Name: Imágenes en vivo y cuantificación de la infección viral en ratones transgénicos K18 hACE2 utilizando SARS-CoV-2 recombinante que expresa el reportero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprenda a realizar imágenes en vivo y cuantificación de infección viral en ratones transgénicos K18 hACE2 utilizando SARS-CoV-2 recombinante con reportero. Este método permite evaluar terapéuticas contra el SARS-CoV-2.

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Nos gustaría agradecer a los miembros de nuestro instituto (Instituto de Investigación Biomédica de Texas) por sus esfuerzos para mantener nuestras instalaciones completamente operativas y seguras durante la pandemia de COVID-19. También nos gustaría agradecer a nuestro Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) y hechizo (IACUC) por revisar nuestros protocolos de una manera eficiente en el tiempo. Agradecemos al Dr. Thomas Moran de la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai por proporcionar el anticuerpo monoclonal de la proteína 1C7C7 (N) de reactiva cruzada del SARS-CoV. La investigación del SARS-CoV-2 en el laboratorio de Martínez-Sobrido cuenta actualmente con el apoyo de las subvenciones del NIAID/NIH RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 y R43AI165089-01; el Departamento de Defensa (DoD) otorga W81XWH2110095 y W81XWH2110103; la Asociación de San Antonio para La Terapéutica de Precisión; el Foro del Instituto de Investigación Biomédica de Texas; el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en San Antonio; la Fundación Médica San Antonio; y por el Centro de Investigación sobre Patogénesis y Transmisión de la Influenza (CRIPT), un Centro de Excelencia para la Investigación y Respuesta a la Influenza financiado por el NIAID (CEIRR, contrato # 75N93021C00014).

Los protocolos que involucran ratones transgénicos K18 hACE2 fueron aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) del Instituto de Investigación Biomédica de Texas (TBRI) y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC). Todos los experimentos siguen las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigaciones40. Se requiere el equipo de protección personal (EPP) adecuado cuando se trabaja con ratones.
1. Uso de ratones transgénicos K18 hACE2
<ol><li>Comprar y mantener ratones hembra de 4-6 semanas de edad B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J (ratones transgénicos K18 hACE2) en un centro de cuidado animal de nivel de bioseguridad (BSL)-2 en condiciones específicas libres de patógenos.<ol>
<li>Después de su llegada a las instalaciones de BSL2, permita que los animales se aclimaten durante 7 días y transfiéralos a la instalación de animales BSL-3 para infecciones y otros procedimientos experimentales.</li>
		<li>Siguiendo los protocolos de la IACUC, coloque 4 ratones por jaula. Para asegurarse de que el animal ha fallecido, después de la infección de ratones con rSARS-CoV-2 y las imágenes in vivo , eutanasiar a los animales con una dosis letal de Fatal-Plus (>100 mg / kg).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bioseguridad
NOTA: En este manuscrito, rSARS-CoV-2 se genera utilizando los sistemas genéticos inversos basados en BAC para la cepa SARS-CoV-2 USA-WA1/2020, como se describió anteriormente37. Todos los procedimientos in vivo que involucran infecciones por rSARS-CoV-2 / Nluc o rSARS-CoV-2 / Venus deben realizarse en un gabinete de seguridad biológica bajo condiciones BSL-3.
<ol><li>Limpie el gabinete de bioseguridad con 2% de Wexicide y 70% de desinfectante de etanol secuencialmente antes y después de realizar todos los procedimientos experimentales descritos en este artículo.</li>
	<li>Esterilizar todo el material de disección (tijeras, pinzas de disección, etc.) y el homogeneizador antes y después de cada uso.</li>
	<li>Limpie la cámara de aislamiento y desinfecte con tabletas MB10 antes y después de cada uso de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Deseche todo el material biológico producido durante los procedimientos siguiendo las directrices de IBC e IACUC.</li>
</ol>3. Caracterización in vivo de rSARS-CoV-2
<ol><li>Infecciones de ratón<ol>
<li>Coloque ratones transgénicos K18 hACE2 hembra de 4 a 6 semanas de edad en jaulas etiquetadas, identifique a los ratones en cada jaula usando un código de punción en el oído y coloque 4 ratones por jaula. Use un grupo de ratones para el peso corporal y la supervivencia y otro grupo de animales para la titulación viral y las imágenes.</li>
		<li>Antes de la infección, afeite el pecho de los ratones en el lado ventral desde el pezón pectoral hasta el área del pezón inguinal para facilitar la señal de bioluminiscencia.</li>
		<li>Preparar el inóculo rSARS-CoV-2 con 105 unidades formadoras de placa (PFU)/ratón en condiciones estériles en un volumen total de 50 μL utilizando solución salina tampón de fosfato estéril 1x (PBS). NOTA: Calcule la cantidad de rSARS-CoV-2 que se utilizará en la dilución viral con la fórmula: virus necesario = (105 PFU por ratón / 50 μL) x volumen final) / título viral de stock.</li>
		<li>Mantenga el inóculo del virus frío sobre hielo.</li>
		<li>Utilice los ratones infectados con simulacros (1x PBS) y rSARS-CoV-2 / WT como controles internos. Coloque a los ratones infectados con simulacros en una jaula separada de los ratones infectados con rSARS-CoV-2.</li>
		<li>Anestesiar a los ratones utilizando sedación gaseosa de isoflurano al 5% en una cámara de anestesia y mantener con isoflurano al 3%.</li>
		<li>Una vez confirmada la reacción postural y el reflejo de enderezamiento, coloque al ratón en la posición de recostado dorsal.</li>
		<li>Desalibre el cuello del ratón entre el dedo índice y el pulgar y sostenga la cola contra la palma de la mano con el dedo meñique para sostener al animal en una posición dorsal.</li>
		<li>Coloque la punta de la pipeta que contiene 50 μL del inóculo del virus en la fosa nasal y expulse lentamente la solución. Asegúrese de que el inóculo del virus se inhala y no hay reflujo observando la caída del inóculo desapareciendo.</li>
	</ol></li>
	<li>Monitorización de bioluminiscencia de ratones transgénicos K18 hACE2 infectados con rSARS-CoV-2/Nluc (Figura 1 y Figura 2) Nota : este experimento sigue la representación esquemática y utiliza los virus que se muestran en la figura 1. Se requiere una fijación de anestesia isoflurano para el sistema de imágenes in vivo (IVIS). Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre los instrumentos y sistemas requeridos.<ol>
<li>Inicie el software de imágenes y configure los parámetros, haga clic en modo de imagen en Bioluminiscencia, abra el filtro y establezca el tiempo de exposición en automático.</li>
		<li>Al inicializar la máquina IVIS, coloque los ratones en la cámara de aislamiento mientras aún están dentro del gabinete de bioseguridad. Inducir ratones con isoflurano a una concentración del 5%. Una vez confirmada la pérdida de la reacción postural y el reflejo corrector, mantener con isoflurano al 3%.</li>
		<li>Una vez anestesiados los ratones, sacarlos de la cámara de aislamiento y administrar retro-orbitalmente el sustrato de luciferasa diluido 1:10 en 1x PBS (volumen final 100 μL/ratón) con una aguja de 25 G.</li>
		<li>Después de la administración de sustrato de luciferasa, coloque a los ratones de nuevo en la cámara de aislamiento con el pecho hacia arriba y la cavidad nasal dentro del cono del colector para mantener al animal anestesiado durante el procedimiento de imagen.</li>
		<li>Transfiera la cámara de aislamiento a la máquina IVIS e instantáneamente después de cerrar la puerta del generador de imágenes IVIS, seleccione Adquirir en el programa de software que desea inicializar (Figura 2A).</li>
		<li>Para analizar las imágenes de bioluminiscencia adquiridas, utilice la herramienta ROI (región de interés) en el software para designar la señal precisa y medir el flujo (Figura 2B).</li>
		<li>Haga clic en Medir y permita que el sistema comience a evaluar la bioluminiscencia en fotones para proporcionar la emisión absoluta de fotones comparable a las mediciones de salida proporcionadas por los diversos parámetros.</li>
		<li>Imagen de ratones a los 1, 2, 4 y 6 días después de la infección.</li>
		<li>Después de la toma de imágenes, coloque a los ratones de nuevo en la jaula.</li>
	</ol></li>
	<li>Análisis de fluorescencia en ratones transgénicos K18 hACE2 infectados con rSARS-CoV-2/Venus (Figura 3 y Figura 4) NOTA: Este experimento sigue la representación esquemática y rSARS-CoV-2 que se muestra en la Figura 3. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre los instrumentos y sistemas requeridos.<ol>
<li>Inicie el software de imágenes y configure los parámetros, configure los filtros de excitación (500 nm) y emisión (530 nm), haga clic en el modo de imagen en Fluorescencia y establezca el tiempo de exposición en automático.</li>
		<li>Practicar la eutanasia intraperitoneal a los ratones utilizando una dosis letal de Fatal-Plus (>100 mg/kg). Después de la eutanasia, desinfecte el sitio de la incisión con etanol al 70%.</li>
		<li>Usando pinzas, tire de la piel, haga una incisión desde el esternón hasta el abdomen y corte la incisión desde los lados con tijeras. Corte la vena hepática para minimizar la cantidad de sangre en los pulmones y evitar señales de fondo altas durante las imágenes.</li>
		<li>Usando tijeras, corte el esternón y abra la caja torácica. A continuación, corte el extremo de la tráquea con tijeras y retire los pulmones con pinzas.</li>
		<li>Coloque los pulmones extirpados en una placa de 6 pocillos que contenga 2 ml de 1x PBS y enjuague para eliminar el exceso de sangre. Minimizar la posibilidad de contaminación entre muestras desinfectando y limpiando las herramientas quirúrgicas entre muestras utilizando etanol al 70%.</li>
		<li>Después de inicializar la máquina IVIS, coloque los pulmones en una bandeja negra y separe los tejidos entre sí.</li>
		<li>Coloque la bandeja dentro de la cámara de aislamiento dentro del gabinete de bioseguridad y luego transfiera la cámara de aislamiento al IVIS. Cierre la puerta y haga clic en Adquirir para iniciar el sistema de imágenes (Figura 4A).</li>
		<li>Para analizar la fluorescencia, utilice la herramienta de ROI y dibuje ROI alrededor de cada uno de los pulmones individuales. Mida cada ROI manualmente y luego use los valores de eficiencia radiante promedio dados y reste los de los ratones infectados simulados (Figura 4B).</li>
		<li>Una vez que se completen las imágenes, coloque los tejidos en hielo para el análisis el mismo día o en un criotubo para la congelación de hielo seco para almacenarlos a -80 ° C para su posterior procesamiento.</li>
	</ol></li>
	<li>Imágenes de campo brillante pulmonar y puntuación de patología de ratones transgénicos K18 hACE2 infectados con rSARS-CoV-2/Nluc (Figura 2A-C) y rSARS-CoV-2/Venus (Figura 4A-C)<ol>
<li>Después de obtener imágenes de bioluminiscencia de ratones infectados con rSARS-CoV-2 / Nluc, rSARS-CoV-2 / WT y simulados infectados, devuelva a los ratones a sus jaulas. Proceda con la eutanasia y la imagen de campo brillante ex vivo de los pulmones de los ratones (Figura 2A).</li>
		<li>Después de obtener imágenes de la fluorescencia ex vivo de los pulmones de ratones infectados, tome imágenes de campo brillante de los pulmones (Figura 4A).</li>
		<li>Analizar las lesiones macroscópicas en la superficie del pulmón utilizando ImageJ (Figuras 2C y 4C).</li>
		<li>Abra la imagen pulmonar que se analizará en ImageJ.</li>
		<li>Calcule la relación entre píxeles y cm, utilice la herramienta Recto y mida la longitud real de la imagen.</li>
		<li>Después de seleccionar, haga clic en Analizar > medir para calcular la longitud de los píxeles para la longitud.</li>
		<li>Haga clic en Análisis > Establecer escala e ingrese los números calculados a partir del paso anterior.</li>
		<li>Utilice la herramienta Selecciones a mano alzada y seleccione toda la superficie pulmonar. Haga clic en Analizar > Medir para medir el área pulmonar total.</li>
		<li>Haga clic en Editar > Selección > Hacer inverso para seleccionar el resto del área pulmonar, luego presione eliminar o retroceso para eliminar el fondo.</li>
		<li>Elimine el área seleccionada y, a continuación, haga clic en imagen > Ajustar > umbral de color.</li>
		<li>Para seleccionar el área patológica de la lesión, ajuste el brillo a un mínimo (entre 1 a 50) y un máximo (entre 50 a 200), dependiendo de los niveles de congestión y hemorragias presentes.</li>
		<li>Una vez seleccionadas las lesiones patológicas, haga clic en Seleccionar en la parte inferior del panel de color del umbral, luego haga clic en Analizar > Medir para medir las áreas patológicas.</li>
		<li>Calcular el porcentaje de lesiones macroscópicas con la fórmula: % de área patológica = (medición del área patológica/superficie pulmonar total) x 100.</li>
	</ol></li>
	<li>Valoraciones virales (Figura 2D y Figura 4D)<ol>
<li>Tras la toma de imágenes, complete la eutanasia de los ratones y recoja los pulmones, el cerebro y la mucosa nasal.</li>
		<li>Coloque los pulmones, el cerebro y la mucosa nasal en homogeneizadores de tejido estéril separados y agregue 1 ml de PBS frío 1x.</li>
		<li>Homogeneizar las muestras centrifugando a 21.500 x g durante 10 min a los restos celulares de pellets. Recoger y transferir los sobrenadantes a un nuevo tubo estéril y desechar el pellet.</li>
		<li>Si las valoraciones virales se realizan el mismo día, guarde los sobrenadantes a 4 °C. Alternativamente, congele el sobrenadante de las muestras homogeneizadas a -80 °C hasta que se evalúe más tarde.</li>
		<li>Utilizando los sobrenadantes obtenidos de los homogeneizados tisulares se realizan diluciones seriadas 10 veces e infectan monocapas confluentes de células Vero E6 con 1 mL de cada dilución del sobrenadante (formato de placa de 6 pocillos, 1,2 × 106 células/pozo, triplicatos).</li>
		<li>Deje que el virus se adsorba durante 1 h a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% de CO2 .</li>
		<li>Después de la adsorción viral, lave las células con 1 ml de 1x PBS e incube en 2 ml de medios post-infección que contengan 1% de agar en la incubadora humidificada de 5% de CO2 a 37 °C durante 72 h.</li>
		<li>Después de la incubación, inactivar las placas en formalina tamponada neutra al 10% durante 24 h a 4 °C, asegúrese de que toda la placa esté sumergida.</li>
		<li>Saque las placas de BSL3 y lave las células tres veces con 1 ml de 1x PBS y permeabilice con 1 ml de Tritón X-100 al 0,5% durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Bloquear las células con 1 mL de albúmina sérica bovina (BSA) al 2,5% en 1x PBS durante 1 h a 37 °C, seguida de incubación en 1 mL de 1 μg/mL del anticuerpo monoclonal de reactiva cruzada de la proteína nucleocápside (N) del SARS-CoV (1C7C7), diluido en BSA al 2,5% durante 1 h a 37 °C.</li>
		<li>Lave las células tres veces con 1 ml de 1x PBS y desarrolle las placas utilizando el kit ABC y el kit de sustrato DAB peroxidasa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Calcule los títulos virales como PFU/mL. NOTA: Calcule con la fórmula PFU/mL = factor de dilución x número de placas x (1 mL/volumen inóculo).</li>
	</ol></li>
	<li>Actividad de Nluc en tejidos de ratones transgénicos K18 hACE2 infectados con rSARS-CoV-2/Nluc (Figura 2E)<ol>
<li>Cuantificar la presencia de Nluc en los homogeneizados de órganos de ratones transgénicos RSARS-CoV-2/WT y rSARS-CoV-2/Nluc infectados con K18 hACE2 utilizando un ensayo de luciferasa siguiendo las instrucciones de los fabricantes.</li>
	</ol></li>
	<li>Evaluación de la morbilidad y mortalidad (Figura 2F, G y Figura 4E, F)<ol>
<li>Infectar por vía intranasal a ratones transgénicos K18 hACE2 hembra de 4-6 semanas de edad con 105 PFU de rSARS-CoV-2/WT, rSARS-CoV-2/Venus, rSARS-CoV-2/Nluc, o simulados infectados como se describe en la sección 3.1.</li>
		<li>Monitoree y pese a los ratones durante 12 días al mismo tiempo para minimizar la variación de peso debido a la ingestión de alimentos. Sacrificar a los ratones que pierden el 25% de su peso corporal inicial ya que han alcanzado un punto final humanitario y señalar que estos ratones sucumben a la infección viral.</li>
		<li>Después de 12 días, sacrificar a los ratones que sobreviven a la infección viral y calcular el % de cambio de peso corporal y supervivencia.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Chiem, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bifluorescent-based+assay+for+the+identification+of+neutralizing+antibodies+against+SARS-CoV-2+variants+of+concern+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo.</a> Journal of Virology. , (2021).</li>
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<li>Ye, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+SARS-CoV-2+infection+dynamic+in+vivo+using+reporter-expressing+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).</li>
</ol>

Los autores declaran que la investigación se realizó en ausencia de cualquier conflicto de intereses comercial, financiero y no financiero, o personal en relación con el trabajo descrito.

Este protocolo demuestra la viabilidad de utilizar estos genes reporteros que expresan rSARS-CoV-2 para monitorear infecciones virales in vivo. Ambos virus recombinantes que expresan reporteros proporcionan una excelente herramienta para estudiar las infecciones por SARS-CoV-2 in vivo. Los sistemas de imágenes ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) e in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) descritos representan una excelente opción para comprender la dinámica de la infección por SARS-CoV-2, la patogénesis vir...

El coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) es un virus de ARN monocatenario envuelto, de sentido positivo y que pertenece al linaje Betacoronavirus de la familia Coronaviridae 1. Esta familia viral se divide en Alfa-, Beta-, Gamma-, y Delta-coronavirus1. Los alfa y betacoronavirus infectan principalmente a los mamíferos, mientras que los gamma y deltacoronavirus infectan casi exclusivamente a las aves2. Hasta la fecha, siete coronavirus (CoV) han cruzado las barreras de las especies y han surgido como coronavirus humanos (HCoV): dos alfa-CoV (HCoV-229E y HCoV-NL63) y cinco beta-CoV (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, coronavirus del síndrome respiratorio de Oriente Medio [MERS-CoV] y SARS-CoV-2)3,4,5,6. El SARS-CoV, el MERS-CoV y el SARS-CoV-2 son altamente patógenos y causan una infección grave del tracto respiratorio inferior7. Antes de la aparición del SARS-CoV-2, hubo dos brotes epidémicos causados por coV: SARS-CoV en Guangdong Providence, China, de 2002 a 2003, con una tasa de letalidad (CFR) de alrededor del 9,7%; y el MERS-CoV en Oriente Medio desde 2012 hasta la actualidad, con un MCR de alrededor del 34%7,8. El SARS-CoV-2 tiene un CFR general entre el 3,4% y el 49%, y las condiciones subyacentes contribuyen a un CFRmás alto de 8,9. Desde su descubrimiento en diciembre de 2019, en Wuhan, China, el SARS-CoV-2 ha sido responsable de más de 242 millones de infecciones humanas y más de 4,9 millones de muertes humanas en todo el mundo 7,10,11,12. En particular, desde finales de 2020, las nuevas variantes de preocupación (VoC) y las variantes de interés (VoI) del SARS-CoV-2 han afectado las características del virus, incluida la transmisión y la antigenicidad 9,13, y la dirección general de la pandemia de COVID-19. Para el tratamiento de las infecciones por SARS-CoV-2, actualmente solo hay un Estados Unidos (EE. UU.) Antiviral terapéutico (remdesivir) de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) y un medicamento de Autorización de Uso de Emergencia (EUA) (baricitinib, que se administrará en combinación con remdesivir)14. También hay 6 anticuerpos monoclonales EUA aprobados: REGEN-COV (casirivimab e imdevimab, administrados juntos), sotrovimab, tocilizumab y bamlanivimab y etesevimab administrados juntos 15,16,17,18,19. Actualmente solo hay una vacuna profiláctica aprobada por la FDA, Pfizer-BioNTech, y otras dos vacunas profilácticas (Moderna y Janssen) han sido aprobadas por la EUA 20,21,22,23,24. Sin embargo, con la tasa de infección no controlada y la aparición de VoC y VoI, el SARS-CoV-2 todavía representa una amenaza para la salud humana. Por lo tanto, se necesitan urgentemente nuevos enfoques para identificar profilácticos y terapias eficientes para controlar la infección por SARS-CoV-2 y la pandemia de COVID-19 aún en curso.
El estudio del SARS-CoV-2 requiere técnicas laboriosas y enfoques secundarios para identificar la presencia del virus en células infectadas y/o modelos animales validados de infección. El uso de la genética inversa ha permitido la generación de virus recombinantes para responder a preguntas importantes en la biología de las infecciones virales. Por ejemplo, las técnicas de genética inversa han proporcionado medios para descubrir y comprender los mecanismos de la infección viral, la patogénesis y la enfermedad. Del mismo modo, los enfoques de genética inversa han allanado el camino para diseñar virus recombinantes que carecen de proteínas virales para comprender su contribución en la patogénesis viral. Además, se han utilizado técnicas de genética inversa para generar virus recombinantes que expresan genes reporteros para aplicaciones in vitro e in vivo, incluida la identificación de enfoques profilácticos y/o terapéuticos para el tratamiento de infecciones virales. Las proteínas fluorescentes y bioluminiscentes son los genes reporteros más utilizados debido a su sensibilidad, estabilidad y fácil detección basada en la mejora de las nuevas tecnologías25,26. In vitro, se ha demostrado que las proteínas fluorescentes sirven como una mejor opción para la localización de virus en células infectadas, mientras que las luciferasas son más convenientes para estudios de cuantificación 27,28,29. In vivo, las luciferasas son preferidas sobre las proteínas fluorescentes para imágenes de animales enteros, mientras que las proteínas fluorescentes son preferidas para la identificación de células infectadas o imágenes ex vivo 30,31,32. El uso de virus recombinantes que expresan reporteros ha servido como una poderosa herramienta para el estudio de virus en muchas familias, incluyendo, entre otros, flavivirus, enterovirus, alfavirus, lentivirus, arenavirus y virus de la influenza 28,33,34,35,36.
Para superar la necesidad de enfoques secundarios para estudiar el SARS-CoV-2 y caracterizar la infección por SARS-CoV-2 en tiempo real in vivo, hemos generado proteínas recombinantes (r)SARS-CoV-2 competentes para la replicación que expresan proteínas bioluminiscentes (nanoluferasa, Nluc) o fluorescentes (Venus) utilizando nuestra genética inversa basada en cromosomas artificiales bacterianos (BAC) previamente descrita, que se mantiene como una sola copia en E. coli coli con el fin de minimizar la toxicidad de las secuencias de virus durante su propagación en bacterias37,38. En particular, rSARS-CoV-2 / Nluc y rSARS-CoV-2 / Venus mostraron patogenicidad similar a rSARS-CoV-2 / WT in vivo. El alto nivel de expresión de Venus a partir de rSARS-CoV-2/Venus permitió detectar infección viral en los pulmones de ratones transgénicos K18 hACE2 infectados utilizando un sistema de imágenes in vivo (IVIS)39. Los niveles de expresión de Venus se correlacionaron bien con los títulos virales detectados en los pulmones, lo que demuestra la viabilidad de usar la expresión de Venus como un sustituto válido de la infección por SARS-CoV-2. Usando rSARS-CoV-2/Nluc, pudimos rastrear la dinámica de la infección viral en tiempo real y evaluar longitudinalmente la infección por SARS-CoV-2 in vivo utilizando el mismo enfoque IVIS en ratones transgénicos K18 hACE2.

<table><tbody><tr><td>0.5% Triton X-100</td><td>J.T.Baker</td><td>X198-07</td><td>Almacenamiento a temperatura ambiente (RT)</td></tr><tr><td>1% DEAE-Dextran</td><td>MP Biomedicals</td><td>195133</td><td></td></tr><tr><td>10% Solución de formalina, tamponada neutra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Oxoid</td><td>LP0028</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de 24 pocillos</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio al 5%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de 6 pocillos</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular de 96 pocillos</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655-180</td><td></td></tr><tr><td>Células epiteliales de riñón de mono verde africano (Vero E6)</td><td>ATCC</td><td>CRL-1586</td><td></td></tr><tr><td>Ami HT</td><td>Spectral Instruments Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aura Software de imagen 3.2.0</td><td>Spectral Instruments Imaging</td><td></td><td>Software de análisis de imágenes</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA), 35%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>Tienda en 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Agua de grado de cultivo celular</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td>Tienda a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Máquina de gas de anestesia</td><td>Sistemas de anestesia veterinaria, Inc.</td><td>VAS 2001R</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1500-050</td><td>Tienda en -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Ratones transgénicos hembra K18-hACE2 de cuatro a seis semanas de edad</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Prisma Graphpad Versión 9.1.0</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td>Tienda en RT</td></tr><tr><td>MARS Software de análisis de datos</td><td>BMG LABTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MB10 tabletas</td><td>QUIP Laboratories</td><td>MBTAB1.5</td><td>Tienda en RT</td></tr><tr><td>Reactivo de ensayo de luciferasa Nano-Glo</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td>Este reactivo se utiliza para medir la actividad de Nluc. Almacenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Nunc MicroWell MicroWell de 96 pocillos Microplacas ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>269620</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell MicroPlacas de 96 pocillos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>269620</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina/L-Glutamina (PSG) 100x</td><td>Corning</td><td>30-009-CI</td><td>Almacene a -20 & grados; C</td></tr><tr><td>PHERAstar FSX</td><td>BMG LABTECH</td><td>PHERAstar FSX</td><td></td></tr><tr><td>Precelleys Homogeneizador Evolution</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000062-PEVO0-A</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de tejidos blandos CK14 &ndash; 7 mL</td><td>Bertin Instruments</td><td>P000940-LYSK0-A T75</td><td></td></tr><tr><td>EasYFlask</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidasa</td><td>Kit</td><td>PK-4002 ABC de</td> Vector Laboratories <td>y kit de sustrato de peroxidasa DAB</td></tr></tbody></table>

imágenes en vivo y cuantificación de la infección viral en ratones transgénicos k18 hace2 utilizando sars-cov-2 recombinante que expresa el reportero

Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2

La pandemia de la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19) ha sido causada por el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2). Hasta la fecha, el SARS-CoV-2 ha sido responsable de más de 242 millones de infecciones y más de 4,9 millones de muertes en todo el mundo. Al igual que otros virus, el estudio del SARS-CoV-2 requiere el uso de métodos experimentales para detectar la presencia del virus en células infectadas y/o en modelos animales. Para superar esta limitación, generamos proteínas recombinantes (r)SARS-CoV-2 recombinantes (r) competentes para la replicación que expresan proteínas bioluminiscentes (nanoluciferasa, Nluc) o fluorescentes (Venus). Estos rSARS-CoV-2 que expresan reporteros permiten rastrear infecciones virales in vitro e in vivo en función de la expresión de los genes reporteros Nluc y Venus. Aquí el estudio describe el uso de rSARS-CoV-2 / Nluc y rSARS-CoV-2 / Venus para detectar y rastrear la infección por SARS-CoV-2 en el modelo de infección de ratón transgénico K18 de enzima convertidora de angiotensina humana K18 (hACE2) previamente descrito utilizando sistemas de imágenes in vivo (IVIS). Este rSARS-CoV-2/Nluc y rSARS-CoV-2/Venus muestran patogenicidad similar a rSARS-CoV-2/WT y replicación viral in vivo. Es importante destacar que la expresión de Nluc y Venus nos permite rastrear directamente las infecciones virales in vivo y ex vivo, en ratones infectados. Estos rSARS-CoV-2/Nluc y rSARS-CoV-2/Venus representan una excelente opción para estudiar la biología del SARS-CoV-2 in vivo, comprender la infección viral y la enfermedad COVID-19 asociada, e identificar tratamientos profilácticos y/o terapéuticos efectivos para combatir la infección por SARS-CoV-2.

Infección por rSARS-CoV-2/Nluc en ratones transgénicos K18 hACE2 (Figuras 1 y 2) La Figura 1A muestra una representación esquemática de rSARS-CoV-2/WT (arriba) y rSARS-CoV-2/Nluc (abajo) utilizada para evaluar infecciones in vivo. La Figura 1B muestra el diagrama de flujo esquemático aplicado para evaluar la dinámica de la infección por rSARS-CoV-2/Nluc en ratones transgénicos K18 hACE2....

Este protocolo describe la dinámica de las infecciones virales utilizando luciferasa y fluorescencia recombinante (r)SARS-CoV-2 y un sistema de imágenes in vivo (IVIS) en ratones transgénicos K18 hACE2 para superar la necesidad de enfoques secundarios necesarios para estudiar las infecciones por SARS-CoV-2 in vivo.

Imágenes en vivo y cuantificación de la infección viral en ratones transgénicos K18 hACE2 utilizando SARS-CoV-2 recombinante que expresa el reportero

The coronavirus disease 2019 (COVID-19) pandemic has been caused by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). To date, SARS-CoV-2 has ...

Nuestro protocolo describió el uso de SARS-CoV-2 recombinante fluorescente o que expresa luminiscente para la detección viral de imágenes en vivo in vivo y ex vivo y el seguimiento viral en el modelo de ratón transgénico ACE2 humano K18 de infección por SARS-CoV-2. La principal ventaja de esta técnica es la aplicación y viabilidad de la detección y seguimiento viral para estudios in vivo y ex vivo del SARS-CoV-2 en el modelo de ratón transgénico ACE2 humano K18. El uso de la imagen in vivo del SARS-CoV-2 en el modelo de ratón transgénico humano ACE2 K18 representa una excelente opción para evaluar la terapéutica para el tratamiento de la infección por SARS-CoV-2 in vivo.La implementación de reporteros SARS-CoV-2 representa una excelente opción para evaluar la patogenicidad, la replicación viral y el trofismo in vivo. Para estudios in vivo con luciferasa que expresa SARS-CoV-2, se recomienda afeitar a los ratones y obtener imágenes inmediatas después de la inyección de sustrato para mejorar la señal de bioluminiscencia. Comience el monitoreo de bioluminiscencia iniciando el sistema de imágenes in vivo, o IVIS, y configurando los parámetros, haga clic en el modo de imagen a Bioluminiscencia, luego abra el filtro y establezca el tiempo de exposición en Automático.A continuación, retire un ratón ya afeitado y anestesiado de la cámara de aislamiento y use una aguja de calibre 25 para administrar retroorbitalmente 100 microlitros del sustrato de luciferasa diluido de 1 a 10 en PBS al ratón. A continuación, vuelva a colocar el ratón en la cámara de aislamiento, transfiera la cámara de aislamiento a la máquina IVIS, que está equipada con un componente de calentamiento para evitar la hipotermia, y cierre la puerta del generador de imágenes IVIS para inicializar la imagen seleccionando Adquirir en el programa de software. Para analizar las imágenes de bioluminiscencia adquiridas, utilice la herramienta ROI o región de interés en el software para designar la señal precisa y medir el flujo.Inicie el software de imágenes y configure los parámetros. Haga clic en el modo de imagen a Fluorescencia, establezca la excitación en 500 nanómetros y los filtros de emisión a 530 nanómetros, y establezca el tiempo de exposición en Auto. Realice necroscopia e excise pulmones de ratones.Coloque los pulmones extirpados en una placa de 6 pocillos que contenga dos mililitros de 1X PBS y enjuague para eliminar el exceso de sangre. Desinfectar y limpiar las herramientas quirúrgicas entre las muestras utilizando etanol al 70%. Después de inicializar la máquina IVIS, coloque los pulmones en una sábana negra y separe los tejidos entre sí.Luego coloque la bandeja dentro de la cámara de aislamiento dentro del gabinete de bioseguridad y luego transfiera la cámara de aislamiento al IVIS. Cierre la puerta del generador de imágenes IVIS y haga clic en Adquirir para iniciar el sistema de imágenes. Para analizar la fluorescencia, utilice la herramienta de ROI y dibuje ROI alrededor de cada uno de los pulmones individuales.Mida cada ROI manualmente y luego use los valores de eficiencia radiante promedio dados y reste de los ratones infectados simulados. Una vez que se completen las imágenes, coloque los tejidos en un criotubo para congelar el hielo seco para almacenarlos a menos 80 grados celsius para su posterior procesamiento. Utilizando el supernato obtenido de los homogeneizados tisulares, realizar una dilución seriada diez veces mayor e infectar monocapas confluentes de células Vero E6 con un mililitro de cada dilución sobrenadante en triplicados.Deje que el virus se adsorba durante una hora a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5%. Una vez hecho esto, lave las células con un mililitro de 1X PBS y luego incube las células en dos mililitros de medios posteriores a la infección que contengan 1% de agar en la incubadora humidificada de 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante 72 horas. Después de la incubación, inactive las placas en formalina tamponada al 10% neutra durante 24 horas a cuatro grados centígrados, asegurando que toda la placa esté sumergida.Saque las placas del nivel de bioseguridad tres y lave las células tres veces con un mililitro de 0.5%Triton X-100 durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, bloquee las células permeabilizadas con un mililitro de albúmina sérica bovina 2.5 o BSA y PBS durante una hora a 37 grados Celsius seguido de incubación en un mililitro de un microgramo por mililitro de la proteína nucleocápside SARS-CoV anticuerpo monoclonal de reactiva cruzada 1C7C7 diluido en 2.5 BSA durante una hora a 37 grados Celsius. Lave las células tres veces con un mililitro de 1X PBS y desarrolle las placas utilizando los kits de sustrato de peroxidasa ABC y diaminobenceno, o DAB, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, luego calcule los títulos virales como unidades formadoras de placa por mililitro.En el estudio, se observó que la nanoluferasa bioluminiscente, o Nluc, se detectó fácilmente y los ratones infectados con el rSARS-CoV-2 Nluc, pero no los infectados con rSARS-CoV-2 de tipo salvaje o simulado infectados. Los análisis cuantitativos mostraron la intensidad de Nluc en diferentes días después de la infección. Las lesiones macroscópicas en la superficie pulmonar de ratones infectados con rSARS-CoV-2 Nluc fueron comparables a las del grupo infectado de tipo salvaje rSARS-CoV-2.Además, los títulos virales detectados y los ratones infectados con rSARS-CoV-2 Nluc fueron comparables a los infectados con rSARS-CoV-2 de tipo salvaje en todos los órganos en diferentes días después de la infección. Al mismo tiempo, la actividad de Nluc solo se detectó en los órganos de ratones infectados con rSARS-CoV-2 Nluc. Un grupo separado de ratones infectados simulados e infectados por virus fue monitoreado durante 12 días para detectar cambios en el peso corporal y la supervivencia.Los ratones infectados con rSARS-CoV-2 Nluc y rSARS-CoV-2 de tipo salvaje perdieron hasta el 25% de su peso corporal y todos sucumbieron a la infección viral entre siete y ocho días después de la infección. Después de la infección por Venus rSARS-CoV-2, la expresión de Venus se detectó fácilmente en todos los pulmones de ratones infectados con Venus rSARS-CoV-2, pero no de aquellos infectados con rSARS-CoV-2 de tipo salvaje o simulado infectado. Los análisis cuantitativos mostraron que la intensidad de Venus alcanza su punto máximo a los dos días posteriores a la infección y disminuye en el transcurso de la infección y los pulmones de los ratones infectados.Las imágenes de la superficie pulmonar revelaron que las lesiones macroscópicas de ratones infectados con rSARS-CoV-2 Venus eran comparables a las de los ratones infectados de tipo salvaje rSARS-CoV-2. Además, la infección con rSARS-CoV-2 Venus resultó en títulos virales comparables a los observados en ratones infectados con rSARS-CoV-2 de tipo salvaje en todos los órganos. Los ratones infectados con rSARS-CoV-2 Venus y rSARS-CoV-2 de tipo salvaje perdieron hasta el 25% de su peso corporal y sucumbieron a la infección viral en el noveno día después de la infección sin supervivencia.Los resultados de los reporteros que expresan SARS-CoV-2 han demostrado ser sustitutos válidos de la infección viral. Por lo tanto, esto podría conducir a una rápida identificación y evaluación de las contramedidas para el tratamiento de la infección por SARS-CoV-2.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un método de rastreo de neuronas conectadas sinápticamente se describe. Usamos especificidad TVA de una célula de aguas arriba para probar si una población celular de interés recibe la entrada sináptica de tipos de células genéticamente definidos.

Trazado de Circuitos Viral genéticamente definidos Neural

Source: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the procedure for infecting mammalian cells with green fluorescent protein (GFP)-encoding pseudovirus, monitoring viral replication and spread by fluorescence microscopy, and collecting virus-containing supernatant for downstream applications.

Production and Collection of Pseudovirus Particles Using Mammalian Cell Culture

Source: Morales Vasquez, D., et al. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the protocol for carrying out plaque assay–based viral titration for quantifying infectious virus levels in tissue sample collected from a virus–infected mouse model.

Plaque Assay–Based Quantification of Viral Load in an Infected Mouse Tissue Sample

Este video muestra un método para rastrear infecciones virales en modelos de ratón utilizando un virus de influenza A bi-reportero que expresa luciferasa y proteínas de fluorescencia. Este método permite realizar estudios tanto in vivo como ex vivo, lo que permite a los investigadores obtener información sobre la dinámica viral y los efectos de las intervenciones.

Un virus de la influenza indicador fluorescente de luciferasa para rastrear infecciones virales

Este video demuestra la aplicación de la Reacción en Cadena de Hibridación (HCR)-Hibridación In Situ de Fluorescencia (FISH) para visualizar la distribución espacial del ARN subgenómico del SARS-CoV-2. La combinación de HCR con técnicas de inmunofluorescencia tiene el potencial de proporcionar información sobre las interacciones huésped-virus a nivel de una sola célula.

Uso de la hibridación in situ de fluorescencia de inmunoARN para visualizar el SARS-CoV-2

Se describe el uso de un virus vaccinia reportero fluorescente que permite la medición en tiempo real de la infectividad viral y la expresión génica a través de la expresión de etapa específica de fluoróforos espectralmente distintos reportero. Nos detalle un método basado en la placa para identificar con precisión la etapa en la que la replicación del virus se ve afectada en respuesta a la inhibición pequeña molécula.

Vaccinia Virus Reporter para cuantificar la función viral en todas las etapas de la Expresión Génica

Los virus de la gripe A son patógenos respiratorios contagiosos que causan epidemias anuales y pandemias ocasionales. Aquí, describimos un protocolo para rastrear infecciones virales in vivo usando una nueva luciferasa recombinante y bi-reportero expreso de fluorescencia IAV (BIRFLU). Este enfoque proporciona a los investigadores una excelente herramienta para estudiar IAV in vivo.

Un virus de la gripe Reportero fluorescente de Luciferase para imágenes en vivo y cuantificación de la infección viral

Aquí, describimos un método simple que combina el hibridación in situ de la fluorescencia del ARN (RNA-PESCADO) con la inmunofluorescencia para visualizar el ARN agudo severo del coronavirus 2 del coronavirus del síndrome respiratorio (SARS-CoV-2). Este protocolo puede aumentar la comprensión de las características moleculares de las interacciones ARN-huésped SARS-CoV-2 a nivel unicelular.

Visualización Del SARS-CoV-2 Usando Inmuno ARN-Fluorescencia Hibridación In Situ

El protocolo descrito aquí describe un método rápido y efectivo para medir anticuerpos neutralizantes contra la proteína espiga del SARS-CoV-2 mediante la evaluación de la capacidad de las muestras de suero convaleciente para inhibir la infección por un virus de estomatitis vesicular marcada con proteína verde fluorescente mejorada pseudotipado con glicoproteína espiga.

Detección de anticuerpos neutralizantes del SARS-CoV-2 mediante imágenes fluorescentes de alto rendimiento de la infección por pseudovirus

En este protocolo, los puntos cuánticos conjugados con el pico recombinante del SARS-CoV-2 permiten que los ensayos basados en células monitoreen la unión del pico a hACE2 en la membrana plasmática y la posterior endocitosis de las proteínas unidas al citoplasma.

Imágenes confocales de alto rendimiento de trímeros de púas de SARS-CoV-2 conjugados con puntos cuánticos para rastrear la unión y la endocitosis en células HEK293T

Aquí detallamos un protocolo optimizado para la inyección de venas laterales de cola en ratones para administrar sistémicamente virus adenoasociados (AAV) en ratones adultos. Además, describimos los protocolos de los ensayos comúnmente utilizados para evaluar la transducción de AAV.

Liberación consistente de virus adenoasociados a través de la inyección lateral de la vena de la cola en ratones adultos

Aprenda a realizar imágenes en vivo y cuantificación de infección viral en ratones transgénicos K18 hACE2 utilizando SARS-CoV-2 recombinante con reportero. Este método permite evaluar terapéuticas contra el SARS-CoV-2.

Imágenes en vivo y cuantificación de la infección viral en ratones transgénicos K18 hACE2 utilizando SARS-CoV-2 recombinante que expresa el reportero (Video) | JoVE Journal

Imágenes en vivo y cuantificación de la infección viral en ratones transgénicos K18 hACE2 utilizando SARS-CoV-2 recombinante que expresa el reportero

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