Name: Ex Vivo Interrogación optogenética de la transmisión sináptica de largo alcance y la plasticidad de la corteza prefrontal medial a la corteza entorrinal lateral (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprende a caracterizar electrofisiológicamente sinapsis específicas usando construcciones optogenéticas virales en rebanadas cerebrales agudas de roedores. Este método permite estudiar vías de largo alcance y plasticidad sináptica con precisión.

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Este trabajo cuenta con el apoyo de la subvención Wellcome 206401/Z/17/Z. Nos gustaría agradecer a Zafar Bashir por su tutoría experta y al Dr. Clair Booth por su asistencia técnica y comentarios sobre el manuscrito.

<ol><li>Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+and+memory%3A+an+evaluation+of+the+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).</li>
<li>Poorthuis, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-specific+modulation+of+the+prefrontal+cortex+by+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors.</a> Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).</li>
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<li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+overlap+of+parvalbumin+and+somatostatin+expressing+interneurons+in+mouse+presubiculum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum.</a> Frontiers in Neural Circuits. 9, 20(2015).</li>
<li>Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection-specific+neuromodulation+of+medial+prefrontal+cortex+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons.</a> Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).</li>
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<li>Booker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+acute+brain+slices+from+the+dorsal+pole+of+the+hippocampus+from+adult+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).</li>
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<li>Basu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+of+hippocampal+activity%2C+plasticity%2C+and+memory+by+entorhinal+cortex+long-range+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition.</a> Science. 351 (6269), (2016).</li>
<li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li>
<li>Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+in+prefrontal+cortex+induced+by+coordinated+synaptic+transmission+arising+from+reuniens%2Frhomboid+nuclei+and+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex+Communications%22%5BJournal%5D)">Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus.</a> Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).</li>
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<li>Anisimova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spike-timing-dependent+plasticity+rewards+synchrony+rather+than+causality%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality.</a> BioRxiv. , (2021).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo presentado aquí describe un método para explorar proyecciones sinápticas de largo alcance altamente específicas utilizando una combinación de cirugía estereotáxica para administrar AAV que codifican construcciones optogenéticas y electrofisiología en cortes cerebrales agudos (Figura 1). Juntas, estas técnicas ofrecen herramientas para caracterizar la fisiología y la plasticidad de los circuitos cerebrales con alta precisión en vías de largo alcance y anatómicamente difusas que a...

Comprender la fisiología de las sinapsis y cómo sufren cambios plásticos es fundamental para comprender cómo funcionan las redes cerebrales en el cerebro sano1 y cómo funcionan mal en los trastornos cerebrales. El uso de cortes cerebrales agudos ex vivo permite el registro de la actividad eléctrica de las sinapsis de neuronas individuales con una alta relación señal-ruido utilizando grabaciones de pinza de parche de células enteras. El control del potencial de membrana y la manipulación farmacológica directa permiten el aislamiento de los subtipos de receptores. Estos registros pueden realizarse con exquisita especificidad para identificar la neurona postsináptica, incluyendo la posición laminar y subregional2, la morfología celular3, la presencia de marcadores moleculares4, sus proyecciones aferentes5, o incluso si estuvo activa recientemente6.
Sin embargo, lograr la especificidad de las entradas presinápticas es algo más difícil. El método convencional ha utilizado electrodos de estimulación para excitar los axones que corren en una lámina particular. Un ejemplo de esto es en el hipocampo donde la estimulación local en el estrato radiático activa sinapsis que se proyectan desde el CA3 hasta el subcampoCA1 7. En este caso, la especificidad presináptica se logra ya que la entrada CA3 representa la única entrada excitatoria ubicada dentro del estrato radiátum que se proyecta a las células piramidales CA18. Este alto grado de especificidad de entrada alcanzable con la activación presináptica eléctrica convencional de los axones CA3-CA1 es, sin embargo, una excepción que se refleja en el intenso estudio al que ha sido sometida esta sinapsis. En otras regiones del cerebro, los axones de múltiples vías aferentes coexisten en la misma lámina, por ejemplo, en la capa 1 del neocórtex9, lo que hace imposible la estimulación presináptica específica de entrada con electrodos estimulantes convencionales. Esto es problemático ya que diferentes entradas sinápticas pueden tener propiedades fisiológicas divergentes; Por lo tanto, su coestimulación puede conducir a una caracterización errónea de la fisiología sináptica.
El advenimiento de la optogenética, la codificación genética de proteínas de membrana fotosensibles (opsinas) como la canalrodopsina-2 (ChR2), ha permitido una gran expansión de las posibilidades para estudiar proyecciones sinápticas aisladas entre regiones cerebrales10,11. Aquí describimos una solución generalizable y de bajo costo para estudiar la fisiología sináptica de largo alcance y la plasticidad. Las construcciones optogenéticas se entregan de una manera altamente específica utilizando vectores virales que permiten un control extremadamente preciso de la región presináptica de interés. Las proyecciones eferentes expresarán el canal activado por la luz que permite la activación de estas fibras en una región objetivo. Por lo tanto, se pueden estudiar vías anatómicamente difusas de largo alcance que no pueden activarse independientemente mediante la estimulación eléctrica tradicional no específica.
Describimos, como vía de ejemplo, la transducción de la corteza prefrontal medial (mPFC) con virus adenoasociados (AAV) que codifican opsinas excitatorias de canales catiónicos. Luego describimos la preparación de cortes agudos de la corteza entorrinal lateral (LEC), registros de parche y pinza de neuronas piramidales LEC de capa 5 y activación evocada por luz de proyecciones glutamatérgicas mPFC-LEC (Figura 1). También describimos la evaluación histológica del lugar de inyección para confirmar la ubicación de la región presináptica de interés y la identificación de la morfología celular postsináptica.

<table><tbody><tr><td>tubo de 0,2 mL</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>12134102</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; Pipeta L</td><td>Gilson</td><td>FD10001</td><td></td></tr><tr><td>placa de 24 pocillos</td><td>SARSTEDT</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>válvula luer de 3 vías</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-30600-02</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-Sustrato de diaminobenzidina (DAB)</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo 40x</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>4-aminopiridina</td><td>Hola Bio</td><td>HB1073</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo 4x</td><td>Olympus</td><td>PLN4X/0.1</td><td></td></tr><tr><td>AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry</td><td>Addgene</td><td>35512</td><td>Título viral: 3.3x1013 GC/ml</td></tr><tr><td>Lente acromática</td><td>Edmund Optics</td><td>49363</td><td>Enfoca el espectro visual y el infrarrojo</td></tr><tr><td>cercano Microcentrífuga de sobremesa</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1005*</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidrio de borosilicato</td><td>Warner Instruments</td><td>G150F-6</td><td></td></tr><tr><td>Burr</td><td>Fine science tools</td><td>19008-07</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Cámara - Qimaging Retiga Electro</td><td>Photometrics</td><td>01-ELECTRO-M-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Carbachol</td><td>Tocris</td><td>2810</td><td></td></tr><tr><td>Exfoliante quirúrgico de clorhexidina</td><td>Vetasept</td><td>XHG008</td><td></td></tr><tr><td>Cortaúñas</td><td>Andis</td><td>22445</td><td>AGC Super 2 velocidades Cuchilla desmontable Clipper</td></tr><tr><td>Lente de condensador de colimación</td><td>ThorLabs</td><td>ACL2520-A</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10011913</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>CsMeSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>Pegamento de cianoacrilato</td><td>Rapid Electronics Ltd</td><td>84-4557</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de adquisición de datos</td><td>National Instruments</td><td>USB-6341 BNC</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Espejo dicroico 500 nm paso largo</td><td>Edmund Optics</td><td>69899</td><td></td></tr><tr><td>Espejo dicroico de paso largo de 600 nm</td><td>Edmund Optics</td><td>69901</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de espejo dicroico</td><td>ThorLabs</td><td>CM1-DCH/M</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Millpore 324626</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaelectrodos con puerto lateral</td><td>HEKA</td><td>895150</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de emisión</td><td>Chroma</td><td>59022m</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de excitación</td><td>Chroma</td><td>ET570/20x</td><td></td></tr><tr><td>Gel para ojos</td><td>Dechra</td><td>Lubrithal</td><td></td></tr><tr><td>Pincel fino</td><td>Suministros de laboratorio científico</td><td>BRU2052</td><td></td></tr><tr><td>Guillotina</td><td>World Precision Instruments</td><td>DCAP</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Solución de peróxido de hidrógeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>30% (p/p)</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein</td><td>988-3245</td><td></td></tr><tr><td>Isopentano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>k-gluconato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>Cubo de filtro de fluorescencia cinemática</td><td>ThorLabs</td><td>DFM1T1</td><td></td></tr><tr><td>Controlador LED</td><td>ThorLabs</td><td>LEDD1B</td><td></td></tr><tr><td>Pomada de lidocaína</td><td>Teva</td><td>80007150</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Microtaladro</td><td>Harvard Apparatus</td><td>75-1887</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de microelectrodos</td><td>Sutter instruments</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de microinyección</td><td>Hamilton</td><td>7634-01/00</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de jeringa de microinyección</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>Especificación personalizada: calibre 33, longitud 15 mm, estilo de punta 4 - 12&deg;</td></tr><tr><td>bomba de jeringa de microinyección</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3T-1</td><td></td></tr><tr><td>LED azul montado</td><td>ThorLabs</td><td>M470L5</td><td></td></tr><tr><td>LED verde montado</td><td>ThorLabs</td><td>M565L3</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaGTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4.H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NIR LED</td><td>OSRAM</td><td></td> <td>SFH4550Se utiliza para la obtención de imágenes IR refractadas de cortes, la óptica de contraste de interferencia diferencial (DIC) es otro método comúnmente utilizado</td></tr> Medio <tr><td>OCT</td><td>VWR International</td><td>RAYLLAMB/OCT</td><td>Medio de temperatura de corte óptima</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de pinza de parche</td><td>Molecular Devices</td><td>700A</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>World Precision Instruments</td><td>Portaobjetos</td><td></td></tr><tr><td>de microscopio recubiertos de poli-L-lisina</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>23-769-310</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de grabación</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de bisturí Swann</td><td>Morton</td><td>#24</td><td></td></tr><tr><td>Ancla de corte</td><td>Warner Instruments SHD-26-GH</td><td>/15</td><td></td></tr><tr><td>Montura estereotáxica</td><td>Kopf</td><td>Modelo 902</td><td></td></tr><tr><td>Soporte estereotáxico para micro taladro</td><td>Harvard Apparatus</td><td>75-1874</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio quirúrgico</td><td>Carl Zeiss</td><td>OPMI 1 FR pro</td><td></td></tr><tr><td>Suture</td><td>Ethicon</td><td>W577H</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa para registro intracelular solución</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>171-0020</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de tetrodotoxina</td><td>Hello Bio</td><td>HB1035</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10458842</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia vertical</td><td>Leica</td><td>DM6 B</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Medio de montaje antidecoloración con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td></td></tr><tr><td>Kit VECTASTAIN ABC-HRP</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden Instruments</td><td>7000smz-2</td><td></td></tr><tr><td>WinLTP</td><td>https://www.winltp.com/</td> <td>Versión 2.32</td><td>Software de adquisición de datos</td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>aCSF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>solución <td></td><td></td><td></td><td>de corte con sacarosa</td></tr><tr><td>PFA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intracellular?</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo interrogación optogenética de la transmisión sináptica de largo alcance y la plasticidad de la corteza prefrontal medial a la corteza entorrinal lateral

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Estudiar las propiedades fisiológicas de sinapsis específicas en el cerebro y cómo sufren cambios plásticos es un desafío clave en la neurociencia moderna. Las técnicas electrofisiológicas in vitro tradicionales utilizan la estimulación eléctrica para evocar la transmisión sináptica. Un inconveniente importante de este método es su naturaleza inespecífica; Todos los axones en la región del electrodo estimulante se activarán, lo que dificulta atribuir un efecto a una conexión aferente particular. Este problema se puede superar reemplazando la estimulación eléctrica con estimulación basada en la optogenética. Describimos un método para combinar la optogenética con registros in vitro de patch-clamp. Esta es una herramienta poderosa para el estudio tanto de la transmisión sináptica basal como de la plasticidad sináptica de conexiones sinápticas precisas definidas anatómicamente y es aplicable a casi cualquier vía en el cerebro. Aquí, describimos la preparación y el manejo de un vector viral que codifica la proteína canalrodopsina para la inyección quirúrgica en una región presináptica de interés (corteza prefrontal medial) en el cerebro de roedores y la fabricación de cortes agudos de regiones diana aguas abajo (corteza entorrinal lateral). También se presenta un procedimiento detallado para combinar las grabaciones de patch-clamp con la activación sináptica por estimulación lumínica para estudiar la plasticidad sináptica a corto y largo plazo. Discutimos ejemplos de experimentos que logran la especificidad de la vía y la célula combinando optogenética y etiquetado celular dependiente de Cre. Finalmente, se describe la confirmación histológica de la región presináptica de interés junto con el etiquetado de biocitina de la célula postsináptica, para permitir una mayor identificación de la ubicación precisa y el tipo de célula.

En este protocolo, describimos cómo estudiar la fisiología sináptica de largo alcance y la plasticidad utilizando la administración viral de construcciones optogenéticas. El protocolo se puede adaptar muy fácilmente para estudiar casi cualquier conexión de largo alcance en el cerebro. Como ejemplo, describimos la inyección de AAV que codifican una opsina en mPFC de rata, la preparación de cortes agudos de LEC, registros de patch-clamp de neuronas piramidales LEC de capa 5 y activación evocada por luz de terminales mPFC e...

Aquí presentamos un protocolo que describe la transducción viral de regiones cerebrales discretas con construcciones optogenéticas para permitir la caracterización electrofisiológica específica de la sinapsis en cortes cerebrales agudos de roedores.

Ex Vivo Interrogación optogenética de la transmisión sináptica de largo alcance y la plasticidad de la corteza prefrontal medial a la corteza entorrinal lateral

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...

Las construcciones optogenéticas entregadas viralmente permiten una caracterización electrofisiológica detallada de la fisiología y plasticidad de sinapsis específicas en cortes cerebrales agudos. Las principales ventajas de activar las sinapsis optogenéticamente es la capacidad de estudiar vías de largo alcance y la estimulación selectiva de axones que no están separados anatómicamente. Lisa Kinnavane, investigadora asociada de nuestro laboratorio, demostrará el procedimiento.Para empezar, cargue una jeringa Hamilton en una bomba de jeringa de microinyección conectada a un brazo móvil montado en un marco estereotáxico. Luego coloque una alícuota de cinco microlitros del virus en una microcentrífuga. Gire el tubo durante unos segundos y pipete dos microlitros de la preparación viral en la tapa del tubo.Para llenar la jeringa con la preparación viral, vea la punta de la aguja con un microscopio quirúrgico. Luego coloque manualmente el bolo del virus en la punta de la aguja y retire el émbolo de la jeringa usando los controles de la bomba. Ajuste el volumen de inyección de la bomba a 300 nanolitros y el caudal a 100 nanolitros por minuto.Haga funcionar la bomba y confirme el flujo adecuado observando la gota del virus en la punta de la aguja. Absorba el virus en un bastoncillo de algodón y limpie la aguja con etanol al 70%. A continuación, usando los tornillos del ajustador en el marco estereotáxico, navegue por la punta de la aguja hasta el bregma y tome nota de las mediciones estereotáxicas observadas en las tres escalas vernier del marco.Sume o reste estas distancias de las coordenadas bregma. Haga un orificio de rebabas en la superficie del cráneo usando un microtaladro montado en el brazo estereotáxico. Inserte la aguja en el cerebro en la coordenada dorsoventral predeterminada e infunda un volumen predeterminado de la preparación viral.Después de la infusión, dejar la aguja in situ durante 10 minutos para permitir la difusión del bolo. Luego retire la aguja y haga funcionar la bomba para asegurarse de que la aguja no esté bloqueada. Dos semanas después de la inyección viral, eutanasia a la rata, diseccionar rápidamente todo el cerebro y transferirlo a la solución de corte de sacarosa.Con una cucharadita de metal, levante el cerebro, deseche el exceso de solución y colóquelo en un papel de filtro. Con un bisturí, retire el cerebelo y corte el cerebro en el plano coronal aproximadamente a la mitad de su longitud. La mitad posterior es el bloque de tejido LEC.Devuelva el bloque de tejido y el cerebro restante a la solución de corte de sacarosa. A continuación, coloque una gota de pegamento de cianoacrilato en una plataforma de vibratomo y extiéndala en una capa delgada. Luego, con una cucharadita, elija el bloque de tejido LEC y transfiéralo al parche de pegamento, de modo que el corte coronal anterior se haya adherido.Instale la etapa en la cámara de tejido del vibratomo y vierta rápidamente suficiente solución de corte de sacarosa para sumergir el tejido. Después de orientar la superficie ventral del bloque de tejido hacia la cuchilla, corte cortes de 350 micrómetros de espesor de ventral a dorsal usando una velocidad lenta de avance de la cuchilla. Por lo general, se pueden obtener siete rebanadas por hemisferio.Transfiera las rodajas a la cámara de recolección de rebanadas. Luego coloque la cámara de recolección en un baño de agua de 34 grados centígrados durante una hora antes de volver a la temperatura ambiente. Coloque el resto del cerebro en paraformaldehído durante 48 horas.Para la identificación de la célula objetivo, coloque el corte en la cámara de grabación e inmovilícelo con un anclaje de corte. Bajo bajo aumento, usando iluminación infrarroja, navegue hasta la capa LEC cinco. Luego cambie al objetivo de inmersión en agua de alto aumento e identifique las neuronas piramidales.Marque la posición de la celda en el monitor con cinta adhesiva. A continuación, para formar una abrazadera de parche de células completas, fabrique una micropipeta de vidrio de borosilicato y llénela con una solución de registro intracelular. Coloque la micropipeta llena en el soporte del electrodo y aplique presión positiva soplando con fuerza en una boquilla conectada al puerto lateral del soporte del electrodo.Eleve el objetivo del microscopio de tal manera que se forme un menisco e inserte el electrodo en el menisco hasta que se pueda ver en el microscopio. Abra la ventana Prueba de sellado y determine si la resistencia de la pipeta es de tres a cinco megaohmios. Luego toque la celda identificada con una punta de pipeta, lo que resulta en una hendidura en la membrana celular.A continuación, aplique presión negativa por succión en la boquilla, aumentando la resistencia de la pipeta. Continúe aplicando presión negativa gradualmente hasta que la membrana celular se rompa, lo que resulta en transitorios de capacitancia de células completas. Para ingresar a la configuración actual de la abrazadera, use un LED montado dirigido a la trayectoria de luz del microscopio con cubos de filtro y óptica apropiada, y aplique pulsos de luz a la rebanada a través del objetivo 40X.Entregar trenes de múltiples pulsos de luz a cinco hercios, 10 hercios y 20 hercios para investigar las propiedades de liberación presináptica. Para permitir que la biocitina llene la neurona, espere al menos 15 minutos después de ingresar a toda la configuración celular. En la abrazadera de voltaje, monitoree la capacitancia de la membrana y la resistencia de entrada.Luego, retire lentamente la pipeta a lo largo del ángulo de aproximación lejos del soma de la célula, observando la lenta desaparición de los transitorios de capacitancia y la corriente de membrana, lo que indica el resellado de la membrana celular y la formación de un parche de afuera hacia afuera en la punta de la pipeta. Coloque la rebanada en paraformaldehído en una placa de 24 pocillos e incube durante la noche. Usando medio OCT, conecte un bloque de tejido al disco de la muestra de criostato.Para congelar el tejido, coloque el isopentano en un recipiente apropiado y sumerja el disco de la muestra, asegurándose de que el tejido esté por encima del nivel del isopentano. Luego baje el recipiente de isopentano en nitrógeno líquido y permita que el tejido se congele. Una vez que el tejido esté completamente congelado, deje el bloque de tejido en la cámara de criostato a menos 20 grados centígrados durante 30 minutos para permitir que la temperatura del bloque se equilibre.Después del equilibrio, corte secciones de 40 micrómetros de espesor en el criostato y use un pincel fino para guiar las secciones de la cuchilla. Adhiera estas secciones congeladas a un portaobjetos de microscopio de vidrio recubierto de poli-L-lisina a temperatura ambiente tocando el portaobjetos con las secciones. Después de agregar 150 microlitros de medio de montaje a cada portaobjetos, aplique el cubreobjetos y elimine cualquier burbuja de aire presionando suavemente el cubreobjetos.Cubra los portaobjetos para protegerlos contra el fotoblanqueo y déjelos secar al aire durante 12 horas. Luego, con un microscopio de fluorescencia, examine la ubicación del sitio de inyección viral. Para la tinción de biocita, incubar las rodajas en peróxido de hidrógeno al 3% en PBS durante 30 minutos para bloquear cualquier actividad de la peroxidasa endógena.Luego lave las rodajas de cerebro con PBS hasta que no se vean más burbujas de oxígeno. A continuación, incubar las rodajas durante tres horas en una solución de complejo HRP biotinilada al 1% en PBS que contiene 0,1% Triton X-100. Después de seis lavados PBS, incubar cada rebanada en solución DAB hasta que la tinción de biocitina de las estructuras neuronales se haga visible.Detenga la reacción transfiriendo las rodajas en PBS frío. Luego monte las rodajas en los portaobjetos del microscopio de vidrio con un cepillo. Después de eliminar el exceso de PBS, agregue el medio de montaje.Cubra las rodajas con cubrebocas y déjelas secar al aire, como se demostró anteriormente. Se localizó y parcheó una célula piramidal sana. Si se requiere la identificación de células postsinápticas, una célula que exprese el marcador fluorescente debe localizarse utilizando óptica de campo amplio.Los pulsos de luz individuales de dos milisegundos dieron como resultado potenciales postsinápticos excitatorios optogenéticos de forma de onda simple. La plasticidad a corto plazo de la sinapsis se examina aplicando trenes de estimulación lumínica de cinco, 10 y 20 hercios. Mientras se investigaba la plasticidad a largo plazo, la adición del agonista colinérgico carbachol al aCSF circulante durante 10 minutos causó una depresión a largo plazo que todavía era evidente 40 minutos después de la eliminación del ligando.La longitud del sitio de inyección se examinó histológicamente. El reportero fluorescente mCherry se localizó en las capas más profundas de la corteza prelímbica e infralímbica. Además, la tinción de una célula llena de biocitina confirmó su ubicación y morfología.Los pasos críticos de este protocolo son la transducción precisa de la región aferente del cerebro, que se puede verificar post hoc, y la disección rápida del cerebro al preparar cortes agudos. Este procedimiento se combina fácilmente con el marcado fluorescente de un tipo de célula individual, como una subclase particular de interneuronas. Para hacer esto, usaríamos un animal transgénico que expresa una recombinasa en ese tipo de célula en particular.Las construcciones optogenéticas entregadas viralmente han permitido rápidos avances en los campos de los sistemas y la neurociencia de circuitos.

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Investigación

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Neuroscience

Neurociencia

El video muestra un protocolo para estudiar las interacciones sinápticas y las respuestas neuronales en un corte de cerebro de hipocampo de ratón transfectado. Consiste en iluminar neuronas sensoriales de largo alcance para desencadenar potenciales de acción y registrar los potenciales postsinápticos excitatorios resultantes en la neurona registrada mediante la técnica de patch-clamp de célula completa.

Fotoestimulación y registros de pinza de parche de células enteras de neuronas en cortes de hipocampo de ratón

Este video demuestra el procedimiento para estudiar la eficiencia sináptica en la corteza entorrinal lateral (LEC) mediante la estimulación optogenética de los axones de la corteza prefrontal medial (mPFC) y el registro de las respuestas de las neuronas piramidales en la LEC. Este método combina registros de patch-clamp con activación sináptica por estimulación lumínica para estudiar la plasticidad sináptica.

Estimulación optogenética y registro electrofisiológico de eventos sinápticos en cortes de cerebro de rata

Describimos un método para caracterizar la topografía funcional y las propiedades sinápticas de los circuitos del prosencéfalo utilizando un enfoque optogenético para fotoestimular poblaciones neuronales in vitro.

Fotoestimulación de barrido láser de circuitos del prosencéfalo optogenéticamente dirigidos

Este video muestra el procedimiento de craneotomía que permite obtener imágenes crónicas de neuronas en la corteza retroesplenial de ratón utilizando microscopía in vivo de dos fotones en la línea transgénica Thy1-GFP. Este enfoque se combina con la inyección de virus adenoasociados que expresan mCherry en el hipocampo dorsal. Estas técnicas permiten el seguimiento a largo plazo de la plasticidad estructural dependiente de la experiencia en RSC.

Simultánea de dos fotones<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de entradas sinápticas y Objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial

enfoques Optogenética son ampliamente utilizados para manipular la actividad neuronal y evaluar las consecuencias para la función cerebral. Aquí, una técnica que se describe después de la expresión in vivo del activador óptico canalrodopsina, permite el análisis ex vivo de las propiedades sinápticas de largo alcance específico y conexiones neuronales locales en los circuitos relacionados con el miedo.

Ex Vivo Optogenética Disección de circuitos del miedo en rodajas de cerebro

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo sobre cómo combinar artificial microRNA mediada por ARN de interferencia con optogenetics estimular específicamente botones presinápticos con menor expresión de genes selectivos dentro de circuitos neuronales intactos.

Combinando Optogenetics con microRNAs artificiales para caracterizar los efectos de Gene caída en la función presináptica en circuitos neuronales intactas

Este protocolo describe un conjunto de métodos para identificar la conectividad funcional específica de tipo celular de entradas de largo alcance de regiones cerebrales distantes utilizando estimulaciones optogenéticas en rebanadas cerebrales ex vivo.

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices

Utilizamos electrodos de grabación y estimulación en rodajas longitudinales del cerebro del hipocampo y electrodos de registro y estimulación posicionados longitudinalmente en el hipocampo dorsal in vivo para evocar potenciales postsinápticos extracelulares y demostrar plasticidad sináptica a largo plazo a lo largo del interlamellar longitudinal CA1.

Investigación de la plasticidad sináptica a largo plazo en Interlamellar Hippocampus CA1 por grabación de campo electrofisiológica

Los cortes cerebrales ex vivo se pueden usar para estudiar los efectos de los anestésicos volátiles en las respuestas evocadas a las entradas aferentes. La optogenética se emplea para activar independientemente las aferentes talamocorticales y corticocorticales al neocórtex no primario, y las respuestas sinápticas y de red se modulan con isoflurano.

Activación optogenética de vías aferentes en cortes cerebrales y modulación de respuestas por anestésicos volátiles

Los métodos descritos aquí describen un procedimiento utilizado para revertir optogenéticamente la plasticidad inducida por la cocaína en un circuito conductualmente relevante en ratas. La estimulación óptica sostenida de baja frecuencia de las sinapsis tálamo-amígdala induce depresión a largo plazo (LTD). La LTD inducida optogenéticamente in vivo en ratas experimentadas con cocaína resultó en la posterior atenuación de la búsqueda de drogas motivada por señales.

Uso de la optogenética para revertir la neuroplasticidad e inhibir la búsqueda de cocaína en ratas

Aquí, presentamos dos protocolos para el registro de microelectrocorticografía de alta densidad (μEcoG) en ratas y ratones, incluidos los métodos quirúrgicos, de implantación y de registro. Los registros de μECoG se realizan en combinación con el registro de politrodos laminares en la corteza auditiva de la rata o con la manipulación optogenética de la actividad neuronal en la corteza somatosensorial del ratón.

Investigaciones multiescala del procesamiento cortical mediante la integración de politrodos laminares y optogenética con microelectrocorticografía en roedores

Aprende a caracterizar electrofisiológicamente sinapsis específicas usando construcciones optogenéticas virales en rebanadas cerebrales agudas de roedores. Este método permite estudiar vías de largo alcance y plasticidad sináptica con precisión.

Ex Vivo Interrogación optogenética de la transmisión sináptica de largo alcance y la plasticidad de la corteza prefrontal medial a la corteza entorrinal lateral (Video) | JoVE Journal

Ex Vivo Interrogación optogenética de la transmisión sináptica de largo alcance y la plasticidad de la corteza prefrontal medial a la corteza entorrinal lateral

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