de carbono, aumenta en ratones alimentados con dieta alta en grasas, lo que resulta en un aumento significativo en el gasto de energía por ratón.El gasto de energía se incrementa con una inyección de agonistas beta-3, principalmente como resultado de la activación adrenérgica de los adipocitos termogénicos, lo que aumenta el consumo de oxígeno, la producción de dióxido de carbono y, por lo tanto, el gasto de energía en sí. Para medir el gasto de energía con la CLAMS, se debe completar la calibración y medir el peso corporal para realizar el análisis ANCOVA. Además, la ingesta de alimentos debe medirse tanto en el período de adaptación como durante las mediciones.El período de adaptación termina cuando los ratones recuperan la ingesta inicial de alimentos y el peso corporal. Este procedimiento también se puede utilizar para probar los efectos agudos de los medicamentos en la actividad y el comportamiento del ratón. También utilizamos este sistema en un estudio colaborativo que demostró qué población de neuronas controlaba Esta técnica es esencial para estudiar enfermedades relacionadas con el aumento de peso y para identificar procesos que controlan la preferencia de nutrientes, así como la actividad física, la termogénesis y el equilibrio energético.

determining-basal-energy-expenditure-capacity-thermogenic-adipocytes

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un método de obtención de imágenes funcionales de tejido de ratón adiposo marrón (BAT) se describe en frío que estimula la captación de 18F-fluorodeoxiglucosa (FDG) en la MTD es evaluar de forma no invasiva con un protocolo estandarizado micro-PET/CT. Este método es robusto y sensible para detectar diferencias en las actividades de BAT en modelos de ratón.

Imagen funcional de grasa marrón en ratones con FDG micro-PET/CT

El método presentado aquí utiliza 18 F-fluorodesoxiglucosa (18F-FDG) tomografía por emisión de positrones / tomografía computarizada (PET-TC) y la resonancia magnética separada grasa-agua (MRI), cada escaneado tras 2 horas de exposición a temperatura neutra (24 ° C ) y las condiciones de frío (17 ° C) para mapear el tejido adiposo marrón (BAT) en sujetos humanos adultos.

Depósitos de tejido adiposo humano Marrón segmentada automáticamente por Tomografía por Emisión de Positrones / Tomografía Computada y Resonancia Registrado Imágenes Magnéticas

Este protocolo describe el método para determinar la lipólisis basal y estimulada por forskolina en almohadillas de grasa inguinal obtenidas de dieta normal de chow (NCD) o dieta con alto contenido de grasa (HFD) ± capsaicina alimentada con ratones de tipo salvaje. Como índice para la lipólisis, la liberación de glicerol se midió a partir de almohadillas de grasa adiposa inguinal.

Medición de la lipólisis estimulada por Basal y Forskolin en las almohadillas de grasa adiposa inguinal

Este protocolo describe el uso de un analizador de composición corporal y el sistema metabólico de control animal para caracterizar la composición corporal y parámetros metabólicos en ratones. Un modelo de obesidad inducido por la alimentación alta en grasas se utiliza como un ejemplo para la aplicación de estas técnicas.

Composición corporal y análisis jaulas metabólico en ratones de reserva grasa alta

La diferenciación de los adipocitos blancos y beiges de tejido adiposo vascular progenitores tiene potencial para mejoramiento metabólico en obesidad. Se describen los protocolos para un CD34 + CD31 + aislamiento de células endoteliales de la grasa humana y un posterior en vitro expansión y diferenciación a adipocitos blancos y beiges. Se discuten varias aplicaciones posteriores.

Aislamiento, expansión y Adipogenic inducción de CD31 + CD34 + células endoteliales del humano omentales y subcutáneos de tejido adiposo

Este documento proporciona tres ensayos fáciles y accesibles para evaluar el metabolismo de los lípidos en ratones.

Evaluación de la capacidad de manejo de lípidos de todo el cuerpo en ratones

Imágenes funcionales y cuantificación de depósitos adiposos termogénicos en ratones utilizando un enfoque basado en imágenes micro-PET / MR.

Visualización y cuantificación de tejidos adiposos marrones y beige en ratones utilizando [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar la importancia fisiológica del impacto de la actividad del tejido adiposo marrón (BAT) en el metabolismo humano. Esto se logra combinando la carga de carbohidratos y la calorimetría indirecta con mediciones de cambios supraclaviculares en la temperatura. Este nuevo enfoque puede ayudar a desarrollar un objetivo farmacológico para la termogénesis BAT en humanos.

Uso de una combinación de calorimetría indirecta, termografía infrarroja y niveles de glucosa en sangre para medir la termogénesis del tejido adiposo marrón en humanos

Aquí, presentamos un protocolo para medir la actividad del tejido adiposo marrón después de una comida en humanos y animales de laboratorio.

Termografía infrarroja para la detección de cambios en la actividad del tejido adiposo marrón

En este protocolo, se describen los métodos relevantes para la metabolómica arteriovenosa optimizada para BAT utilizando GC-MS en un modelo de ratón. Estos métodos permiten la adquisición de información valiosa sobre el intercambio de metabolitos mediado por MTD a nivel de organismo.

Metabolómica arteriovenosa para medir el intercambio de metabolitos in vivo en tejido adiposo marrón

Aquí presentamos un protocolo de trasplante de tejido adiposo blanco y marrón que ofrece una estrategia prometedora para revertir la subfertilidad, la obesidad y la hiperglucemia, al tiempo que mejora la función renal en ratones BTBR diabéticos y obesos.

Injertos adiposos blancos y marrones: un enfoque para corregir los déficits reproductivos, metabólicos y renales en ratones obesos negros y tostados (BTBR)

Aprende a medir el gasto energético basal y la capacidad oxidativa de adipocitos termogénicos en ratones obesos mediante calorimetría indirecta. Este protocolo permite evaluar el balance energético y su relación con cambios de peso corporal.

Determinación del gasto de energía basal y la capacidad de los adipocitos termogénicos para gastar energía en ratones obesos

Explorar más videos