Cuantificación de parámetros vasculares en retinas de monte entero de ratones con retinopatías no proliferativas y proliferativas

Este artículo describe un ensayo de tinción de lectina bien establecido y reproducible para las preparaciones retinianas de montaje completo y los protocolos necesarios para la medición cuantitativa de los parámetros vasculares frecuentemente alterados en las retinopatías proliferativas y no proliferativas.

En las retinopatías, las alteraciones vasculares son el primer signo que detectan los médicos. Siguen la progresión de la enfermedad y eligen un tratamiento de acuerdo con estos cambios. Se han desarrollado varios modelos animales con el fin de estudiar diferentes etapas de la patología.

En este trabajo, vamos a mostrar cómo medir diferentes alteraciones vasculares. Para eso, vamos a emplear dos modelos animales. Uno de ellos es el modelo de ratón de retinopatía inducida por oxígeno, que reproduce la retinopatía del prematuro y algunos aspectos de la retinopatía diabética proliferativa.

Aquí, vamos a medir las áreas avasculares, las áreas neovasculares y la dilatación y tortuosidad de las arteriolas. En nuestro laboratorio se desarrolló un modelo de ratón con síndrome metabólico, que induce una retinopatía no proliferativa. La densidad vascular y la ramificación fueron evaluadas en este trabajo.

Al sacrificar ratones, enucleatizar con tijeras. Fije los ojos enucleados con paraformaldehído recién preparado durante una hora a temperatura ambiente. Bajo el microscopio de disección, retire las córneas con tijeras cortando a lo largo del limbo y diseccione todas las retinas.

Deseche el segmento anterior del ojo y luego separe la retina de la COROIDES RPE. Coloque las retinas en tubos de 200 microlitros. Luego bloquee y permeabilice las retinas en 100 microlitros de TBS que contienen 5% de albúmina sérica bovina Tritón durante seis horas a cuatro grados con agitación suave en el agitador.

Luego invierta el tubo para colocar la retina en la copa y retire la solución bloqueadora con pipeta. Añadir una solución de 100 microlitros que contenga isolectina. Envuelva los tubos con papel de aluminio para proteger las muestras de la luz.

Incubar las retinas con solución de lectina durante la noche a cuatro grados con agitación suave en agitador. Lave las retinas con 100 microlitros de TBS-Triton durante 20 minutos con agitación suave en el agitador. Repita este paso tres veces.

Coloque la retina en un portaobjetos y agregue una gota de PBS. Bajo el microscopio de disección, realice cuatro cortes igualmente distantes desde los bordes de la retina hacia el nervio óptico. Para desplegar los pétalos de la retina, use fórceps o pequeños trozos de papel de filtro.

Asegúrese de que el lado del fotorreceptor esté hacia abajo. Retire el PBS restante de la diapositiva con papel de filtro. A continuación, agregue una mediana de montaje y un deslizamiento de cubierta.

Deja secar durante una hora a temperatura ambiente. Guarde los toboganes a cuatro grados protegidos de la luz. En el microscopio confocal, coloque el portaobjetos en la placa boca abajo.

Enfoque el plexo superior de la vasculatura retiniana y seleccione un área para iniciar la adquisición de la imagen. Establezca parámetros generales del láser en el software. Establezca las coordenadas en los ejes X, Y y Z.

Inicialice el escaneo. Una vez que finalice el proceso de escaneo, abra la imagen y guárdela con una extensión preferida. En el software ImageJ FIJI, vaya a la barra de menús y haga clic en Archivo, Abrir.

Seleccione la imagen que desea procesar. En la ventana Opción de importación de bioformatos, seleccione Mostrar metadatos OME-XML y haga clic en OK.In la ventana Metadatos OME, busque información sobre el tamaño de píxel. Copie estos datos.

Para la calibración de la imagen, vaya a la barra de menús y seleccione Propiedades de la imagen. Copie la información y haga clic en Aceptar. Asigne una lut preferida a la imagen. Para visualizar toda la pila en una sola imagen, vaya a la barra de menús y seleccione Imagen, Pilas, Proyecto Z.

En la ventana de proyección que se muestra, seleccione todas las pilas donde se visualizan los recipientes. En Tipo de proyección, elija Intensidad media y haga clic en Aceptar. Vaya a la barra de menús, Imagen, Ajustar, Brillo / Contraste. Haga clic en Aplicar y guarde los cambios.

Copie los parámetros seleccionados para el brillo y el contraste. Estos deben ser idénticos para todas las imágenes. En la barra de menús, elija la herramienta Varita.

Seleccione el área de la retina que carece de vasos formados. Presione T en el teclado para grabar las áreas seleccionadas en el Administrador de ROI. Haga clic en Medir en el Administrador de ROI para obtener la información del área avascular.

Repita estos pasos para medir el área total de la retina. En la barra de menús, elija la herramienta Varita. Amplíe la imagen para visualizar mejor los neovasos.

Seleccione los neovasos uno por uno con la herramienta Varita. Presione la letra T en el teclado para grabar el área seleccionada en el Administrador de ROI. Haga clic en Medir en el Administrador de ROI para obtener los datos del área.

En la barra de menús, seleccione la herramienta Línea recta. Amplíe la imagen para visualizar mejor la pared del recipiente. Realizar tres líneas transversales al buque principal antes del primer ramal.

Presione T en el teclado para grabar las áreas seleccionadas en el Administrador de ROI. Haga clic en Medir en el Administrador de ROI para obtener los datos de distancia. En la barra de menús, haga clic en el icono de la herramienta Línea recta con el botón derecho del ratón y seleccione Línea segmentada.

Dibuje una línea dentro del vaso desde el nervio óptico hasta la primera ramificación del vaso, siguiendo la forma vascular. Presione la letra T en el teclado para grabar el área seleccionada en el Administrador de ROI. En la barra de menús, seleccione la herramienta Línea recta.

Dibuje una línea desde el nervio óptico hasta la ramificación del primer vaso. Presione la letra T en el teclado para grabar el área seleccionada en el Administrador de ROI. Haga clic en Medir en el Gestor de ROI para obtener los datos de distancias.

Con la herramienta Oval de la barra de menús, defina un área aplicada por igual a todas las condiciones experimentales. El área seleccionada debe ser un círculo concéntrico dibujado alrededor del nervio óptico. Presione la letra T en el teclado para grabar el área seleccionada en el Administrador de ROI.

Manualmente, cuente el número de ramas primarias que surgen de los vasos principales dentro del área de selección. Transforme la imagen en modo de 8 bits. Vaya a Plugins en la barra de menú, seleccione Análisis de vasos, Densidad vascular.

Defina un área con la herramienta Cuadrado de la barra de menús donde desea medir la densidad del recipiente. Haga clic en Aceptar. El programa mostrará una nueva ventana con la información requerida. En el primer ejemplo experimental, se empleó el modelo de ratón de retinopatía inducida por oxígeno.

Las inyecciones intravítreas se realizaron en el día 12 postnatal para determinar la efectividad de un fármaco como antiangiogénico. Los ratones inyectados con vehículo se emplearon como control. Las áreas avasculares se definen como las zonas que carecen de vasos sanguíneos retinianos.

A partir de las imágenes adquiridas, las áreas avasculares se pueden cuantificar como la suma de las regiones sin vasos dividido el área total de la retina. Las áreas con daños mecánicos también muestran ausencia de embarcaciones. Para identificar áreas dañadas, analice la integridad de las capas neuronales con tinción de Hoechst.

Los neovasos son vasos de pequeño calibre que se originan en vasos preexistentes del plexo vascular superior. Calculamos el área ocupada por los mechones de neovasos cuantificando el área neovascular de la retina ocupada por el área total de la retina. Como la forma y el tamaño de los neovasos son variables, ocasionalmente, pueden verse similares a los escombros y artefactos.

Para distinguir los neovasos, verifique que el mechón crezca a partir de un recipiente maduro. Para el análisis de la dilatación, medimos el diámetro del vaso principal a tres alturas antes de la primera rama. Los investigadores deben definir una distancia predeterminada para medir el diámetro del vaso con el fin de reducir la variabilidad entre los resultados.

Idealmente, el punto más alejado del nervio óptico debe ser de alrededor de 300 micrómetros. Sugerimos realizar el análisis, y más tarde, el promedio de al menos seis animales por condición. En cuanto a la tortuosidad, medimos la distancia recorrida por el vaso principal siguiendo su forma, respecto a la distancia en línea recta entre el nervio óptico y el primer punto de ramificación.

Como podemos ver en la imagen, existe heterogeneidad en la sinuosidad de los vasos principales. Para obtener un resultado representativo, se deben cuantificar no menos de seis ratones por condición. Los últimos parámetros, ramificación vascular y densidad, se analizaron en un modelo de síndrome metabólico que presenta retinopatía no proliferativa.

Para la medición de la ramificación vascular, definimos el área de cuantificación dibujando un círculo concéntrico, y luego contamos, una por una, las ramas primarias que surgen de un vaso central principal. A partir de las imágenes adquiridas, se cuantificó la densidad vascular como el área ocupada por los vasos divididos por el área del ROI, que se posicionó en diferentes lugares en cada microfotografía. Evite cuantificar áreas con daños mecánicos.

Si hay más de dos áreas con punciones, se debe descartar la retina. En resumen, en este artículo hemos mostrado técnicas clásicas, bien establecidas y reproducibles para cuantificar algunos de los parámetros más relevantes teniendo en cuenta en la práctica clínica.