Name: Columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular para identificar metabolitos especializados de plantas que interactúan con el receptor B inmovilizado de tropomiosina quinasa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Aprende a preparar columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular con receptores inmovilizados para identificar metabolitos de plantas que interactúan con proteínas diana. Este método acelera el descubrimiento de compuestos bioactivos.

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Z.C.A. fue apoyado por el Consejo de Investigación Científica y Tecnológica de Turquía (TUBITAK) 2219- Programa Internacional de Becas de Investigación Postdoctoral. La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Centro Nacional de Medicina Complementaria e Integrativa de los Institutos Nacionales de Salud bajo el número de premio 1R41AT011716-01. Este trabajo también fue parcialmente apoyado por la American Society of Pharmacognosy Research Starter Grant, regis Technologies grant to L.C. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

Lukasz Ciesla colabora con Regis Technologies, el proveedor del IAM. PC. Partículas DD2.

La identificación de compuestos activos presentes en mezclas complejas de metabolitos especializados es una tarea muy desafiante23. Tradicionalmente, los compuestos individuales se aíslan y su actividad se prueba en diferentes ensayos. Este enfoque requiere mucho tiempo y es costoso y a menudo conduce al aislamiento y la identificación de los compuestos más abundantes y bien caracterizados23. Los ensayos de cribado de alto rendimiento utilizados actualmente dependen en gran...

Las mezclas botánicas son ricas en compuestos farmacológicamente activos1, sirviendo como una buena fuente para la identificación de nuevos fármacos golpea y conduce 2,3,4,5. El descubrimiento de nuevos medicamentos a partir de productos naturales ha sido un enfoque fructífero y muchos medicamentos actualmente aprobados se originaron a partir de compuestos identificados por primera vez en la naturaleza. La diversidad química de los compuestos naturales es difícil de igualar por las bibliotecas artificiales de moléculas sintetizadas químicamente. Muchos compuestos naturales interactúan y modulan los objetivos de proteínas humanas y pueden considerarse moléculas similares a fármacos optimizadas evolutivamente6. Estos compuestos naturales son particularmente adecuados para la identificación de plomo de fármacos para su uso en trastornos neurológicos6. Dos de los medicamentos actualmente aprobados por la FDA para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (EA) se derivan de alcaloides naturales, a saber: galantamina y rivastigmina (un derivado de la fisostigmina)6. L-DOPA, actualmente el medicamento más comúnmente recetado para la enfermedad de Parkinson, se identificó por primera vez a partir del frijol ancho (Vicia faba L.) 7. Pergolida y lisurida, agonistas del receptor dopaminérgico son los derivados de los alcaloides naturales del cornezuelo de centeno del hongo parásito Claviceps purpurea8. La reserpina, un alcaloide aislado de la raíz de serpiente india (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) fue uno de los primeros fármacos antipsicóticos9. Recientemente, la respuesta inmune desregulada y la inflamación sistémica se han relacionado con el desarrollo de numerosas dolencias neurológicas, como el trastorno depresivo mayor o las enfermedades neurodegenerativas10. Se ha encontrado que una dieta basada en plantas junto con otras intervenciones de estilo de vida mejora las capacidades cognitivas y funcionales en los ancianos 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Se ha encontrado que ciertas moléculas electrofílicas pertenecientes a triterpenos y polifenoles modulan las respuestas inflamatorias tanto en modelos in vitro como in vivo 12. Por ejemplo, los compuestos naturales que contienen α,β carbonilo insaturado (por ejemplo, curcumina, cinamaldehído) o grupo isotiocianato (por ejemplo, sulforafano) interfieren con la dimerización del receptor Toll-4 (TLR4) que inhibe la síntesis aguas abajo de citoquinas proinflamatorias en una línea celular pro-B dependiente de interleucina-3 murina12,22 . La evidencia epidemiológica apunta fuertemente a que los fitoquímicos dietéticos, presentes en matrices alimentarias complejas, también pueden constituir una fuente viable de nuevos fármacos6.
Uno de los principales obstáculos en la identificación de moléculas biológicamente activas presentes en los extractos de plantas, incluidos los alimentos de origen vegetal, es la complejidad de las muestras investigadas. Tradicionalmente, los compuestos individuales se aíslan, purifican y posteriormente se prueban para la actividad biológica. Este enfoque generalmente conduce a la identificación de los compuestos más abundantes y bien caracterizados. Los enfoques de descubrimiento de fármacos fenotípicos sin una diana molecular definida se basan en el fraccionamiento bioguiado de mezclas complejas23. En este enfoque, un extracto se fracciona en subfracciones menos complejas que posteriormente se prueban en ensayos fenotípicos. El aislamiento y la purificación de los compuestos activos se guían por la actividad biológica verificada en el ensayo. El conocimiento de la identidad de un objetivo farmacológico específico puede acelerar significativamente la identificación de compuestos farmacológicamente activos presentes en mezclas complejas. Esos enfoques generalmente se basan en la inmovilización del objetivo molecular, por ejemplo, una enzima, en una superficie sólida, como las perlas magnéticas23. Los objetivos inmovilizados se utilizan posteriormente en los experimentos de detección, lo que resulta en el aislamiento de compuestos que interactúan con el objetivo. Si bien este enfoque se ha utilizado ampliamente en la identificación de compuestos dirigidos a proteínas citosólicas, se ha aplicado con menos frecuencia en la identificación de sustancias químicas que interactúan con proteínas transmembrana (TMP)23. Un desafío adicional en la inmovilización de TMP se deriva del hecho de que la actividad de la proteína depende de su interacción con fosfolípidos de membrana celular y otras moléculas en la bicapa como el colesterol23,24. Es importante preservar estas interacciones sutiles entre las proteínas y su entorno de bicapa de fosfolípidos nativos cuando se intenta inmovilizar el objetivo transmembrana.
En la cromatografía de afinidad de membrana celular (CMAC) los fragmentos de membrana celular, y no las proteínas purificadas, se inmovilizan en las partículas de fase estacionaria de membrana artificial (IAM)23. Las fases estacionarias de IAM se preparan uniendo covalentemente análogos de fosfatidilcolina a sílice. Recientemente se han desarrollado nuevas clases de fases estacionarias de IAM en las que los grupos de amina libre y silanol tienen un límite final (IAM. PC. Partículas DD2). Durante la preparación de las columnas CMAC, los fragmentos de membrana celular se inmovilizan en la superficie de las partículas de IAM a través de la adsorción.
Las columnas de CMAC se han utilizado hasta la fecha para inmovilizar diferentes clases de TMP, incluidos los canales iónicos (por ejemplo, receptores nicotínicos), GPCR (por ejemplo, receptores opioides), transportadores de proteínas (por ejemplo, p-glicoproteína), etc.24. Las dianas proteicas inmovilizadas se han utilizado en la caracterización de la farmacodinámica (por ejemplo, constante de disociación, Kd) o en la determinación de la cinética de unión (kon y koff) de ligandos de moléculas pequeñas que interactúan con el objetivo, así como en el proceso de identificación de posibles nuevas derivaciones farmacológicas presentes en matrices complejas24 . Aquí presentamos la preparación de columnas CMAC con el receptor inmovilizado de tropomiosina quinasa B (TrkB), que ha surgido como un objetivo viable para el descubrimiento de fármacos para numerosos trastornos del sistema nervioso.
Estudios previos demostraron que la activación de la vía del factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)/TrkB se asocia con la mejoría de ciertas dolencias neurológicas, como la EA o el trastorno depresivo mayor 25,26,27,28. Se informó que los niveles de BDNF y su receptor TrkB de expresión disminuyen en la EA, y reducciones similares perjudican la función del hipocampo en modelos animales de AD29. Se notificó disminución de los niveles de BDNF en suero y cerebro de pacientes con EA 30,31,32. Se encontró que la sobreexpresión de Tau o la hiperfosforilación regulan a la baja la expresión de BDNF en neuronas primarias y modelos animales de EA 33,34,35. Además, se informó que el BDNF tiene efectos protectores sobre la neurotoxicidad inducida por β-amiloide in vitro e in vivo36. Se demostró que la administración directa de BDNF en el cerebro de la rata aumenta el aprendizaje y la memoria en animales con deterioro cognitivo37. BDNF / TrkB surgió como un objetivo válido para mejorar los trastornos neurológicos y psiquiátricos, incluido el28,38 d.C. Dirigirse a la vía de señalización BDNF / TrkB para el desarrollo de terapias en la EA mejorará potencialmente nuestra comprensión de la enfermedad39. Desafortunadamente, el BDNF en sí no se puede usar como tratamiento debido a sus pobres propiedades farmacocinéticas y efectos secundarios adversos40. Se han explorado activadores de moléculas pequeñas de las vías TrkB/BDNF como ligandos TrkB potenciales 41,42,43. Entre los agonistas de moléculas pequeñas probados, se ha demostrado que la 7,8-dihidroxiflavona (7,8-DHF) activa la vía BDNF/TrkB 41,44,45,46. Un derivado de 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-fenil-4H-cromona-7,8-diil bis(metilcarbamato)) está actualmente bajo consideración como un posible fármaco para la EA47. Recientemente, se demostró que varios antidepresivos funcionan a través de la unión directa a TrkB y la promoción de la señalización bdNF, enfatizando aún más la importancia de perseguir TrkB como un objetivo válido para tratar diversos trastornos neurológicos48.
El protocolo describe el proceso de ensamblaje de la columna TrkB funcional y la columna de control negativo TrkB-NULL. Las columnas se caracterizan utilizando un conocido ligando de pequeño molecular de producto natural: 7,8-DHF. Además, describimos el proceso de cribado de matrices complejas, utilizando extracto de planta como ejemplo, para la identificación de compuestos que interactúan con TrkB.

<table><tbody><tr><td>7-8 Hidrato de dihidroxiflavona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5446-10 mg</td><td>&ge; 98% (HPLC)</td></tr><tr><td>Adenosina 5'-trifosfato (ATP) sal disódica hidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383-1 g</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amonio</td><td>VWR Chemicals BDH</td><td>BDH9204-500 g</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo BDNF</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-15198-400 &mu; L</td><td>Anticuerpo primario; 2 mg/mL de concentración</td></tr><tr><td>Clorhidrato de benzamidina</td><td>hidrato Sigma-Aldrich</td><td>B6506-25 g</td><td></td></tr><tr><td>Factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) humano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3795-10 &mu; g</td><td>Recombinante, expresado en E. coli, polvo liofilizado, apto para cultivo celular</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>VWR Analítica</td><td>BDH9224-1 kg</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cólico sal sódica</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62050-100 g</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de onzas</td><td>VWR</td><td>71000-516</td><td>40 mL, 285 mm (longitud total), 32 x 140 mm (diámetro exterior x alto)</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>VWR Analytical</td><td>BDH-9232-500 g</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442-500 mL</td><td>estéril filtrado, apto para cultivo celular</td></tr><tr><td>G418 solución salina de disulfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8168-100 mL</td><td>50 mg/mL en H2O, 0,1 &mu; m filtrado, apto para cultivo celular</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>VWR Life Science</td><td>E520-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>Membrana artificial inmovilizada (IAM. PC. DD2)</td><td>Regis Technologies, Inc.</td><td>1-771050-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>VWR Analítica</td><td>BDH9244-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322425</td><td></td></tr><tr><td>Nikon C2 DUVb</td><td>Microscopio de barrido láser confocal</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra normal (10%)</td><td>Life Technologies</td><td>50197Z</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF)</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978-5 g</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>VWR Life Science</td><td>K812-500 mL</td><td>1x</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>VWR Chemicals BDH</td><td>0395-1 kg</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa</td><td>VWR Life Science Ambreso</td><td>M221-1 mL</td><td>Grado proteómico, que contiene 50 mM AEBSF, 30 y micro; M aprotonina, 1 mM bestatina, 1 mM E-64 y 1 mM leupeptina</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>medio Sigma-Aldrich</td><td>R8758-500 mL</td><td>con L-glutamina y bicarbonato de sodio, líquido, filtrado estéril, apto para cultivo celular</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario cabra anti-conejo IgG (H+L)</td><td>Invitrogen Alexa Flour Plus 488</td><td>A32731</td><td></td></tr><tr><td>SH-SY5Y Líneas celulares de neuroblastoma que expresan Trk-B</td><td>Kerafast</td><td>ECP007</td><td></td></tr><tr><td>SH-SY5Y Línea celular Trk-NULL</td><td>Kerafast</td><td>ECP005</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de diálisis de piel de serpiente</td><td>Thermo Scientific</td><td>88245</td><td>10K MWCO, diámetro interno seco de 35 mm.</td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro sódico</td><td>BDH VWR Analítica</td><td>BDH9286-2,5 kg</td><td></td></tr><tr><td>Tricornio 5/20 columna</td><td>GE Healthcare</td><td>24-4064-08</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>VWR Life Science</td><td>0497-1 kg</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tripsina-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-500 mL</td><td>0,25%, filtrado estéril, apto para cultivo celular, 2,5 g de tripsina porcina y 0,2&nbsp; g EDTA</td></tr></tbody></table>

columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular para identificar metabolitos especializados de plantas que interactúan con el receptor b inmovilizado de tropomiosina quinasa

Cellular Membrane Affinity Chromatography Columns to Identify Specialized Plant Metabolites Interacting with Immobilized Tropomyosin Kinase Receptor B

Los productos químicos sintetizados por plantas, hongos, bacterias e invertebrados marinos han sido una rica fuente de nuevos golpes y plomos de drogas. Medicamentos como las estatinas, la penicilina, el paclitaxel, la rapamicina o la artemisinina, comúnmente utilizados en la práctica médica, se han identificado y aislado por primera vez de productos naturales. Sin embargo, la identificación y el aislamiento de metabolitos especializados biológicamente activos de fuentes naturales es un proceso desafiante y lento. Tradicionalmente, los metabolitos individuales se aíslan y purifican a partir de mezclas complejas, después de la extracción de biomasa. Posteriormente, las moléculas aisladas se prueban en ensayos funcionales para verificar su actividad biológica. Aquí presentamos el uso de columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular (CMAC) para identificar compuestos biológicamente activos directamente a partir de mezclas complejas. Las columnas CMAC permiten la identificación de compuestos que interactúan con proteínas transmembrana funcionales inmovilizadas (TMP) incrustadas en su entorno de bicapa de fosfolípidos nativos. Este es un enfoque dirigido, que requiere conocer el TMP cuya actividad se pretende modular con el candidato a fármaco de molécula pequeña recientemente identificado. En este protocolo, presentamos un enfoque para preparar columnas de CMAC con el receptor de tropomiosina quinasa B (TrkB) inmovilizado, que se ha convertido en un objetivo viable para el descubrimiento de fármacos para numerosos trastornos del sistema nervioso. En este artículo, proporcionamos un protocolo detallado para ensamblar la columna CMAC con receptores TrkB inmovilizados utilizando líneas celulares de neuroblastoma que sobreexpresan los receptores TrkB. Además, presentamos el enfoque para investigar la funcionalidad de la columna y su uso en la identificación de metabolitos especializados de plantas que interactúan con los receptores TrkB.

Siguiendo el protocolo, se ensamblaron dos columnas cromatográficas CMAC: una con los fragmentos de membrana celular de neuroblastoma SH-SY5Y inmovilizados con TrkB sobreexpresado y otra con fragmentos de membrana celular SH-SY5Y TrkB-NULL. La columna CMAC correctamente ensamblada se presenta en la Figura 1 y los pasos involucrados en la inmovilización de fragmentos de membrana celular se presentan en la Figura 2.
Desde la inmovilizac...

El protocolo describe la preparación de columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular (CMAC) con fragmentos de membrana celular inmovilizados que contienen proteínas funcionales del receptor B de tropomiosina quinasa transmembrana. También se explica el uso de columnas de CMAC en la identificación de metabolitos vegetales especializados que interactúan con estos receptores y están presentes en mezclas naturales complejas.

Columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular para identificar metabolitos especializados de plantas que interactúan con el receptor B inmovilizado de tropomiosina quinasa

Chemicals synthesized by plants, fungi, bacteria, and marine invertebrates have been a rich source of new drug hits and leads. Medicines such as statins, ...

Esta vertical presenta pasos importantes en el montaje de columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular con receptores transmembrana funcionales. Estas columnas se pueden utilizar para la identificación de pequeñas moléculas presentes en extractos complejos e interactuando con receptores transmembrana inmovilizados. Las columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular aceleran la identificación de compuestos biológicamente activos presentes en mezclas complejas.El uso de columnas de cromatografía de afinidad de membrana celular puede ser de particular interés para aquellos interesados en la identificación de compuestos farmacológicamente activos presentes en matrices naturales complejas, como extractos de plantas, hongos o bacterias. Para comenzar, prepare una solución madre de benzamidina de 200 milimolares disolviendo 120 de benzamidina en cinco mililitros de agua desionizada ultrapura. Prepare una solución madre de PMSF de 10 milimolares disolviendo 0.017 gramos de PMSF en 10 mililitros de etanol en una campana de humos.Prepare el cóctel inhibidor de proteasas 100X disolviendo la mezcla de inhibidores de proteasa disponibles comercialmente en un mililitro de

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

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