Name: Imágenes en vivo del estado redox de glutatión mitocondrial en neuronas primarias utilizando un indicador ratiométrico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Aprende a evaluar el estado redox mitocondrial en neuronas primarias mediante microscopía confocal en vivo con un indicador ratiométrico. Este protocolo permite monitorear cambios dinámicos en tiempo real y evaluar estrategias de protección mitocondrial.

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Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (BA 3679/5-1; PARA 2289: BA 3679/4-2). A.K. cuenta con el apoyo de una beca ERASMUS+. Agradecemos a Iris Bünzli-Ehret, Rita Rosner y Andrea Schlicksupp por la preparación de las neuronas primarias. Agradecemos al Dr. Tobias Dick por proporcionar pLPCX-mito-Grx1-roGFP2. Los experimentos mostrados en la Figura 4 se realizaron en el Nikon Imaging Center de la Universidad de Heidelberg. La figura 2 se preparó con BioRender.com.

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<li>Albrecht, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redesign+of+genetically+encoded+biosensors+for+monitoring+mitochondrial+redox+status+in+a+broad+range+of+model+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Redesign of genetically encoded biosensors for monitoring mitochondrial redox status in a broad range of model eukaryotes.</a> Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 379-386 (2014).</li>
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<li>Ricke, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+combined+with+high+calcium+load+leads+to+impaired+antioxidant+defense+underlying+the+selective+loss+of+nigral+dopaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction combined with high calcium load leads to impaired antioxidant defense underlying the selective loss of nigral dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 40 (9), 1975-1986 (2020).</li>
<li>Bjornberg, O., Ostergaard, H., Winther, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insight+provided+by+glutaredoxin+within+a+fusion+to+redox-sensitive+yellow+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insight provided by glutaredoxin within a fusion to redox-sensitive yellow fluorescent protein.</a> Biochemistry. 45 (7), 2362-2371 (2006).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.

Las mediciones cuantitativas y dinámicas del estado redox mitocondrial proporcionan información importante sobre la fisiología mitocondrial y celular. Hay varias sondas químicas fluorógenas disponibles que detectan especies reactivas de oxígeno, "estrés redox" o "estrés oxidativo". Sin embargo, estos últimos términos no están bien definidos y a menudo carecen de especificidad9,17,18. En comparación con los colorantes químicos, G...

Varias enzimas mitocondriales importantes y moléculas de señalización están sujetas a la regulación tiol redox1. Además, las mitocondrias son una fuente celular importante de especies reactivas de oxígeno y son selectivamente vulnerables al daño oxidativo2. En consecuencia, el potencial redox mitocondrial afecta directamente a la bioenergética, la señalización celular, la función mitocondrial y, en última instancia, la viabilidad celular3,4. La matriz mitocondrial contiene altas cantidades (1-15 mM) del tampón tiol-disulfuro redox glutatión (GSH) para mantener la homeostasis redox y montar defensas antioxidantes5,6. El GSH se puede unir covalentemente a las proteínas diana (S-glutationilación) para controlar su estado y actividad redox y es utilizado por una variedad de enzimas desintoxicantes que reducen las proteínas oxidadas. Por lo tanto, el potencial redox de glutatión mitocondrial es un parámetro altamente informativo cuando se estudia la función mitocondrial y la fisiopatología.
roGFP2 es una variante de GFP que se ha hecho sensible a la redox mediante la adición de dos cisteínas expuestas a la superficie que forman un par artificial de ditiol-disulfuro7,8. Tiene un solo pico de emisión a ~510 nm y dos picos de excitación a ~400 nm y 490 nm. Es importante destacar que las amplitudes relativas de los dos picos de excitación dependen del estado redox de roGFP2 (Figura 1), lo que convierte a esta proteína en un sensor ratiométrico. En el sensor Grx1-roGFP2, la glutaredoxina-1 humana (Grx1) se ha fusionado con el extremo N de roGFP29,10. La unión covalente de la enzima Grx1 a roGFP2 ofrece dos mejoras importantes del sensor: hace que la respuesta del sensor sea específica para el par redox de glutatión GSH / GSSG (Figura 1), y acelera el equilibrio entre GSSG y roGFP2 en un factor de al menos 100,0009. Por lo tanto, Grx1-roGFP2 permite obtener imágenes específicas y dinámicas del potencial redox del glutatión celular.
Las imágenes Grx1-roGFP2 se pueden realizar en una amplia gama de microscopios, incluidos los microscopios de fluorescencia de campo amplio, los microscopios confocales de disco giratorio y los microscopios confocales de barrido láser. La expresión del sensor en las neuronas primarias se puede lograr mediante varios métodos que incluyen lipofección11, coprecipitación ADN/calcio-fosfato12, transferencia de genes mediada por virus o uso de animales transgénicos como fuente celular (Figura 2). Para los experimentos de este artículo se utilizaron virus adenoasociados recombinantes pseudotipados (rAAV) que contienen una proporción de 1:1 de proteínas de la cápside AAV1 y AAV2 13,14. Con este vector, la máxima expresión del sensor se alcanza típicamente 4-5 días después de la infección y se mantiene estable durante al menos dos semanas. Hemos utilizado con éxito Grx1-roGFP2 en neuronas primarias del hipocampo y cortical de ratones y ratas.
En este artículo, la expresión mediada por rAAV de Grx1-roGFP2 dirigida a mitocondrias en neuronas primarias del hipocampo y cortical de rata se utiliza para evaluar el estado redox de glutatión mitocondrial basal y su perturbación aguda. Se proporciona un protocolo para imágenes confocales en vivo con instrucciones detalladas sobre cómo (i) optimizar la configuración del microscopio confocal de escaneo láser, (ii) ejecutar un experimento de imágenes en vivo y (iii) analizar datos con FIJI.

<table><tbody><tr><td><reactivos fuertes></cloruro ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>calcio fuerte (CaCl2&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>Diamida (DA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3648</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol (DTT)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6908.1</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa (solución madre de 2,5 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>neoFroxx GmbH</td><td>LC-4522.2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (solución madre de 1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio (MgCl2&middot; 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442611-M</td><td></td></tr><tr><td>N-metil-D-aspartato (NMDA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3262</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>neoFroxx GmbH</td><td>LC-5932.1</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio (solución madre 0,1 M)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8574</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Perclorato de éster etílico de tetrametilrodamina (TMRE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87917</td><td></td></tr><tr><td>equipment</cámara > imagen</td><td></td><td></td><td></td> fuerte</tr> <tr><td></td><td>Life Imaging Services (Basilea, Suiza)</td><td>10920</td><td>Cámara Ludin Tipo 3 para & Barra de oslayo; 12mm cubreobjetos</td></tr><tr><td></td><td>microscopio confocal de barrido láser, microscopio Microscopio confocal</td> de barrido láser <td>Leica</td> DMI6000<td></td></tr><tr><td>, unidad de escaneo</td> Bomba peristáltica <td>Leica</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>PP1080 181-4001</td><td></td></tr><tr><td>microscopio confocal de disco giratorio, cámara</td><td>Hamamatsu</td><td>C9100-02 Microscopio confocal de disco giratorio EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>, sistema de incubación</td><td>TokaiHit</td><td>INU-ZILCF-F1</td><td></td></tr><tr><td>microscopio confocal de disco giratorio, microscopio Microscopio</td><td>Nikon</td><td>Ti microscopio</td><td></td></tr><tr><td>confocal de disco giratorio, unidad de escaneo</td><td>Yokagawa</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td>https://fiji.sc</td><td></td></tr><tr><td>StackReg plugin</td><td></td><td></td><td></td>https://github.com/fiji-BIG/StackReg/blob/master/src/main/java/StackReg_.java</tr><tr><td>complemento</td><td></td> TurboReg <td>https://github.com/fiji-BIG/TurboReg/blob/master/src/main/java/TurboReg_.java</td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes en vivo del estado redox de glutatión mitocondrial en neuronas primarias utilizando un indicador ratiométrico

Live Imaging of the Mitochondrial Glutathione Redox State in Primary Neurons using a Ratiometric Indicator

La homeostasis redox mitocondrial es importante para la viabilidad y función neuronal. Aunque las mitocondrias contienen varios sistemas redox, el muy abundante glutatión tampón redox tiol-disulfuro se considera un jugador central en las defensas antioxidantes. Por lo tanto, la medición del potencial redox de glutatión mitocondrial proporciona información útil sobre el estado redox mitocondrial y el estrés oxidativo. Glutaredoxin1-roGFP2 (Grx1-roGFP2) es un indicador ratiométrico basado en proteína fluorescente verde (GFP) codificado genéticamente del potencial redox de glutatión que tiene dos picos de excitación sensibles al estado redox a 400 nm y 490 nm con un solo pico de emisión a 510 nm. Este artículo describe cómo realizar una microscopía viva confocal de Grx1-roGFP2 dirigida a mitocondrias en neuronas primarias del hipocampo y cortical. Describe cómo evaluar el potencial redox de glutatión mitocondrial en estado estacionario (por ejemplo, para comparar estados de enfermedad o tratamientos a largo plazo) y cómo medir los cambios redox en los tratamientos agudos (utilizando el fármaco excitotóxico N-metil-D-aspartato (NMDA) como ejemplo). Además, el artículo presenta imágenes conjuntas de Grx1-roGFP2 y el indicador de potencial de membrana mitocondrial, tetrametilrodamina, éster etílico (TMRE), para demostrar cómo Grx1-roGPF2 se puede multiplexar con indicadores adicionales para análisis multiparamétricos. Este protocolo proporciona una descripción detallada de cómo (i) optimizar la configuración del microscopio de barrido láser confocal, (ii) aplicar medicamentos para la estimulación seguido de la calibración del sensor con diamida y ditiotreitol, y (iii) analizar datos con ImageJ / FIJI.

Cuantificación de las diferencias en el estado redox mitocondrial en estado estacionario después de la retirada del factor de crecimiento Para demostrar la cuantificación de las diferencias de estado estacionario en el estado redox mitocondrial, las neuronas primarias cultivadas en medio estándar se compararon con las neuronas cultivadas sin factores de crecimiento durante 48 horas antes de la obtención de imágenes. La abstinencia del factor de crecimiento resulta en la muerte celular neuronal apoptót...

Este artículo describe un protocolo para determinar las diferencias en el estado redox basal y las respuestas redox a las perturbaciones agudas en las neuronas primarias del hipocampo y cortical utilizando microscopía viva confocal. El protocolo se puede aplicar a otros tipos de células y microscopios con modificaciones mínimas.

Imágenes en vivo del estado redox de glutatión mitocondrial en neuronas primarias utilizando un indicador ratiométrico

Mitochondrial redox homeostasis is important for neuronal viability and function. Although mitochondria contain several redox systems, the highly abundant ...

Este método permite investigar cómo se ve afectado el estado redox mitocondrial en condiciones fisiopatológicas. También se puede utilizar para evaluar la eficacia de las estrategias de tratamiento que tienen como objetivo proteger las mitocondrias. La principal ventaja de esta técnica es que permite una evaluación orgánica y específica de los cambios dinámicos y de rastreo en el estado redox de las mitocondrias en tiempo real.Este método se puede combinar con indicadores adicionales para registrar simultáneamente, por ejemplo, el potencial de la membrana mitocondrial o las concentraciones de calcio además del estado redox. Este protocolo se puede aplicar a células de cultivo, explantes de tejidos y cultivos de rodajas. Comience por optimizar la configuración del microscopio confocal de barrido.Para hacerlo, configure el detector en 12 bits o 16 bits, active el modo de escaneo secuencial y agregue una segunda secuencia / pista. Para ambos canales, seleccione una tabla de búsqueda de pseudo color que indique píxeles sobreexpuestos y subexpuestos y, a continuación, seleccione un objetivo adecuado para el objeto de interés. Monte un coverslip con células en la cámara de imágenes.Agregue un mililitro de tampón de imágenes y coloque la cámara en el microscopio. Use el ocular y la luz transmitida para enfocar las células. Grabe imágenes con diferentes formatos de píxeles y tamaños estenopeicos.Luego grabe imágenes con diferentes intensidades láser y, en consecuencia, ajuste la ganancia y el umbral del detector. Finalmente, grabe imágenes con diferentes velocidades de escaneo y diferentes números de promedios de fotogramas. Para obtener imágenes en vivo, establezca el intervalo de lapso de tiempo en 30 segundos y la duración en 25 minutos.Luego monte las células, coloque la cámara en el microscopio y enfoque las células como se demostró anteriormente. Cambie al modo de escaneo y use el canal de 488 nanómetros en la vista en vivo para enfocar y localizar las células para obtener imágenes. Opcionalmente, para aumentar el número de celdas grabadas por ejecución, utilice la función multipunto para obtener imágenes de dos a tres campos de visión por recubierta.Inicie la adquisición de lapso de tiempo y grabe cinco imágenes como una grabación de línea de base de dos minutos. Agregue 500 microlitros de solución 3X NMDA a la cámara para lograr la concentración final de 30 micromolares y registre 20 imágenes adicionales como una respuesta NMDA de 10 minutos. A continuación, agregue 500 microlitros de solución 4X DA a la cámara y grabe seis imágenes más.Aspire el tampón de la cámara de imágenes y reemplácelo con un mililitro de solución de TDT. Después de grabar 10 imágenes más, finalice la grabación y guarde la serie de imágenes. Para importar los datos en el software de análisis de imágenes, haga clic en complementos, seleccione formatos de biografía y luego en el importador de formatos de biografía.En el cuadro de diálogo, elija hyperstack en la pila de vistas con, establezca el modo de color como predeterminado y seleccione escala automática. Cambie el formato de la imagen a 32 bits haciendo clic en la imagen, seleccionando tipo y, a continuación, de las opciones, elija 32 bits. Para dividir los canales de color en ventanas separadas, haga clic en la imagen, vaya a color y seleccione dividir canales.Ajuste el umbral para seleccionar las mitocondrias para el análisis haciendo clic en la imagen, seleccionando ajustar y el umbral. En el cuadro de diálogo, seleccione fondo oscuro rojo predeterminado y histograma de pila. Cuando los píxeles seleccionados aparezcan en rojo, haga clic en aplicar.A continuación, seleccione establecer píxeles de fondo para que NAN procese todas las imágenes y realice el mismo procedimiento para el canal dos. Para visualizar la relación de 405 a 488 nanómetros, cree una imagen de proporción haciendo clic en la calculadora de procesos e imágenes. En el cuadro de diálogo, seleccione canal uno en la imagen una división en el canal de operación dos en la imagen dos.A continuación, seleccione crear nueva ventana y procese todas las imágenes. Cambie la tabla de búsqueda de la imagen de relación a pseudo color haciendo clic en la imagen, seleccionando tablas de búsqueda y, a continuación, dispare. Para analizar la imagen, dibuje ROI alrededor de células individuales o mitocondrias en la imagen de proporción.Para agregar los ROI al administrador de ROI, vaya a analizar, haga clic en las herramientas, seleccione el administrador de ROI, haga clic en agregar y seleccione mostrar todo. Para medir las proporciones de 405 a 488 nanómetros de celdas individuales, haga clic en el administrador de ROI, seleccione todos los ROI presionando Control A, vaya a más y seleccione multimedida. En el cuadro de diálogo, seleccione medir todos los sectores y una fila por sector.Después de exportar las mediciones al software de hoja de cálculo, seleccione la imagen de 405 nanómetros, mida las intensidades de todos los ROI y vuelva a exportar las mediciones al software de hoja de cálculo. Del mismo modo, mida las intensidades de ROI de la imagen de 488 nanómetros. Para guardar los ROI para futuras referencias, seleccione todos los ROI presionando Control A, vaya a más y seleccione guardar.Estas instantáneas representativas de una grabación de lapso de tiempo muestran imágenes de relación de neuronas antes y después del tratamiento con NMDA y después de la calibración máxima / min con DA y TDT. El tratamiento de las neuronas con NMDA 30 micromolares indujo la oxidación de las mitocondrias en pocos minutos. El análisis de los canales de fluorescencia individuales reveló que la acidosis mitocondrial inducida por NMDA causó una caída de la fluorescencia GFP en la excitación de 405 y 488 nanómetros.En un experimento de control, el pretratamiento con DA impidió cualquier oxidación adicional de las mitocondrias por NMDA. Y en consecuencia, la relación 405 a 488 no cambió a pesar de un enfriamiento considerable de la intensidad de fluorescencia GFP2 sensible al redox. Este experimento confirmó que la relación de 405 a 488 nanómetros no se ve afectada por los cambios de pH.En un experimento separado, el potencial de membrana mitocondrial, el estado redox y la morfología se evaluaron en paralelo. El tratamiento de las neuronas con NMDA micromolar de 60 resultó en la pérdida de la señal de tetrametilrodamina o TMRE y un aumento en la relación de GFP rho de 405 a 488 nanómetros seguida de un redondeo tardío de las mitocondrias. Cuando comience a usar este método, es muy importante tomarse el tiempo para optimizar cuidadosamente la configuración microscópica.Esto ayudará a mantener las neuronas sanas durante sus experimentos. También es muy importante respetar siempre las normas de seguridad láser. Asegúrese de no exponerse a la radiación láser cuando agregue medicamentos para manipular durante las grabaciones en vivo.

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Se describe un protocolo que permite imágenes de las mitocondrias en la vida neuronas a través de microscopía de fluorescencia durante largos períodos de tiempo. Imágenes durante períodos prolongados se lleva a cabo a través de lentivirus mediada por la expresión de una proteína mitocondrial, dirigida fluorescentes y el uso de una etapa de bajo costo-top incubadora que fue diseñado y construido en nuestro laboratorio.

La neuromodulación y mitocondrial de transporte: Imágenes en vivo en las neuronas del hipocampo durante largos períodos de tiempo

Se demuestra la aplicación del indicador de fluorescencia, TMRM, en las neuronas corticales para determinar los cambios relativos en la intensidad de fluorescencia TMRM antes y después de la aplicación de un estímulo específico. También muestran la aplicación de la fluorescencia de la sonda...

Determinación de Especies de la membrana mitocondrial de oxígeno potencial y reactiva en las neuronas corticales de rata en vivo

Fuente: Katsalifis, A., et al. Imágenes en vivo del estado redox del glutatión mitocondrial en neuronas primarias utilizando un indicador radiométrico. J. Vis. Exp. (2021)Este video demuestra la imagen del estado redox mitocondrial en neuronas primarias utilizando un indicador fluorescente radiométrico. Mediante la aplicación de dos longitudes de onda de excitación bajo un microscopio de fluorescencia, se mide la relación de intensidad de fluorescencia para evaluar la oxidación mitocondrial. El...

Imágenes del estado redox mitocondrial en neuronas primarias utilizando un indicador radiométrico

Se describe el uso de dos, biosensores ratiometric codificados genéticamente, que se basan en la GFP, para vigilar los niveles de ATP estado redox mitocondrial y en la resolución subcelular en células de levadura vivas.

Biosensores radiométricos que miden el estado redox mitocondrial y ATP en las células vivas de levadura

La microscopía confocal de barrido se aplica para obtener imágenes de los eventos mitocondriales individuales en el corazón perfundido o los músculos esqueléticos en animales vivos. Monitoreo en tiempo real de los procesos mitocondriales individuales, como accesos repentinos superóxido y potencial de membrana fluctuaciones permite la evaluación de la función mitocondrial en un contexto fisiológicamente relevante y durante perturbaciones patológicas.

Imagen confocal de Soltero mitocondriales superóxido Parpadea en corazón intacto o En Vivo

El deterioro del transporte mitocondrial y la morfología están involucrados en diversas enfermedades neurodegenerativas. El protocolo presentado utiliza neuronas anticerebrales derivadas de células madre pluripotentes inducidas para evaluar el transporte mitocondrial y la morfología en paraplejia espástica hereditaria. Este protocolo permite la caracterización del tráfico mitocondrial a lo largo de los axones y el análisis de su morfología, lo que facilitará el estudio de la enfermedad...

Análisis del transporte mitocondrial y la morfología en neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre en paraplejia espástica hereditaria

Este proctocol tiene como objetivo proporcionar un método para imágenes de Ca2+ mitocondrial in vitro e in vivo en astrocitos y neuronas.

Obtención de imágenes de ca2+ mitocondrial en astrocitos y neuronas utilizando indicadores de Ca2+ codificados genéticamente (GECI)

Este artículo describe el método para la obtención de imágenes mitocondriales de lapso de tiempo de cultivos de astrocitos equipados con el biosensor MitoTimer y el análisis multiparamétrico resultante de la dinámica mitocondrial, la movilidad, la morfología, la biogénesis, el estado redox y el recambio.

Imágenes en vivo del sistema mitocondrial en astrocitos cultivados

Esta técnica describe un flujo de trabajo efectivo para visualizar y medir cuantitativamente el potencial de la membrana mitocondrial y los niveles de superóxido dentro de las células HeLa utilizando imágenes en vivo basadas en fluorescencia.

Cuantificación basada en fluorescencia del potencial de membrana mitocondrial y los niveles de superóxido utilizando imágenes en vivo en células HeLa

En este vídeo, se demuestra la visualización de la translocación de la PKC en células vivas mediante PKC marcado con fluorescencia.

En vivo de imágenes de la translocación de PKC en células Sf9 y en las neuronas sensoriales Aplysia

Aprende a evaluar el estado redox mitocondrial en neuronas primarias mediante microscopía confocal en vivo con un indicador ratiométrico. Este protocolo permite monitorear cambios dinámicos en tiempo real y evaluar estrategias de protección mitocondrial.

Imágenes en vivo del estado redox de glutatión mitocondrial en neuronas primarias utilizando un indicador ratiométrico

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