Ensayos de inmunocitoquímica de células 3D vivas del glioma difuso de línea media infantil

El glioma difuso de la línea media es un tumor cerebral altamente invasivo. Este método ayuda a estudiar en tiempo real cómo migran e invaden las células DMG en un contexto 3D con información específica sobre el papel potencial de una molécula de adhesión clave. Mediante el uso de un reactivo de marcaje y un anticuerpo específico anti-CD44, podemos estudiar mediante imágenes de células vivas la expresión de CD44 en la membrana plasmática de las células DMG también en la migración e invasión 3D.

La aplicación de esta técnica puso de manifiesto el papel potencial de CD44 en la motilidad de estas células, lo que sugiere que podría representar una diana molecular valiosa e invasiva. Para empezar, rehidrate el ALR añadiendo 100 microlitros de agua estéril y mezcle la solución mediante pipeteo. Mezcle el anticuerpo con el ALR en el medio TSM en una placa de pocillos múltiples de fondo redondo o en un tubo ámbar y protéjalo de la luz.

Prepare una cantidad suficiente del medio para dispensar 25 microlitros por pocillo a tres veces la concentración final del ensayo y luego incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Diluir BSR en el medio TSM a una concentración de 1,5 milimolares para obtener una concentración final de 0,5 milimolares al final del ensayo. A continuación, retire suave y lentamente 75 microlitros del medio de cada pocillo, evitando tocar el fondo del pocillo donde se asienta el SN y comprobando visualmente la presencia del NS.

Agregue suavemente 25 microlitros del complejo de anticuerpos BSR y ALR a cada pocillo y deje que el complejo de anticuerpos ALR se mezcle con el medio durante dos o tres minutos. Con un microscopio invertido, asegúrese de que cada NS esté ubicado en el centro del fondo del pozo. Evite la formación de burbujas retirándolas con una aguja.

Coloque el plato sobre hielo durante cinco minutos para que el fondo del plato se enfríe. Dispense 75 microlitros de BMM por pocillo colocando una punta P200 preenfriada en la pared interna del pocillo, evitando la formación de burbujas y tocando el fondo del pocillo. Deje el plato en hielo durante cinco minutos para que el BMM se mezcle con el medio.

Con un microscopio invertido, verifique la ubicación del SN. Y si no está presente en el centro, centrifugar la placa a cuatro grados centígrados a 180 veces G durante cinco minutos. A continuación, transfiera la placa en el instrumento de análisis de células vivas colocado dentro de la incubadora a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 95% de humedad. Una vez que los pocillos estén recubiertos con BMM, corte una punta P200.

Tome 50 microlitros del medio celular y NS de cada pocillo seleccionado y transfiéralo a un pocillo de fondo plano recubierto. Verifique visualmente la presencia y la posición del NS en cada pozo. Agregue suavemente 50 microlitros de los anticuerpos BSR y ALR diluidos a cada pocillo, esperando de dos a tres minutos para que los reactivos se mezclen.

Y usando un microscopio invertido, asegúrese de que la mayoría de los SN replicados estén ubicados en el centro del pozo. Después de asegurarse de que no haya burbujas, transfiera suavemente la placa en el instrumento de análisis de células vivas como se demostró anteriormente. En el software del instrumento de análisis de células vivas, seleccione la opción de programación para adquirir, luego haga clic en la pestaña más y seleccione escanear según programación para escanear las placas con intervalos como se menciona en el manuscrito de texto.

En la ventana del software, cree o restaure el recipiente y luego haga clic en la opción Nuevo. Seleccione el tipo de escaneo esferoide, la fase más el campo claro, los canales de imagen verde para el ensayo de invasión y el objetivo 4X. Seleccione el escaneo de clonación por dilución, escriba el objetivo 4X y la fase y el verde para el ensayo de migración.

Seleccione el tipo de placa y defina los pocillos que se van a escanear resaltándolos en el mapa de la placa y, a continuación, configure la frecuencia de escaneo. Haga clic en Agregar a la programación e inicie el escaneo. Seleccione la pestaña Crear nueva definición de análisis.

A continuación, seleccione la invasión de esferoides o la aplicación de analizador básico para la invasión y la migración, respectivamente, en la pestaña. Seleccione los canales apropiados de invasión y migración en el canal de imagen. Seleccione algunas imágenes representativas de tres o cuatro pocillos para obtener una vista previa y refinar la configuración del análisis.

Para el ensayo de invasión, en la pestaña de definición de análisis, ajuste la configuración de la aplicación en los canales de campo claro y verde con la configuración mencionada en el manuscrito de texto para generar una segmentación precisa entre el esferoide y las células invasoras. Para el ensayo de migración, ajuste la configuración de la aplicación como se menciona en el manuscrito de texto en los canales de fase y verde para generar una segmentación precisa entre la confluencia y las celdas verdes. Compruebe que la configuración del análisis es correcta para el NS haciendo clic aleatoriamente en varios pozos.

Seleccione los pozos y los puntos de tiempo que desea analizar. Guarde la definición del análisis y haga clic en Finalizar. Las imágenes confocales inmunofluorescentes representativas de la expresión de CD44 en células primarias derivadas de pacientes con DMG demostraron el papel de CD44 en la migración e invasión celular.

La inmunoquímica de células vivas en 3D permite visualizar la expresión de CD44. Los marcos representativos del lapso de tiempo tanto para la migración como para la invasión muestran la presencia y ausencia de la señal fluorescente verde en la misma célula observada a lo largo del tiempo, lo que sugiere que la expresión de CD44 está activada y desactivada mientras las células migran e invaden. Los procesos de migración e invasión se siguen durante 96 horas, mostrando células QCTB-R059 con un alto nivel de CD44.

La cuantificación de la expresión de CD44 y su aumento a lo largo del tiempo se midió mediante la señal de fluorescencia verde global asociada con el ALR tanto para la migración como para la invasión. Cuando el anticuerpo anti-CD44 se utiliza en células vivas, afecta a la morfología celular, induciendo una transición de invasión mesenquimal a ameboide y una reducción de la capacidad invasiva y migratoria de estas células. El paso más crítico del método es la mezcla del reactivo de marcaje con un anticuerpo, la adición de la mezcla al Matrigel y del medio, y el acceso al instrumento de obtención de imágenes de células vivas.

Este método se puede implementar aún más mediante el uso de dos o más reactivos de marcaje distintivos y anticuerpos para investigar la interacción de las células DMG mediada por células directas y contacto. Nuestro método ofrece nuevas herramientas para investigar en 3D los mecanismos celulares y moleculares de la migración e invasión de DMG, proporcionando nuevas direcciones para inhibir su fenotipo infiltrativo.