Detección de epítopos sensibles a la neutralización en antígenos mostrados en vacunas basadas en partículas similares a virus (VLP) utilizando un ensayo de captura

Aquí, presentamos un protocolo para detectar epítopos de neutralización en partículas similares a virus (VLP) que muestran antígenos. La inmunoprecipitación de las VLP derivadas del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) se realiza utilizando anticuerpos monoclonales específicos de glicoproteínas de la envoltura acoplados a perlas magnéticas conjugadas con proteína g. Las VLP capturadas se someten posteriormente a SDS-PAGE y western blot-análisis empleando anticuerpos específicos de gag de la proteína del núcleo viral.

En mi laboratorio, desarrollamos sistemas de producción para vectores virales y partículas similares a virus, o vacunas basadas en VLP. El ensayo de captura VLP permite la detección muy sensible de antígenos objetivo que se muestran en VLP. En este ensayo, utilizamos anticuerpos ampliamente neutralizantes dirigidos contra epítopos de neutralización para probar la exposición de estos epítopos en la superficie de VLP.

Esta es una evaluación de calidad importante para las vacunas candidatas, ya que solo las VLP que muestran epítopos sensibles a la neutralización podrán provocar una respuesta de anticuerpos neutralizantes en los vacunados. Comience suspendiendo las perlas magnéticas canalizando hacia arriba y hacia abajo, o mezclando en un rotador a 50 RPM durante al menos cinco minutos. Mientras tanto, prepare la solución de anticuerpos que contiene los bNAB.

Use 10 microgramos de cada bNAB en 200 microlitros de tampón de unión a anticuerpos y lavado por reacción. Para cada reacción, transfiera 50 microlitros de la solución de perla magnética a un tubo de reacción de 1,5 mililitros, luego coloque los tubos en el bastidor de separación magnética. Espere hasta que las cuentas se reúnan en la bola del tubo para asegurarse de que todas las cuentas estén recogidas, luego retire el sobrenadante.

Retire el imán y suspenda las perlas en 200 microlitros de la solución bNAB previamente preparada. Incubar durante 30 minutos a tres horas mientras se mezcla en un rotador a 50 RPM a temperatura ambiente. Después de la incubación, coloque los tubos de reacción en la rejilla de separación magnética, espere y retire el sobrenadante.

Retire los tubos del imán y lave las perlas volviendo a suspender en 200 microlitros de unión de anticuerpos y tampón de lavado. Repita el lavado con unión de anticuerpos y tampón de lavado, eliminando la mayor cantidad posible de tampón de lavado cuando termine. Agregue las muestras a los bNAB unidos a cuentas.

Si el volumen de muestra agregado está por debajo de un mililitro, agregue PBS para ajustar el volumen de muestra a un mililitro, luego vuelva a suspender las cuentas mediante el pipeteo suave. Incubar las muestras y las perlas durante 2,5 horas en un rotador a temperatura ambiente, asegurando que las perlas permanezcan en suspensión y que la solución se mezcle completamente durante la incubación. Coloque los tubos en el imán y retire el sobrenadante, luego lave las perlas magnéticas suspendiéndolas en 200 microlitros de tampón de lavado.

Suspenda las perlas en 100 microlitros de tampón de lavado y transfiera la suspensión a un tubo de reacción limpio y resistente al calor. Coloque el tubo en la rejilla de separación magnética y retire el sobrenadante por completo. Para preparar muestras STS-PAGE desnaturalizadas, suspenda las perlas en 20 a 80 microlitros de tampón Laemmli e incube a 95 grados Celsius durante cinco minutos.

Proceda directamente con SDS-PAGE, colocando los tubos en un bastidor magnético para separar las perlas de la solución. Alternativamente, almacene las muestras a menos 20 grados centígrados. Aquí se muestra un resultado representativo de las VLP capturadas por primera vez a partir de sobrenadante de cultivo celular libre de células y gránulos de VLP utilizando bNAB, y posteriormente sometidas a análisis de Western blot para detectar proteínas del núcleo viral.

Las perlas utilizadas para el ensayo de captura fueron recubiertas con tres bNAB diferentes dirigidos contra los epítopos de neutralización de las glicoproteínas de la envoltura y los anticuerpos de isotipo que sirven como controles negativos. Utilizando perlas recubiertas de anticuerpos de isótopos, no se detectaron proteínas Gag en muestras de VLP que contenían VLP calvas, es decir, VLP env negativas o VLP que muestran Env, lo que demuestra que la unión inespecífica de VLP a perlas recubiertas con anticuerpos humanos no medió la captura de VLP. Las VLP calvas tampoco estaban unidas por cuentas recubiertas de bNAB y, en consecuencia, no se detectaron proteínas Gag en el análisis de Western blot.

Por el contrario, los tres bNAB capturaron VLP que mostraban proteínas Env, por lo tanto, las proteínas Gag se detectaron fácilmente, lo que demuestra la presencia de epítopos de neutralización en las glicoproteínas Env que se muestran en las VLP. Crucial para el éxito del ensayo: una mezcla completa de VLP con perlas recubiertas de anticuerpos. Esto se logra mejor utilizando volúmenes mayores de 500 microlitros en rotación.

Alternativamente, los VLP capturados se pueden eludir en condiciones no reductoras. Esto permite el análisis de VLP empleando microscopía inmunoelectrónica, o la investigación de los antígenos mostrados utilizando PAGE nativo.