Aplicación del movimiento pasivo de la cabeza para generar aceleraciones definidas en las cabezas de roedores
21 de julio de 2022
El presente protocolo describe un sistema de "movimiento pasivo de la cabeza" diseñado a medida, que reproduce aceleraciones mecánicas en las cabezas de los roedores generadas durante su carrera en cinta a velocidades moderadas. Permite diseccionar factores/elementos mecánicos de los efectos beneficiosos del ejercicio físico.
Nuestro protocolo ayuda a responder las preguntas de cómo el ejercicio físico apoya la homeostasis del organismo. Los sistemas nos permitieron diseccionar los efectos mecánicos directos en el cerebro de las consecuencias complejas de actividades físicas como caminar y trotar. Para comenzar, fije el acelerómetro en la parte superior de la cabeza de una rata con cinta quirúrgica.
Después de la recuperación completa de la anestesia, coloque la rata en la máquina de correr. Ajuste la cinta de correr a una velocidad moderada a 20 metros por minuto. Utilice el software de aplicación para medir la magnitud de las aceleraciones verticales a lo largo de los ejes X, Y y Z cuando la rata está ejecutando la cinta de correr.
Hacer coincidir los valores obtenidos del software con la magnitud en frecuencia de aceleración vertical en el sistema PHM. Preajuste la amplitud de oscilación de la plataforma y la velocidad de rotación de la leva en forma de hélice. Luego coloque el mouse en una posición prona con la cabeza ubicada en el oscilable y el resto del cuerpo en las plataformas estáticas.
Encienda el motor para oscilar la plataforma verticalmente y aplique PHM al ratón. En la caja de plástico transparente, configure la cámara de video a una velocidad de fotogramas de 24 FPS para grabar todo el espacio. A continuación, administre por vía intraperitoneal cinco hidroxitriptófano a un ratón.
Coloque el ratón en el armazón transparente y comience a grabar durante 30 minutos. Revise el video grabado a una velocidad de 0.5x y cuente las contracciones de la cabeza manualmente. Recupere las criosecciones del cerebro del ratón de la caja de diapositivas.
Deje los portaobjetos en toallitas limpias a temperatura ambiente hasta que las muestras se deshidraten por completo. Use una pluma bloqueadora de líquidos para dibujar un círculo alrededor del tejido crioseccionado. Luego agregue la solución TBS-T.
En la parte inferior de una bandeja, coloque toallitas húmedas para crear un ambiente húmedo para los portaobjetos. Después de una permeablización con TBS-T, agregue suero de burro al 4% para bloquear e incubar a temperatura ambiente durante una hora. Enjuague las diapositivas una vez por inmersión en TBS-T durante cinco minutos.
Luego aplique 100 microlitros de anticuerpo primario adecuadamente diluido y una mezcla de dappy en cada portaobjetos. Cubra la bandeja e incube a temperatura ambiente durante la noche. Después de la incubación, enjuague con TBS-T tres veces durante cinco minutos cada una.
Aplicar 100 microlitros de especies adecuadamente diluidas de anticuerpos secundarios fluorescentes e incubar a temperatura ambiente durante una hora. Enjuague después con TBS-T tres veces durante cinco minutos cada una, monte las diapositivas con medio de montaje y cubra las diapositivas con cubreobjetos. Después del montaje, vea la muestra bajo un microscopio de fluorescencia.
El sistema PHM se ajustó para producir picos de aceleración vertical a aproximadamente 1.0 veces G, que era equivalente a los de las cabezas de las ratas durante la carrera en la cinta rodante. La aplicación de PHM a ratones atenuó significativamente su respuesta de contracción de la cabeza en comparación con los ratones de control que representan un efecto supresor de PHM en la señalización del receptor 5-HT2A en las neuronas de la corteza prefrontal. La cinta de correr que se ejecuta en PHM mejoró significativamente la internalización del receptor 5-HT2A y las neuronas de la corteza prefrontal del ratón.
La cuantificación de las áreas positivas del receptor 5-HT2A internalizadas y asociadas a la membrana en relación con el área nueva y positiva confirmó esta observación. La inmunotinción y la cuantificación de la expresión de c-Fos en neuronas positivas para el receptor 5-HT2A mostraron que la cinta rodante que funciona en PHM regula a la baja la expresión de 5-HTP indujo la expresión de c-Fos. Este es el evento celular descendente de la activación del receptor 5-HT2A y las neuronas PFC de ratón.
La intervención mecánica se puede aplicar a las partes del cuerpo que no sean la cabeza para investigar los aspectos mecánicos de los efectos del ejercicio.
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Descripción general
Este estudio investiga cómo el ejercicio físico, específicamente correr en cinta, influye en la homeostasis del organismo mediante un sistema recién desarrollado de movimiento pasivo de la cabeza (PHM). Al simular las aceleraciones mecánicas experimentadas por las ratas, el protocolo aísla eficazmente los factores mecánicos y sus efectos específicos sobre la función cerebral.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Ejercicio físico y homeostasis
- Neurociencia de la mecanotransducción
- Impacto de los factores mecánicos en las vías de señalización cerebral
Antecedentes
- El papel de la actividad física en la regulación fisiológica
- Impactos mecánicos sobre las respuestas neuronales
- Importancia de comprender la respuesta cerebral al ejercicio
Métodos Utilizados
- Sistema pasivo de movimiento de la cabeza (PHM) de diseño personalizado
- Rodentes (ratas y ratones) como modelos biológicos
- Tinción fluorescente e inmunohistoquímica para el análisis cerebral
Resultados principales
- La PHM atenuó significativamente las respuestas de sacudida de cabeza en ratones
- Mayor internalización de los receptores 5-HT2A en neuronas de la corteza prefrontal
- Regulación a la baja de la expresión de c-Fos tras la intervención mecánica
Conclusiones
- El estudio demuestra un método válido para examinar las influencias mecánicas en el cerebro.
- Los hallazgos contribuyen a una comprensión más profunda de la fisiología del ejercicio y la señalización neuronal.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Analizar los efectos mecánicos directos del ejercicio sobre la señalización cerebral es fundamental para reducir los riesgos de los objetivos neurobiológicos y aclarar las hipótesis mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. El sistema de movimiento pasivo de la cabeza (PHM) permite la administración controlada y reproducible de aceleraciones mecánicas definidas a las cabezas de roedores, lo que respalda la confianza predictiva en los estudios de mecanotransducción. Esta capacidad aporta información para la validación de objetivos y la continuidad traslacional en programas terapéuticos relacionados con trastornos neuropsiquiátricos y con el ejercicio.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar las vías de mecanotransducción implicadas en la homeostasis cerebral inducida por el ejercicio.
- Apoya la validación funcional de la señalización del receptor de serotonina en poblaciones neuronales definidas.
- Facilita la desvinculación mecanicista de los efectos mecánicos respecto a los sistémicos del ejercicio.
- Proporciona puntos de referencia cuantitativos para la activación de vías y la internalización de receptores.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Prepara modelos validados de roedores para la evaluación neurofarmacológica posterior.
- Normaliza los parámetros de estimulación mecánica para el desarrollo reproducible de ensayos.
- Genera resultados cuantitativos, como perfiles de aceleración craneal y métricas de localización de receptores.
- Permite la evaluación confiable de los efectos de compuestos sobre vías mecanosensibles.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Alinea modelos preclínicos con estímulos mecánicos relevantes para la enfermedad observados en el ejercicio humano.
- Apoya la continuidad desde el descubrimiento mecanicista hasta la validación preclínica guiada por biomarcadores.
- Informa el avance ajustado al riesgo de candidatos neuropsiquiátricos y que imitan el ejercicio.
- Proporciona una plataforma para evaluar biomarcadores traslacionales de la mecanotransducción.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El sistema PHM se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la etapa preclínica al permitir pruebas basadas en hipótesis de la señalización mecánica en modelos de roedores, apoyando tanto la validación de dianas como el desarrollo de biomarcadores traslacionales.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis nulas para la activación mecánica de las vías de señalización cerebral.
- Selección: Proporciona una estimulación mecánica cuantitativa y reproducible para la estandarización de ensayos.
- Análisis: Ofrece resultados medibles como perfiles de aceleración, internalización de receptores y expresión de c-Fos.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos mecanicistas con modelos preclínicos relevantes para la investigación del ejercicio y de trastornos neuropsiquiátricos.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable para diversos estudios de mecanotransducción y neurobiología.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en las hipótesis mecanicistas y en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Permite protocolos estandarizados, escalables y reproducibles de estimulación mecánica.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al aclarar los efectos mecánicos directos sobre los objetivos cerebrales.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de programas neuropsiquiátricos y de efecto similar al ejercicio.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de roedores, neurobiología e imágenes cuantitativas.
- Necesita instrumentación para la estimulación mecánica controlada y microscopía de fluorescencia de alta resolución.
- Exige la estandarización entre equipos de los parámetros de estimulación y los puntos finales analíticos.
- La adaptación entre especies de roedores y paradigmas de ejercicio puede requerir la optimización del protocolo.
- La intervención mecánica se limita a regiones corporales accesibles y puede no recapitular completamente los efectos sistémicos del ejercicio.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:35
Measurement of Magnitudes of Accelerations and Adjustment of the PHM System
1:33
Quantification of Mouse Head-Twitch Response
2:03
Immunohistochemical Analysis of Prefrontal Cortex (PFC) Collected from Euthanized Mouse Brain
3:22
Results: Effect of Treadmill Running and PHM Application in Mouse PFC Neurons
4:37
Conclusion
