Aislamiento de células primarias del músculo liso aórtico específicas del paciente y mediciones semicuantitativas de contracción en tiempo real in vitro

Este método permite a los investigadores estudiar la contracción celular de múltiples líneas celulares de pacientes simultáneamente. Nos permite estudiar las enfermedades de manera más rápida y eficiente. Esta técnica nos permite cuantificar la contracción celular en tiempo real.

En una hora, podemos obtener los valores de contracción de docenas de células. Demostramos por primera vez que la contracción de las células musculares está disminuida en un grupo de pacientes con aneurismas aórticos. Esto puede ser un nuevo biomarcador o objetivo para la terapia médica.

Comience esterilizando dos pares de pinzas quirúrgicas y un bisturí sumergiéndolas en etanol al 70% y posteriormente secándolas. A continuación, pipetee dos mililitros de medio SMC en una placa de Petri en la que se realizará la disección del tejido. A continuación pipete 2,5 mililitros de medio SMC en dos matraces T-25.

Gire los matraces alrededor para que el pequeño volumen de medio cubra toda la superficie. Inspeccione visualmente la biopsia, identificando las tres capas aórticas por la presencia de placas ateroscleróticas en el lado íntimo y tejido conectivo viscoso en el lado adventicio para distinguir las capas. Para aislar las SMC de los medios, retire las otras dos capas colocando primero el tejido con placa íntima hacia arriba, luego retire la placa sólida alejándola del tejido con fórceps mientras empuja el tejido hacia abajo con el segundo par de fórceps hasta que la capa medial uniforme rosada sea visible.

Ahora voltee el tejido y repita el mismo procedimiento sacando la capa adventicia, asegurándose de eliminar todas las partes visibles en tantos intentos como sea necesario, ya que esta capa no se desprenderá de los medios fácilmente. Una vez que la capa de medios esté aislada, corte el tejido en cubos presionando el medio hacia abajo con fórceps y cortando el tejido en una dirección usando el bisturí haciendo cortes unidireccionales limpios para minimizar el daño. Coloque de 10 a 20 de estas piezas de tejido en el cuarto superior de la escama T-25 usando fórceps.

Después de esterilizar dos pares de pinzas quirúrgicas y un bisturí como se describió anteriormente, pipetee dos mililitros de medio fibroblasto en una placa de Petri en la que se realizará la disección de tejidos. Luego pipetee 2.5 mililitros de medio de fibroblastos en dos matraces T-25 y gire los matraces alrededor para que el pequeño volumen de medio cubra toda la superficie. Inspeccione visualmente la biopsia para identificar la epidermis con una superficie de piel reconocible, a veces con vello visible, luego busque grasa subcutánea amarilla y viscosa en el lado opuesto.

La capa entre la epidermis y la grasa subcutánea es la dermis, la fuente de fibroblastos viables. Para aislar los fibroblastos de la dermis, retire las otras dos capas colocando el tejido en el lado de la dermis para que las tres capas sean visibles. Luego sostenga el tejido con fórceps y corte toda la epidermis en una línea limpia sin dañar el tejido.

Ahora voltee el tejido y repita el mismo procedimiento cortando dentro de la dermis paralela al borde con la grasa subcutánea. Una vez que la dermis está aislada, corte el tejido en cubos presionando el tejido hacia abajo con fórceps y cortando el tejido en una dirección usando el bisturí. Luego coloque de 10 a 20 de estas piezas de tejido en el cuarto superior del matraz T-25 usando las pinzas.

Cuente las células utilizando un contador celular automatizado y siembre los SMC por triplicado a una densidad de siembra de 30, 000 células por pozo en 200 microlitros de medio SMC en la placa ECIS recubierta de gelatina. Coloque la placa con los SMC en el soporte de 96 pocillos del ECIS en la incubadora de cultivo celular. Haga doble clic en el software ECIS Applied BioPhysics para abrir el programa y pulse el botón Configuración.

Compruebe si todos los electrodos tienen contacto con el soporte en el panel inferior izquierdo etiquetado como Configuración de pozo. Si los electrodos no están conectados correctamente, ajuste la placa en el soporte antes de comenzar la medición. Ahora seleccione el tipo de placa en el mismo panel haciendo clic en Tipo de matriz.

A continuación, prepare dos pipetas colocadas a dos microlitros y 150 microlitros de volumen. Antes de iniciar la estimulación, presione Marcar en el software y coloque un comentario. Para estimular las células, retire la tapa y colóquela sobre una superficie estéril dentro de la incubadora.

Luego induzca la contracción de SMC pipeteando dos microlitros de la solución de trabajo de ionomicina en cada pozo lo más rápido posible. Una vez que todas las células hayan sido estimuladas, mezcle el medio en los pocillos usando la segunda pipeta. Para determinar la reproducibilidad de la medición interexperimental, se trazaron dos mediciones independientes de todas las líneas celulares de control y paciente incluidas como una gráfica de Bland-Altman, lo que demuestra que este método no mostró variabilidad fuera del intervalo de confianza, a excepción de una línea celular atípica.

Dos pozos sembrados con el mismo experimento y estimulados simultáneamente mostraron prácticamente la misma curva de respuesta contractual. Para validar si la respuesta mostrada fue una contracción y no estrés osmótico debido a la estimulación con ionomicina, el medio se reemplazó después de la estimulación y se registró el comportamiento de las células, lo que mostró que las células estimuladas comenzaron a extenderse sobre el electrodo nuevamente. La respuesta contráctil en SMC derivada de aortas sanas y no dilatadas mostró una respuesta mediana del 61% en comparación con la respuesta mediana del 52% de los pacientes con aneurisma aórtico abdominal.

La respuesta contráctil media del grupo control se utilizó para identificar a cuatro pacientes que tenían valores de contracción más bajos que los valores normales. El análisis de Western blot y la posterior cuantificación confirmaron que las células expresan marcadores SMC. Para determinar la capacidad proliferativa del SMC, se realizó qPCR para Ki67.

La expresión de Ki67 fue detectable en todas las células, pero no se correlacionó con la salida contráctil. Al estimular las células para la contracción, recuerde no pipetear demasiados pozos al mismo tiempo y trate de pipetear lo más rápido posible. Este procedimiento puede necesitar algo de práctica.

Utilizando este método, hemos dividido a los pacientes en función de su contracción y para reducir la contracción normal, lo que nos permitió investigar a estos pacientes y los vínculos con sus características clínicas, como el tabaquismo.