Name: In situ Visualización del crecimiento de axones y la dinámica de los conos de crecimiento en cultivos agudos de cortes cerebrales embrionarios ex vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprende a visualizar el crecimiento de axones y la dinámica de conos de crecimiento en cortes agudos de cerebro embrionario de ratón mediante electroporación e imagen de alta resolución.

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Nos gustaría agradecer a Maria Eugenia Bernis por fotografiar los procedimientos. También agradecemos a Emily Burnside, Emily Handley, Thorben Pietralla, Max Schelski y Sina Stern por leer y discutir el manuscrito. Estamos agradecidos a nuestros destacados asistentes técnicos, Jessica Gonyer, Blanca Randel y Anh-Tuan Pham. Reconocemos el valioso apoyo de la instalación de microscopio de luz y la instalación de animales de DZNE. Este trabajo fue apoyado por Deutsche Forschungsgesellschaft (DFG), la Fundación Internacional para la Investigación en Paraplejia (IRP) y Wings for Life (a F.B). F.B. es miembro del clúster de excelencia ImmunoSensation2, los SFB 1089 y 1158, y ha recibido el Premio Roger De Spoelberch.

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<li>Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+neurons+arise+in+symmetric+and+asymmetric+division+zones+and+migrate+through+specific+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases.</a> Nature Neuroscience. 7 (2), 136-144 (2004).</li>
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<li>Rigby, M. J., Gomez, T. M., Puglielli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell-axonal+growth+cone+interactions+in+neurodevelopment+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial cell-axonal growth cone interactions in neurodevelopment and regeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 203(2020).</li>
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<li>Multiphoton Microscope Leica TCS SP8 MP. Microsystems. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/">http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/</a> (2021).</li>
<li>ZEISS Lattice Lightsheet 7. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html">http://www.zeiss.com/microscopy/int/products/imaging-systems/lattice-lightsheet-7.html</a> (2021).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La forma en que los conos de crecimiento perciben y reaccionan a su entorno circundante para coordinar la extensión y la guía simultáneas del axón sigue siendo un tema de debate 3,18. Los estudios pioneros en sustratos 2D proporcionaron una visión de los mecanismos moleculares fundamentales que generan las fuerzas que impulsan la dinámica del cono de crecimiento durante la formación de axones, el crecimiento y la navegación 2,10,11,12,19. Más recientemente, estudios en matrices 3D revelaron cuánta influencia tiene una tercera dimensión en el comportamiento del cono de crecimiento y, en consecuencia, en el crecimiento del axón 8,9. Sin embargo, los intrincados mecanismos que instruyen la dinámica del cono de crecimiento in vivo aún no se han examinado a fondo.
La preparación de cultivos organotípicos de corte de cerebros IUE o EUE es ampliamente utilizada y bien documentada. Se ha convertido en un estándar de oro que permite a los científicos obtener información sobre el desarrollo y el comportamiento de las neuronas en el tejido cerebral vivo20,21. De hecho, esta técnica se ha utilizado con éxito en combinación con varias técnicas de imagen de alta resolución para visualizar procesos moleculares específicos y eventos morfológicos in situ. Dichos estudios incluyen, pero no se limitan a la formación y extensión de axones19,22, la migración neuronal cortical 19,22,23,24, la dinámica del centrosoma 25,26, la dinámica de microtúbulos27, así como la dinámica funcional de los compartimentos pre y postsinápticos28,29.
Este protocolo aborda una brecha en la neurobiología experimental, visualizando la dinámica del cono de crecimiento del desarrollo de neuronas corticales in situ, en cultivos de cortes cerebrales agudos ex vivo y las herramientas para analizar los datos obtenidos.
Se utilizaron cultivos agudos de corte cerebral para establecer este protocolo porque (1) con algo de práctica, son fáciles de generar; (2) presentar un sistema accesible para estudiar los conos de crecimiento incrustados en un entorno cuasi-totalmente fisiológico, pero lo suficientemente transparente como para permitir imágenes de células vivas de alta resolución; (3) se puede ampliar para su uso con una miríada de líneas de ratones transgénicos; (4) combinado con IUE o EUE, proporcionan un potencial prácticamente ilimitado para entregar herramientas moleculares para evaluar el rendimiento de los conos de crecimiento y los axones in vivo bajo regímenes de pérdida/ganancia de función, junto con reporteros fluorescentes y sondas de citoesqueleto.
Esta metodología se describió en el contexto tanto de la EUE como de la IUE. Aunque sigue siendo un método altamente confiable, eue resultó en una mayor incidencia de cortes cerebrales que muestran una red RG desorganizada en comparación con las obtenidas con IUE como método de administración (Figura 4C). Las alteraciones en la matriz RG afectan fuertemente la migración neuronal y el patrón de elongación del axón30,31. Estos son parámetros clave que predicen dónde encontrar axones para el análisis en un momento dado y el tipo de entorno en el que están navegando. Las rebanadas cerebrales con una red RG significativamente interrumpida generalmente tienen una estratificación de neuronas corticales deteriorada. Esto, a su vez, produce axones con trayectorias caóticas. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente controlar la integridad estructural de la red RG. Curiosamente, la mala integridad estructural se correlaciona con el aumento de la edad del cerebro embrionario. De hecho, tales efectos en embriones E12.5-E13.5 más jóvenes generalmente no se observaron19.
El presente protocolo es exhaustivo y sencillo. Sin embargo, hay algunos pasos críticos en los que se debe tener especial cuidado y atención para obtener resultados óptimos. Estos se han señalado expresamente en el protocolo e incluyen (1) ajustar la cantidad de ADN utilizado en la electroporación para obtener un etiquetado escaso; (2) evitar daños durante la extracción de cerebros; (3) controlar la temperatura de la agarosa durante la envoltura cerebral; (4) solución de problemas del porcentaje ideal de agarosa para cerebros de una edad determinada; y (5) selección de fluoróforos, cuya experiencia sigue. Durante la optimización del protocolo, se probó el rendimiento de varios fluoróforos en imágenes in situ de células vivas. Para este protocolo se eligieron variantes monoméricas GFP EGFP y NeonGreen para la preparación de los plásmidos marcados con LifeAct y Lyn (Figura 5A, B). Además, la variante RFP mScarlet se probó y se encontró muy adecuada para esta configuración (datos no mostrados). También se probaron tRFP multimérica (dímero) y ZsGreen (tetrámero) (Figura 5C y Video complementario 1, derecha). Estos fluoróforos súper brillantes de plegamiento rápido se recomiendan cuando el método requiere una rápida generación de señal fluorescente después de la entrega de ADN.
Una práctica común en el uso de cultivos de rebanadas es utilizar rebanadas de diferentes cerebros para probar el control y las condiciones experimentales. Esto representa una fuente inherente de variabilidad no deseada. Aquí, se utilizó un sistema de expresión que permite la modificación independiente de las neuronas vecinas y la expresión de los reporteros para la identificación. Nótese que en esta demostración (Figura 5C), no hubo diferencias entre las neuronas que expresan ninguno de los fluoróforos. Sin embargo, como ejemplo, tal mezcla de plásmidos combinada con una línea de ratón transgénico que alberga un gen sensible a Cre etiquetará con neuronas tRFP (sensibles a Dre) que permanecieron como de tipo salvaje. En contraste, el ZsGreen (también sensible a Cre) etiquetará las neuronas recombinadas. Por lo tanto, los conos de crecimiento de los dos genotipos diferentes, y probablemente también los fenotipos, podrían estudiarse uno al lado del otro simultáneamente en la misma rebanada cerebral.
La localización de axones y conos de crecimiento para el análisis es una consideración importante. Las neuronas corticales se polarizan mientras migran radialmente desde la zona ventricular (VZ) hacia la placa cortical (CP). Durante este proceso, las neuronas forman un proceso líder (una dendrita futura) y un proceso de arrastre que se convertirá en el axón, uniéndose eventualmente a los axones pioneros en la zona intermedia (IZ), estableciendo tractos axónicos32. Por lo tanto, para capturar los conos de crecimiento axonal, se realizaron imágenes sobre fibras axonales en la IZ, incluidos los axones que salen de la CP y los axones generados tempranamente ya asociados con haces axonales; o eventualmente, en fibras que atraviesan la IZ y se extienden por debajo de ella (Figura 7).
Este protocolo hace que sea factible realizar imágenes de superresolución de neuronas dentro de cortes organotípicos. Históricamente, la dispersión de la luz era un problema importante que se enfrentaba al obtener imágenes de especímenes gruesos. En las últimas dos décadas, los amplios avances en tecnologías ópticas hicieron posible la obtención de imágenes de especímenes gruesos. Aquí, se utilizó un objetivo de larga distancia de trabajo para visualizar mejor las estructuras más pequeñas, como los conos de crecimiento. Inevitablemente, este protocolo no captura eventos más detallados como el flujo retrógrado de actina o la dinámica de microtúbulos. El objetivo de larga distancia de trabajo, que requiere una apertura numérica (NA) más baja, conserva la información de cortes gruesos. Sin embargo, también fue posible adaptar este protocolo para su uso con objetivos de menor distancia de trabajo. Esto requirió una transferencia suave de rebanadas a un plato con fondo de vidrio para preservar la integridad estructural. Sin embargo, el uso de este método resultó en una supervivencia más corta- ~ 15 h- debido a la pérdida de intercambio de gases (datos no mostrados). A diferencia de los cultivos 2D, los conos de crecimiento en 3D ocupan un volumen mayor y requieren compensación de movimiento-artefacto en el eje z. Para aumentar la capacidad de obtener imágenes de eventos detallados, se debe utilizar la tecnología confocal moderna. Por lo tanto, se recomienda utilizar un motor z-stack de escaneo rápido, como el z-Galvo disponible en microscopios confocales altamente sensibles33.
Cabe destacar que este protocolo presenta tres limitaciones principales. En primer lugar, a menudo es difícil controlar los niveles de expresión / número de células que expresan de cualquier plásmido dado in vivo. Esto introduce variabilidad entre todas las rodajas incluso cuando se mantiene la misma concentración de plásmidos. Por lo tanto, la selección de los elementos reguladores en los vectores de expresión utilizados debe estar predeterminada con cuidado. En segundo lugar, la obtención de imágenes de eventos detallados utilizando insertos de membrana actualmente no es factible. Esta segunda limitación podrá superarse con las actualizaciones metodológicas propuestas en el párrafo anterior. Por último, los conos de crecimiento son altamente fotosensibles y pueden ser rápidamente fotoblanqueados. Por lo tanto, las imágenes frecuentes de los conos de crecimiento, durante tan solo 5 minutos utilizando microscopios de escaneo láser, a menudo pueden colapsar los conos de crecimiento. En este sentido, los nuevos avances en los dispositivos generados por microscopía de láminas de luz se pueden adaptar para la obtención de imágenes a largo plazo de las rebanadas cerebrales34.
Se prevén protocolos similares para abrir nuevas vías de investigación, permitiendo una mejor comprensión de lo que se necesita para que un cono de crecimiento lea y reaccione hacia un entorno in vivo complejo y, lo que es más importante, para desentrañar la mecánica de esta sofisticada interacción.

Las neuronas son células altamente polarizadas que representan la unidad computacional básica en el sistema nervioso. Reciben y emiten información que se basa en la compartimentación de los sitios de entrada y salida: dendritas y axones, respectivamente1. Durante el desarrollo, los axones se extienden mientras navegan por un entorno complejo increíble para llegar a su destino. La navegación del axón está guiada por el cono de crecimiento, una estructura sensorial ubicada en la punta del axón en desarrollo. El cono de crecimiento es responsable de detectar señales ambientales y traducirlas en la reorganización espacial dinámica de su citoesqueleto 2,3. Las reacciones morfomecánicas resultantes instruyen al cono de crecimiento para que se extienda o se retraiga de la señal desencadenante, lo que lleva a maniobras específicas del axón.
La comprensión actual de la extensión del axón y la dinámica del cono de crecimiento se deriva de estudios que evalúan el crecimiento del axón sobre sustratos bidimensionales (2D) 2,4,5,6,7. Estos estudios pioneros identificaron una interacción sofisticada entre los conos de crecimiento y los sustratos de crecimiento y revelaron diferencias sorprendentes dependiendo de las características del sustrato, como la adhesividad y la rigidez 8,9. Liderados por estos conocimientos, se planteó la hipótesis de que las señales ambientales extracelulares dictaban el crecimiento del axón, con el citoesqueleto del cono de crecimiento ejecutando este crecimiento 2,10,11,12. En particular, las neuronas pueden extender axones en sustratos no adhesivos (por ejemplo, polilisina, poliornitina)13. Además, la rigidez del sustrato puede influir en la tasa de crecimiento del axón independientemente de los complejos adhesivos celulares8. Por lo tanto, el estudio de la dinámica de los conos de crecimiento en sustratos 2D por sí solo no puede modelar con precisión el equilibrio de fuerzas que surgen de la interacción de los conos de crecimiento axonal con entornos tridimensionales (3D) fisiológicamente relevantes, como los que se encuentran in vivo.
Para superar las limitaciones de los ensayos 2D, se ha estudiado el crecimiento del axón y la dinámica del cono de crecimiento en matrices 3D 8,9. Estas matrices plantean un contexto más fisiológico pero permiten estudiar los mecanismos intrínsecos celulares del crecimiento del axón. Permite el examen del cono de crecimiento de una sola célula en una variedad de condiciones y tratamientos farmacológicos9. En tales entornos 3D, los axones mostraron una dinámica citoesquelética distinta y crecieron más rápido que los observados en neuronas cultivadas en 2D9. Estos elegantes estudios demostraron la influencia de una dimensión extra en la reorganización del citoesqueleto del cono de crecimiento y, en consecuencia, en su comportamiento.
A pesar de las aparentes ventajas presentadas por las matrices 3D sobre las superficies 2D para apoyar el desarrollo neuronal nativo y el crecimiento de los axones, siguen siendo un andamio sintético simplificado que no puede reflejar la complejidad de la dinámica observada en el tejido del sistema nervioso central (SNC). Aquí, la administración de plásmidos reporteros por electroporación ex utero e in utero se combinó con cultivo de rebanadas organotípicas cerebrales e imágenes de superresolución en vivo in situ para analizar la dinámica del cono de crecimiento dentro de un contexto fisiológico. Esta metodología permite visualizar los axones en desarrollo mientras se experimenta la 3-dimensionalidad de los ambientes in vivo y la complejidad de su composición fisicoquímica. Por último, se describen procedimientos fáciles de usar para medir el crecimiento del axón y la dinámica del cono de crecimiento utilizando software comúnmente licenciado y disponible públicamente.

<table><tbody><tr><td>Pinzas Adson</td><td>Fine Science Tools</td><td>11006-12</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>Cabra Anti-Ratón</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td>Cabra Anti-Ratón Anticuerpo</td></tr><tr><td>Anti-Vimentina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2258-.2ML</td><td>Ratón monoclonal, clon LN-6, líquido de ascitis</td></tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td>17504044</tr><tr><td>Betadine</td><td>B. Braun 3864154</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biozym Sieve GP Agarose</td><td>Biozyme</td><td>850080</td><td></td></tr><tr><td>Braunol, Spr&uuml; hflasche</td><td>B. Braun</td><td>3864073</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina (Temgesic)</td><td>GEHE Pharma</td><td>345928</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DMZ unevirsal extractor de electrodos</td><td>Zeitz</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Maquinilla de afeitar eléctrica</td><td>Andes</td><td>NA</td><td>ProClip UltraEdge Super 2 velocidades</td></tr><tr><td>modelo Enrofloxacina (Baytril)</td><td>Bayer</td><td>3543238</td><td>2,5% (peso/vol)</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de microcargador Eppendorf</td><td>FischerScientific</td><td>10289651</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td>Contenido de colorante &ge; 85 %</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Fiji 2.1.0</td><td>NIH</td><td>NA</td><td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td></tr><tr><td>Tijeras finas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>14058-09</td><td>ToughCut/Recto/9cm</td></tr><tr><td>FluoroDish Plato de cultivo celular</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD5040-100</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount Medio de montaje acuoso</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>MedPex</td><td>3705391</td><td>5%</td></tr><tr><td>GlutaMAX Suplemento</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td>calcio, magnesio, rojo sin fenol</td></tr><tr><td>Suero de caballo</td><td>Pan-Biotech</td><td>P30-0711</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 9.7.2</td><td>Bitplane</td><td>NA</td><td>https://imaris.oxinst.com/products/imaris-for-neuroscientists</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Virbac</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Suero salino isotónico solución</td><td>B. Braun</td><td>8609261</td><td>0.90%</td></tr><tr><td>Leica VT1200 S vibratomo</td><td>Leica</td><td>14048142066</td><td></td></tr><tr><td>LSM 880 con Airyscan</td><td>Zeiss</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Metacam</td><td>Venusberg Apotheke</td><td>8890217</td><td>5 mg/ml</td></tr><tr><td>Ratones</td><td>Janvier Labs</td><td>NA</td><td>C57BL/6JRj</td></tr><tr><td>Pinzas Micro-Adson</td><td>Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Tarro de almacenamiento de micropipetas</td><td>World Precision Instruments</td><td>E210</td><td>&nbsp; 16.16.27</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td>https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/p/excel/cfq7ttc0k7dx?activetab=pivot:overviewtab</td></tr><tr><td>Inserto de cultivo celular Millicell EMD</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td>30&nbsp; mm, PTFE hidrófilo, 0,4 y nbsp; y micro; m</td></tr><tr><td>Moria Cucharas Perforadas</td><td>Herramientas de Ciencia Fina</td><td>10370-18</td><td></td></tr><tr><td>Cuchara Moria</td><td>Herramientas de Ciencia Fina</td><td>10321-08</td><td></td></tr><tr><td>Medio Neurobasal, sin rojo de fenol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12348017</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento Neuropan-2</td><td>Pan-Biotech</td><td>P07-11010</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Abcam</td><td>ab138478</td><td></td></tr><tr><td>Portaagujas Olsen-Hegar con tijeras</td><td>Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-alpha-1-Dre</td><td>Addgene</td><td>133925</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-alpha-1-iCre</td><td>Addgene</td><td>133924</td><td></td></tr><tr><td>p-Tub-alpha-1-LifeAct-GFP</td><td>Addgene</td><td>175437</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td><td>Addgene</td><td>175438</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td><td>Addgene</td><td>175257</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PicoNozzle Kit v2</td><td>Instrumentos de</td> <td>precisión mundial5430-ALL</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de platino</td><td>Harvard Aparato</td><td>45-0487</td><td>1 mm / 3 mm</td></tr><tr><td>QIAGEN Maxi kit</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Cierre de herida reflex Clip</td><td>World Precision Instruments</td><td>500344-10</td><td>7 mm</td></tr><tr><td>Sekundenkleber Pattex Mini Trio</td><td>Lyreco</td><td>4722659</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de electroporación de onda cuadrada ECM830</td><td>Harvard Aparato</td><td>W3 45-0052</td><td></td></tr><tr><td>Gasa estéril</td><td>Braun Askina</td><td>9031216</td><td></td></tr><tr><td>Ungüento oftálmico lubricante estéril</td><td>Bayer Vital</td><td>PZN1578675</td><td></td></tr><tr><td>Guantes quirúrgicos estériles</td><td>Sempermed</td><td>14C0451</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Roth</td><td>4621.2</td><td></td></tr><tr><td>Supramid 5-0 suturas de seda quirúrgica</td><td>B. Braun</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de pared delgada</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Vannas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Slide 8 Well Fondo de vidrio</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr></tbody></table>

in situ visualización del crecimiento de axones y la dinámica de los conos de crecimiento en cultivos agudos de cortes cerebrales embrionarios ex vivo

In Situ Visualization of Axon Growth and Growth Cone Dynamics in Acute Ex Vivo Embryonic Brain Slice Cultures

Durante el desarrollo neuronal, los axones navegan por el entorno cortical para llegar a sus destinos finales y establecer conexiones sinápticas. Los conos de crecimiento -las estructuras sensoriales ubicadas en las puntas distales de los axones en desarrollo- ejecutan este proceso. El estudio de la estructura y la dinámica del cono de crecimiento es crucial para comprender el desarrollo axonal y las interacciones con el sistema nervioso central (SNC) circundante que le permiten formar circuitos neuronales. Esto es esencial cuando se idean métodos para reintegrar los axones en los circuitos neuronales después de una lesión en la investigación fundamental y en contextos preclínicos. Hasta ahora, la comprensión general de la dinámica de los conos de crecimiento se basa principalmente en estudios de neuronas cultivadas en dos dimensiones (2D). Aunque indudablemente fundamentales para el conocimiento actual de la dinámica estructural del cono de crecimiento y la respuesta a los estímulos, los estudios 2D tergiversan el entorno fisiológico tridimensional (3D) encontrado por los conos de crecimiento neuronal en el tejido intacto del SNC. Más recientemente, se emplearon geles de colágeno para superar algunas de estas limitaciones, lo que permitió la investigación del desarrollo neuronal en 3D. Sin embargo, tanto los entornos sintéticos 2D como los 3D carecen de señales de señalización dentro del tejido del SNC, que dirigen la extensión y la búsqueda de rutas de los axones en desarrollo. Este protocolo proporciona un método para estudiar axones y conos de crecimiento utilizando cortes cerebrales organotípicos, donde los axones en desarrollo encuentran señales físicas y químicas fisiológicamente relevantes. Al combinar electroporación afinada en el útero y ex útero para entregar escasamente reporteros fluorescentes junto con microscopía de superresolución, este protocolo presenta una tubería metodológica para la visualización de la dinámica del axón y el cono de crecimiento in situ. Además, se incluye una descripción detallada del conjunto de herramientas del análisis de datos de imágenes a largo plazo y de células vivas.

Se muestran los resultados representativos obtenidos con el flujo de trabajo del método descrito. En la presente demostración se utilizaron ratones E15.5, aunque este protocolo es fácilmente adaptable a prácticamente todas las edades embrionarias que van desde E11 hasta finales de E17. En este protocolo, ya sea electroporación ex utero (EUE; Figura 2A, 2C-I) o electroporación in utero (IUE; Figuras 2B, C y 2J-Q) se utilizaron para administrar plásmidos en las neuronas progenitoras que recubren los ventrículos laterales. Estos progenitores son la fuente de futuras neuronas proyectantes corticales (CPN)15,16. Se prepararon mezclas de plásmidos para impulsar la expresión dispersa específica de neuronas de mNeonGreen (Figura 1A) dirigida a la membrana (Lyn)-mNeonGreen (Figura 1A) o mejorada por LifeAct (E) GFP (Figura 1B) para evaluar el comportamiento general y la dinámica de la actina en los conos de crecimiento, respectivamente. Además, se incluyó una mezcla de plásmidos destinada a etiquetar neuronas individuales con turbo(t)-RFP o zoanthus sp. (Zs) proteína fluorescente verde (ZsGreen) (Figura 1C). Esto facilita el monitoreo del comportamiento del cono de crecimiento de las neuronas vecinas independientes.
La disección cerebral a partir de embriones electroporados es un paso crucial que debe realizarse cuidadosamente para obtener rebanadas de alta calidad, preservando la estructura cerebral nativa. Los instrumentos de disección y el vibratomo se prepararon de antemano y se esterilizaron cuidadosamente con etanol (Figura 3A, B). A continuación, se diseccionaron cuidadosamente las cabezas de los embriones electroporados y se extrajeron los cerebros. Aquí, se muestra la disección representativa de cerebros de los embriones sometidos a EUE en E15 (Figura 3C-F) y E12.5 (Figura 3G-J). Los cerebros se encierran inmediatamente en una matriz de agarosa, se cortan en rodajas y se colocan en insertos de membrana de PTFE dentro de un plato de vidrio inferior para la incubación (Figura 3K-M).
El estado de salud de las rebanadas cerebrales es un punto importante para el control para garantizar resultados confiables. Diariamente se realizaba una inspección visual para detectar cualquier contaminación. Además, una vez finalizado el cultivo, las rebanadas cerebrales se fijan y se someten a inmunohistoquímica. Aquí,4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) se utilizó para controlar la organización celular general y la tinción de vimentina para revelar la organización glial; en particular, andamio de glía radial (RG). Por lo general, las rebanadas cerebrales cultivadas con éxito derivadas de IUE o EUE muestran una distribución celular normal según lo revelado por DAPI y una matriz algo organizada de RG con procesos de contacto pial orientados apicalmente17 (Figura 4A, B respectivamente). Ocasionalmente, se observan marcadas alteraciones en el andamiaje RG en cortes cerebrales cultivados, especialmente en los derivados de la electroporación EUE (Figura 4C). Las rebanadas cerebrales con andamio RG extremadamente desorganizado muestran una migración neuronal deteriorada y un crecimiento defectuoso del axón (no se muestra). Por lo tanto, controlar el andamio RG es un método fácil después del cultivo para clasificar los datos obtenidos de cortes cerebrales confiables.
Las rebanadas cerebrales derivadas de IUE o EUE con una mezcla de plásmidos que expresan Lyn-mNeonGreen dan como resultado un etiquetado de neuronas disperso similar. Como ejemplo se muestra un CPN piramidal representativo que expresa Lyn-mNeonGreen y el comportamiento dinámico de su cono de crecimiento (Figura 5A y Video Suplementario 1, arriba a la izquierda). Además, las neuronas se etiquetaron utilizando un plásmido que expresa una sonda de actina para analizar la dinámica de la actina de los conos de crecimiento axonal in situ (Figura 5B y Video complementario 1, abajo a la izquierda). También se realizaron experimentos in situ con un diseño de plásmido que expresa fluoróforos de doble Cre/Dre (Figura 1C y Video Complementario 1, derecha). Los fluoróforos tRFP o ZsGreen en este plásmido podrían activarse específica e individualmente por recombinasas Dre o Cre, respectivamente, en neuronas vecinas (Figura 5C). Esta línea experimental permite el análisis lado a lado de los conos de crecimiento de las neuronas de control con neuronas modificadas vecinas (cualquier pérdida o ganancia de función dada). Esto evita la variabilidad que surge del uso de diferentes cortes para probar las condiciones de control y experimentales.
Se analizaron los kymógrafos generados a partir de la película grabada, a partir de los cuales se pueden obtener fácilmente parámetros de crecimiento dinámico como la actividad protuberante a lo largo del tiempo y la longitud del crecimiento (Figura 6A). Tenga en cuenta que un simple ajuste en la resolución temporal del lapso de tiempo permite medir la velocidad de elongación del axón durante 2 h (Figura 6A). Además, la variación del volumen del cono de crecimiento a lo largo del tiempo, una medida de la actividad dinámica del cono de crecimiento general, se puede obtener fácilmente, en este caso con software con licencia (Figura 6B y Figura 6E, F). Esto se puede utilizar para evaluar la velocidad de la cinta de correr con actina y el equilibrio de filopodia / lamellipodia durante la actividad de exploración del cono de crecimiento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig01.jpg"> Figura 1: Esquemas de los plásmidos utilizados en el protocolo. (A) pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen. (B) p-Tub-alfa-1-LifeAct-GFP. (C) pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-pA-lox-ZsGreen-pA. La información relevante sobre los componentes del plásmido y el origen del fluoróforo se encuentra en las cajas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig02.jpg"> Figura 2: Flujo de trabajo de electroporación ex utero e in utero de ratones E15.5. (A) Instalación de una estación de cirugía para la electroporación ex utero. (B) Instalación de una estación de cirugía para la electroporación in utero. (C) Cuernos uterinos tirados fuera de la cavidad abdominal del ratón anestesiado. (D) Extracción de un embrión del saco uterino. (E) Sacrificio de embriones por transección completa de la médula espinal a través de una incisión diagonal; nótese que se evitó la decapitación. (F) Colocación del embrión en el soporte e inyectado con mezcla de ADN/Fast Green en el ventrículo lateral izquierdo. (G,H) Coloque la cabeza del embrión entre los electrodos de pinza de platino con el cátodo (flecha roja) sobre la corteza en un ángulo de 60°. (I) Colocación de los brazos del embrión (flechas negras) fuera del soporte para evitar el deslizamiento del embrión durante el procedimiento. (J) Rotación del embrión dentro del saco uterino para exponer la cabeza. (K,L) Inyección de la mezcla de ADN/Fast Green en los ventrículos laterales del embrión a través de la pared uterina. (M) Coloque la cabeza del embrión entre los electrodos de pinza de platino con un cátodo (flecha roja) sobre la corteza en un ángulo de 60 °. (N) Incisión muscular suturada a través de la sutura de bloqueo de carrera. (O) Incisión en la piel suturada a través de una sutura interrumpida. (P) Aseguramiento de la herida con clips quirúrgicos para heridas y desinfección con betadina. (Q) Colocación del ratón en la jaula de recuperación con luz de calentamiento infrarroja lejana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig03.jpg"> Figura 3: Extracción de cerebros E15.5 y E12.5 y procedimiento de cultivo organotípico de rebanadas. (A) Herramientas utilizadas para el procedimiento de extracción cerebral. B) Instalación de una estación de cultivo organotípico. (C-F) Extracción de E15.5 cerebral. (G-J) Extracción de E12.5 cerebral. Las líneas punteadas resaltan la ubicación de las incisiones. Las flechas rojas señalan la dirección de tirar con fórceps. (K) Incrustar el cerebro en un plato de 3 cm que contiene 3% de agarosa de fusión baja, dejando un espacio de espaciamiento de agarosa de 1-2 mm debajo del cerebro. (L) Colección de rebanada de cerebro de 150 μm. (M) Colocación de rodajas cerebrales en insertos de membrana de PTFE inmovilizados en un plato de 35 mm utilizando película de parafina (flecha azul). La marca de estrella roja indica una colección dada de corte cerebral del vibratomo (L) y su transferencia a la membrana de PTFE (M). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig04.jpg"> Figura 4: Estructura de células gliales radiales conservadas en rodajas organotípicas sanas. Imágenes confocales de cortes cerebrales E17.5 que revelan la matriz RG (vimentina; verde) y la organización celular general (DAPI; magenta) después de IUE (A) y EUE (B, C). Tenga en cuenta las fuertes perturbaciones en la matriz RG que ocasionalmente pueden resultar de EUE (C). Los aumentos corresponden a los marcos punteados rojos en la figura principal: barras de escala, 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig05.jpg"> Figura 5: Visualización in situ de la dinámica del cono de crecimiento en rodajas organotípicas agudas. (A,B) Neuronas y sus correspondientes conos de crecimiento marcados con Lyn-mNeonGreen y LifeAct-GFP, respectivamente. Estrella roja que marca el cono de crecimiento de la neurona que expresa Lyn-mNeonGreen. Asterisco azul que marca el cono de crecimiento de la neurona que expresa LifeAct-GFP. (C) Neuronas vecinas marcadas con el sistema de plásmidos duales que contiene tRFP (magenta) y ZsGreen (verde) y sus correspondientes conos de crecimiento. Los conos de crecimiento fotografiados (derecha) estaban fuera del marco capturado (izquierda), obtenidos poco después de adquirir el lapso de tiempo del cono de crecimiento; barras de escala, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2.jpg"> Figura 6: Análisis de la velocidad de crecimiento del axón y el volumen del cono de crecimiento. (A) Trazado de axones en una neurona que expresa Lyn-mNeonGreen (arriba) y su correspondiente kymograph (abajo) generado utilizando ImageJ. (B) Reconstrucción del video z-stack del cono de crecimiento utilizando el software de análisis de imágenes (arriba) y el mismo cono de crecimiento resaltado utilizando la herramienta de medición de superficies (abajo). (C) Gráficos que muestran los cambios en la velocidad de crecimiento a lo largo del tiempo para varios axones. (D) La velocidad media de crecimiento de los axones se cuantifica en (C). (E) Gráfico que muestra los cambios en el volumen del cono de crecimiento a lo largo del tiempo. F) El volumen medio de los conos de crecimiento se cuantifica en (E); barra de escala, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig6v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63068/63068fig07.jpg"> Figura 7: Migración radial y polarización neuronal de neuronas corticales piramidales. Diagrama que ilustra el desarrollo de neuronas corticales piramidales (rosa) que migran radialmente desde la zona ventricular germinal (VZ) hacia la superficie pia. Guiados por procesos de glía radial (gris), las neuronas polarizadas migratorias establecen un proceso líder, la dendrita futura, y el proceso de arrastre, el axón futuro, que continúan extendiéndose hacia abajo hacia la zona intermedia (IZ). Las cajas rojas discontinuas representan las áreas corticales donde se tomaron imágenes de los conos de crecimiento. Específicamente en la IZ, zona subventricular (SVZ), o unión de haces de axones (verde). La ilustración fue creada con una herramienta basada en la web, BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/63068fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Plásmido</td>
			<td>Concentración (μg/μL)</td>
			<td>Uso previsto</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-STOP-lox-Lyn-mNeonGreen</td>
			<td>0.25</td>
			<td rowspan="3">Etiquetado de la proteína dirigida a la membrana (Lyn)</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alfa-1-iCre</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alfa-1-LifeAct-GFP</td>
			<td>0.125</td>
			<td>Etiquetado de actina filamentosa (F-actina) en conos de crecimiento</td>
		</tr>
<tr>
<td>pCAG-lox-rox-STOP-rox-tRFP-lox-Lyn-ZsGreen</td>
			<td>1</td>
			<td rowspan="5">Etiquetado independiente de dos poblaciones de neuronas vecinas</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alfa-1-iCre</td>
			<td>0.004</td>
		</tr>
<tr>
<td>+</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-Tub-alfa-1-Dre</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Lista de plásmidos utilizados en el Protocolo. Nombre, concentración y uso previsto de cada plásmido utilizado.
Video complementario 1: Visualización in situ de la dinámica del cono de crecimiento en rodajas organotípicas agudas. Dinámica de los conos de crecimiento etiquetados con Lyn-mNeonGreen (arriba a la izquierda) y LifeAct-GFP (abajo a la izquierda). Los conos de crecimiento vecinos se etiquetan diferencialmente con el sistema de plásmidos duales que contiene tRFP (magenta; arriba a la derecha) y ZsGreen (verde; abajo a la derecha). Intervalo de imagen, 2,5 s. Barras de escala, 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63068/Supplementary_Video_1.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Este protocolo demuestra un método sencillo y robusto para estudiar el crecimiento del axón in situ y la dinámica del cono de crecimiento. Describe cómo preparar cortes cerebrales agudos fisiológicamente relevantes ex vivo y proporciona una tubería de análisis fácil de usar.

In situ Visualización del crecimiento de axones y la dinámica de los conos de crecimiento en cultivos agudos de cortes cerebrales embrionarios ex vivo

During neuronal development, axons navigate the cortical environment to reach their final destinations and establish synaptic connections. Growth cones ...

Cómo los axones navegan por la compleja matriz del sistema nervioso central es una cuestión fundamental en neurobiología. Este protocolo permite el estudio del crecimiento del axón y la dinámica del cono de crecimiento en el entorno fisiológico con imágenes de alta resolución. Este protocolo describe una tubería de extremo a extremo fácil de usar para la entrega de ADN en el cerebro embrionario de ratón, preparaciones para cortes organotípicos de alta calidad y una guía paso a paso para la adquisición y el análisis de imágenes.Aunque originalmente diseñado para estudiar la dinámica de los axones en el sistema nervioso central embrionario, este protocolo podría ajustarse para permitir el cultivo organotípico y la visualización de la plasticidad axónica después de condiciones traumáticas o patológicas. El protocolo en sí es relativamente sencillo. Sin embargo, lograr su primer etiquetado y preservación de las estructuras cerebrales son puntos críticos.Por lo tanto, la electroporación, la disección cerebral y los pasos de corte requieren un cuidado adicional. Demostrar el procedimiento será útil, y el estudiante de doctorado es del laboratorio de Bracket. Después de anestesiar a una ratón hembra embarazada, haga una incisión para extraer ambos cuernos uterinos con un bastoncillo de algodón empapado en solución salina tibia o fórceps, agarrando cuidadosamente los espacios entre los embriones.Luego coloque los embriones en una gasa húmeda. Después de abrir el saco uterino, retire cada embrión. Coloque los embriones en un plato de 10 centímetros que contenga HBSS suplementado con glucosa sobre hielo.Para la electroporación ex utero, recoja un embrión y colóquelo en el soporte. Luego inserte cuidadosamente el capilar de vidrio que contiene la mezcla verde rápida de ADN a través del cráneo del embrión en el ventrículo lateral, e inyecte de dos a tres microlitros de la mezcla de plásmidos de ADN en cada ventrículo. A continuación, sostenga la cabeza del embrión entre los electrodos de pinza de platino en el ángulo apropiado para apuntar al área cerebral deseada, con el cátodo mirando hacia el área donde se pretende la transferencia de ADN.Para la electroporación en el útero, después de sacar los cuernos uterinos y colocar los embriones en una gasa húmeda como se demostró anteriormente, use las yemas de los dedos para rotar suavemente el embrión dentro del útero hasta que se localicen las suturas lambdoidal y salimental. Luego inserte cuidadosamente el capilar de vidrio que contiene la mezcla verde rápida de ADN a través de la pared uterina y el cráneo del embrión en el ventrículo lateral, e inyecte de dos a tres microlitros de la mezcla de plásmidos de ADN en uno o ambos ventrículos según lo desee con un máximo de dos microlitros por ventrículo. Después de la inyección, sostenga la cabeza del embrión entre los electrodos de pinza de platino en el ángulo apropiado para apuntar al área cerebral deseada con el cátodo mirando hacia el área donde se pretende la transferencia de ADN.Una vez que todos los embriones requeridos hayan sido electroporados, use un bastoncillo de algodón empapado en solución salina para colocar suavemente los cuernos uterinos dentro de la cavidad abdominal. Sutura las incisiones musculares y cutáneas con material de sutura 5-0, luego asegure la herida con clips de sutura y desinfecte la herida rociándola con betadina. Coloque el ratón de nuevo en la jaula de recuperación y mantenga el calor utilizando una luz de calentamiento infrarroja lejana durante al menos 20 minutos después del procedimiento.Fije la cabeza del embrión bajo un microscopio de disección. Luego retire la piel del cráneo cortando a lo largo de la línea media a partir de la base de la cabeza hacia la nariz. Pelar la piel en el cráneo lateralmente haciendo un espacio lo suficientemente grande como para que el cerebro sea extirpado.A continuación, para extraer el cerebro, inserte la punta cerrada de las tijeras de disección estériles que comienzan debajo del bulbo olfatorio y se mueven hacia el tronco encefálico. Luego corte el tronco encefálico y recorte muchos trozos sueltos de meninges alrededor del cerebro. Usando una cuchara perforada, recoja el cerebro y elimine el exceso de líquido frotando el fondo de la cuchara contra el papel de seda seco.Luego coloque el cerebro en un plato de agarosa sobre hielo. A continuación, utilizando una cuchara más pequeña mezclar la agarosa durante 10 segundos para un enfriamiento uniforme, luego maniobrar el cerebro hasta el centro del plato colocándolo horizontalmente con el lado dorsal hacia arriba y asegurándose de que esté completamente cubierto con agarosa desde todas las direcciones. Recoja suavemente el bloque de agarosa de la estación de trabajo Vibratome y seque la parte inferior frotando contra papel de seda.Luego coloque el bloque en el área pegada del soporte de la muestra con el lado rostral del cerebro hacia arriba, y coloque el soporte de la muestra en hielo. Deje que el pegamento se seque durante un minuto. Corte el cerebro en rodajas coronales en un ángulo de 15 grados.Luego, usando espátulas limpias, recoja las rodajas de cerebro y colóquelas en una membrana de PTFE inmovilizada en un plato de fondo de vidrio de 35 milímetros con Parrafin. Recoge hasta cinco rebanadas cerebrales por membrana. A continuación, utilizando una pipeta de 200 microlitros, elimine el exceso de solución de glucosa HBSS de alrededor de las rodajas en la membrana dejando las rodajas semisecas, luego agregue 500 microlitros de medios de rebanadas precalentados directamente al espacio debajo de la membrana e incube las rodajas a 35 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.Para obtener imágenes del crecimiento del axón, localice una región de la corteza con densidad celular baja a media. Mientras que para obtener imágenes de la dinámica del cono de crecimiento, ubique un cono de crecimiento en la zona inmediata o zona subventricular de la corteza. A continuación, defina un tamaño de pila Z.Para el crecimiento del axón en una pila Z grande, establezca un tamaño de paso de dos micrómetros y para los conos de crecimiento en una pila Z más pequeña, establezca un tamaño de paso de un micrómetro. Para el análisis de datos, abra el archivo de imagen en Fiji haciendo clic en archivo, luego abrir y seleccionando la imagen. Obtenga la proyección de intensidad máxima del lapso de tiempo haciendo clic en la imagen, seguida de pilas, proyección Z y proyección de intensidad máxima.Revise el lapso de tiempo y localice un axón en crecimiento. Una vez localizado, dibuje una línea a través del axón en crecimiento, comenzando desde la punta del axón en el primer fotograma y siguiendo el axón a través de todo el lapso de tiempo. A continuación, canta el plugin kymo re-slice wide.Establezca la escala del kymograph yendo a la imagen, luego a las propiedades. Después de establecer la distancia en micrómetros, y el ancho de píxel y el tiempo en segundos o minutos, y la altura de píxeles, vaya a analizar y haga clic en medir. Para medir el volumen del cono de crecimiento, abra el archivo de imagen en el software de análisis de imágenes haciendo clic en archivo, abrir y seleccionando el archivo de interés.A continuación, seleccione el asistente para agregar nuevas superficies en el paso uno, en configuración del algoritmo, seleccione segmentar solo una región de interés y, en el paso dos, recorte el marco para que se ajuste a todo el cono de crecimiento en todos los fotogramas. A continuación, en el paso tres, mantenga el umbral a la intensidad absoluta y, en el paso cuatro, asegúrese de que toda la región del cono de crecimiento esté en el umbral. Luego, en el paso cinco, en el tipo de filtro, seleccione el número de vóxeles LMG a uno.Seleccione el botón Ejecutar para realizar todos los pasos de creación y finalizar el asistente para agregar nuevas superficies. Finalmente, en la pestaña de estadísticas en la parte superior de la ventana del asistente, seleccione valores y volumen específicos en la pestaña detallada. Por lo general, las rebanadas cerebrales cultivadas con éxito derivadas de la electroporación en el útero o ex útero muestran una distribución celular normal y una matriz organizada de glía radial con procesos de contacto pilo orientados apicalmente.Ocasionalmente se observa una electroporación ex utero marcadas alteraciones en el andamio glial radial y cortes cerebrales cultivadas que hacen recomendable esta tinción de control. Aquí se muestra una neurona proyecttical cortical piramidal representativa que expresa Lyn-mNeonGreen y el comportamiento dinámico de su cono de crecimiento. Además, las neuronas se etiquetaron utilizando una sonda de actina que expresa plásmidos para analizar la dinámica de la actina de los conos de crecimiento axonal in situ.También se realizaron experimentos in situ con un diseño de plásmido de fluoróforo cre dre dual, donde los fluoróforos tRFP o ZsGreen podrían activarse específica e individualmente mediante recombinasas dre o cre, respectivamente en neuronas vecinas. A partir de los kymographs, se obtienen fácilmente parámetros de crecimiento dinámicos como la velocidad de crecimiento de varios axones y el volumen del cono de crecimiento a lo largo del tiempo. Esto se puede utilizar para evaluar la velocidad de la cinta de correr con actina y el equilibrio entre filopodia y lamellapodia durante la actividad de exploración del cono de crecimiento.Es importante mantener la estructura cerebral y ajustar las concentraciones de plásmidos para lograr un etiquetado escaso. Esto es crucial para la visualización precisa de los axones y los conos de crecimiento en la corteza. Dependiendo de los plasmas seleccionados y los antecedentes genéticos, este protocolo permite a los usuarios modificar las neuronas o el entorno en el que crecen, lo que permite una amplia gama de estudios.Al permitir el acceso de alta resolución a las neuronas in situ, esta técnica permite a los neurocientíficos interrogar la interacción dinámica entre los conos de crecimiento y las métricas del sistema nervioso central tanto a nivel morfológico como molecular.

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Neurociencia

Se presenta un método para preparar cortes organotípicos de embriones de ratón mitad de la gestación para el cultivo y la imagen de lapso de tiempo de extensión del nervio periférico.

Cultura rebanada de organotípicos que expresan GFP embriones de ratón de imágenes en tiempo real al crecimiento excesivo de Nervio Periférico

Este protocolo describe un ensayo de corte organotípicos optimizado para el cerebro postnatal y de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de la migración de los neuroblastos en la corriente migratoria rostral.

Un ensayo Cortar organotípicos de alta resolución de imágenes a intervalos de tiempo de la migración neuronal en el cerebro postnatal

Este video muestra el cultivo ex vivo y la obtención de imágenes de cortes oculomotores de embriones de ratón transgénicos. Los embriones están aislados e incrustados en agarosa. Utilizando un vibrátomo se obtienen rodajas que contienen los núcleos oculomotores y los ojos. Las rodajas se mantienen en cultivo y se obtienen imágenes con un microscopio de fluorescencia.

Cultivo e imagen ex vivo de cortes oculomotores de embriones de ratón transgénicos

Fuente: Wiegreffe, C., et. al.,  Imágenes confocales de lapso de tiempo de neuronas migratorias en cultivo de corte organotípico de cerebro de ratón embrionario usando En el útero Electroporación. J. Vis. Exp. {{TAG_ 44}} (2017) Este video muestra la microscopía confocal de lapso de tiempo para observar la migración radial de las neuronas corticales desde la zona subventricular a la placa cortical a través de andamios gliales radiales en cortes de cerebro embrionarios de ratón transducidos.

Imágenes de lapso de tiempo de la migración radial de neuronas corticales en cortes de cerebro embrionarios de ratón transducidos

La migración de los neuroblastos es un acontecimiento fundamental en la neurogénesis postnatal. Se describe un protocolo para el etiquetado de la eficiencia de los neuroblastos por electroporación in vivo postnatal y la posterior visualización de su migración utilizando time-lapse de rodajas de cerebro agudas. Incluimos una descripción para el análisis cuantitativo de la dinámica de neuroblastos de seguimiento de vídeo.

In vivo Postnatal electroporación y time-lapse de Neuroblast Migración en rodajas de cerebro de ratón aguda

La mitosis progenitoras neurales es un parámetro crítico de la neurogénesis. Gran parte de nuestra comprensión de la mitosis progenitoras neurales se basa en el análisis de tejido fijado. Formación de imágenes en vivo en rodajas de cerebro de embriones es una técnica versátil para evaluar la mitosis con alta resolución temporal y espacial en un entorno controlado.

Imágenes en vivo de la mitosis en el desarrollo de la corteza de embriones de ratón

Las técnicas de microscopía óptica junto con ensayos bioquímicos dilucidan la implicación de la exocitosis mediada por SNARE en la ramificación de los axones dependiente de la netrina. Esta combinación de técnicas permite identificar los mecanismos moleculares que controlan la ramificación de los axones y el cambio de forma de las células.

Utilizando metodologías combinadas para definir el papel de la membrana plasmática de entrega Durante Axon ramas y morfogénesis neuronal

Este protocolo proporciona instrucciones para la observación directa de neuronas corticales que migran radialmente. La electroporación in utero , el cultivo de corte organotípico y la formación de imágenes confocales en intervalos de tiempo se combinan para estudiar directa y dinámicamente los efectos de la sobreexpresión o regulación negativa de genes de interés en las neuronas que migran y para analizar su diferenciación durante el desarrollo.

Time-lapse Imágenes confocales de las neuronas migratorias en la cultura organotípica en rebanadas de cerebro de ratón embrionario<em&gt; En Utero</em&gt; Electroporación

Aquí, nos proporcionan un método confiable y de bajo costo para generar culturas de electroporated cerebro organotypic rebanada de embriones de ratón adecuados para microscopía confocal y técnicas de imagen en vivo.

Ex útero Electroporación y culturas Organotypic rebanada de cerebros embrionarios de ratón para vivir-la proyección de imagen de interneuronas GABAérgicas de migrando

Aquí, describimos un protocolo para la visualización de proyección de la neurona de motor y arborización de axon en embriones de ratón Hb9::GFP transgénicos. Después de inmunotinción para las neuronas motoras, se utilizó microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación a los embriones de la imagen para el posterior análisis cuantitativo. Este protocolo es aplicable a otros procesos de navegación de la neurona en el sistema nervioso central.

Visualización de la navegación del axón Motor y cuantificación de arborización de Axon en embriones de ratón utilizando microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación

Un ensayo de rebanada ex vivo permite que el crecimiento del nervio oculomotor se intermiera en tiempo real. Los cortes se generan mediante la incrustación de embriones E10.5 IslMN:GFP en agarosa, cortando en un vibratome, y creciendo en una incubadora de etapa superior. El papel de las vías de orientación de axón se evalúa mediante la adición de inhibidores a los medios de cultivo.

Cultivo de rebanadas de Oculomotor Ex Vivo de ratones embrionarios con tecnología GFP para imágenes de lapso de tiempo de crecimiento del nervio oculomotor

Aprende a visualizar el crecimiento de axones y la dinámica de conos de crecimiento en cortes agudos de cerebro embrionario de ratón mediante electroporación e imagen de alta resolución.

In situ Visualización del crecimiento de axones y la dinámica de los conos de crecimiento en cultivos agudos de cortes cerebrales embrionarios ex vivo (Video) | JoVE Journal

In situ Visualización del crecimiento de axones y la dinámica de los conos de crecimiento en cultivos agudos de cortes cerebrales embrionarios ex vivo

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