Name: DetectSyn: un método fluorescente rápido e imparcial para detectar cambios en la densidad de la sinapsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-22T12:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprende el ensayo DetectSyn para medir cambios en la densidad sináptica mediante tecnología de ligadura de proximidad en neuronas cultivadas y tejido fijado. Este método rápido permite analizar grandes regiones tisulares.

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Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud NINDS R01 NS105005 (KRG) y NS105005-03S1 (KRG), el Departamento de Defensa USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH), y una subvención de FRAXA Research (CFH) y la Asociación de Alzheimer, AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG).

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Los autores no reportan ningún conflicto de intereses.

DetectSyn es un ensayo rápido que utiliza un ensayo de ligadura de proximidad para detectar proteínas dentro de los 40 nm entre sí, lo que permite la detección de la formación de sinapsis. Esta técnica mejora los ensayos fluorescentes actuales, que sirven solo como mediciones proxy para la formación de sinapsis. DetectSyn detecta cambios cuantificables en las proteínas sinápticas localizadas dentro de los 40 nm, es decir, dentro de la hendidura sináptica, entre sí. Además, DetectSyn es más rentable y lleva menos tiempo q...

Las sinapsis son la unidad fundamental de comunicación entre neuronas1. Muchas sinapsis entre neuronas dentro de las mismas regiones dan lugar a circuitos que median el comportamiento2. Las sinapsis consisten en un terminal presináptico de una neurona que libera neurotransmisores o neuropéptidos que transmiten información a los receptores postsinápticos de otra neurona. La suma de señales presinápticas determina si la neurona postsináptica disparará un potencial de acción y propagará el mensaje a otras neuronas.
La sinaptopatología, la descomposición de las sinapsis, surge en enfermedades y trastornos marcados por la disminución del volumen neural, como la enfermedad de Alzheimer y el trastorno depresivo mayor, lo que resulta en circuitos que ya no funcionan de manera óptima 3,4,5. La restauración de la densidad de la sinapsis probablemente subyace a la eficacia de los posibles tratamientos para estos trastornos. Por ejemplo, recientemente se demostró que el aumento de las sinapsis subyace a la eficacia conductual de los antidepresivos rápidos6. Para detectar rápidamente posibles tratamientos de sinaptopatología, los investigadores requieren técnicas que identifiquen rápidamente los cambios en los números de sinapsis.
Las metodologías actuales consumen mucho tiempo y son costosas (microscopía electrónica, tomografía de matriz), o solo examinan los cambios postsinápticos sin incorporar el compromiso presináptico (análisis de la columna vertebral, inmunofluorescencia / colocalización). Los colorantes como DiI o las proteínas fluorescentes como GFP ayudan a visualizar las neuronas y caracterizar las espinas postsinápticas. Sin embargo, el análisis de la columna vertebral utiliza proporciones definidas por el investigador para determinar la morfología, lo que puede disminuir la reproducibilidad7. Además, todavía se está descubriendo cómo las diferentes clases de columna vertebral se relacionan con las sinapsis funcionales8. La formación de la columna vertebral puede ser transitoria y puede reflejar plasticidad postsináptica, pero estas espinas podrían eliminarse antes de estabilizarse en una sinapsis con una neurona presináptica9.
La colocalización proporciona un mejor indicador de las sinapsis que el análisis de la columna vertebral porque se puede inmunotintar las proteínas presinápticas y postsinápticas. Sin embargo, las proteínas sinápticas pueden producir valores bajos de colocalización porque las proteínas se yuxtaponen y pueden no superponerse consistentemente. Por lo tanto, debido a que las proteínas no están totalmente superpuestas, las técnicas de colocalización pueden no medir con precisión los cambios en la formación de sinapsis debido a esta información faltante. Finalmente, aunque tanto la microscopía electrónica (EM) como la tomografía de matriz proporcionan imágenes de alta resolución de sinapsis, consumen mucho tiempo. La EM requiere además equipo especializado, y los investigadores están limitados a pequeños volúmenes de tejido para cualquier experimento dado. Si bien la tomografía de matriz proporciona elegantemente la capacidad de detectar muchas proteínas en secciones ultrafinas y se puede combinar con EM10, esta técnica puede ser demasiado laboriosa y estar más allá del alcance de los experimentos que necesitan escanear rápidamente en busca de cambios en la formación de sinapsis.
DetectSyn es una aplicación específica del ensayo de ligadura de proximidad Duolink. El ensayo de PLA permite la detección general de interacciones proteína-proteína. DetectSyn une las medidas postsinápticas proxy amplificando una señal fluorescente emitida por proteínas pre y postsinápticas etiquetadas dentro de los 40 nm entre sí. Si las proteínas sinápticas están dentro de los 40 nm, como dentro de una hendidura sináptica, entonces los anticuerpos secundarios, que contienen sondas de ADN, se hibridarán en ADN circular. Este ADN circular hibridado expresa una sonda fluorescente, que luego se amplifica y detecta con técnicas estándar de microscopía fluorescente (ver Figura 1). Crucialmente, a diferencia de la EM y la tomografía de matriz, esta técnica no requiere equipo especializado y toma aproximadamente la misma cantidad de tiempo que la inmunohistoquímica estándar. La accesibilidad de esta técnica, por lo tanto, permite a los investigadores fuera de las instituciones intensivas en investigación participar en la investigación sinaptopatología. Además, esta técnica puede examinar los cambios en la densidad sináptica en múltiples regiones del cerebro dentro de un solo experimento, ofreciendo una representación más holística de los cambios sinápticos debido a una enfermedad o tratamiento.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>Fisher Scientific BP39920</td><td></td><td>PBS también hicieron obras internas.</td></tr><tr><td>Placas de 24 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012929</td><td>En el caso de las rebanadas de tejido, es posible que no sean necesarias placas preesterilizadas.</td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Papel de aluminio</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-078-290</td><td></td></tr><tr><td>Pollo anticuerpo anti-MAP2</td><td>Abcam</td><td>ab5392</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte de uñas transparente</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1849418</td><td>Otros esmaltes de uñas transparentes también funcionan.</td></tr><tr><td>Bloque frío</td><td>Fisher Scientific</td><td>13131012</td><td></td></tr><tr><td>Estación de trabajo informática</td><td>HP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal o fluorescente</td><td>Nikon</td><td>A1R HD25</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-pollo FITC</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA1-72000</td><td></td></tr><tr><td>Duolink burro anti-Ratón PLUS</td><td>Sigma</td><td>DUO92001</td><td></td></tr><tr><td>Duolink burro anti-Conejo MENOS</td><td>Sigma</td><td>DUO92005</td><td></td></tr><tr><td>Duolink Reactivos de detección in situ Far Red</td><td>Sigma</td><td>DUO92013</td><td>Contiene material de ligadura, material de amplificación, ligasa y polimerasa.</td></tr><tr><td>Medio de montaje in situ Duolink con DAPI</td><td>Sigma</td><td>DUO82040</td><td></td></tr><tr><td>tampones de lavado in situ Duolink, fluorescencia</td><td>Sigma</td><td>DUO82049</td><td>contiene tampón de lavado A y tampón de lavado B; diluya el tampón de lavado B al 1% en diH20 para un tampón de lavado B al 1%.</td></tr><tr><td>El pincel de punta fina</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9691026</td><td>pelo de marta, tamaño 00 o 000, también se puede encontrar en las tiendas de manualidades</td></tr><tr><td>Fisherbrand Cover Glasses: Rectángulos</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545MP</td><td>Cover glass es innecesario para las neuronas cultivadas que ya están en cubreobjetos de vidrio.</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus</td><td>de Fisherbrand Fisher Scientific</td><td>1255015</td><td>Para las neuronas cultivadas que ya están en cubreobjetos de vidrio, los portaobjetos Superfrost pueden ser innecesarios.</td></tr><tr><td>Congelador, -20 grados; C</td><td>VWR</td><td>76449-108</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>125480</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>Software de procesamiento de imágenes</td><td>, p. ej. NIS Elements, ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-015-2633</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri grande, 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Agua de grado molecular</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24701</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Synapsin1 para ratones</td><td>Synaptic Systems</td><td>106-011</td><td></td></tr><tr><td>Suero de burro normal</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-106-1013</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-025</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-388-100</td><td>Los volúmenes de trabajo oscilan entre 3 y micro; L a 500 y micro; L</td></tr><tr><td>Pipeta pasteur de plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-708-006</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de precisión/foreceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-PSD95 de conejo</td><td>Abcam</td><td>ab18258</td><td>Otros pares de anticuerpos también pueden funcionar con optimización.</td></tr><tr><td>Frigorífico</td><td>VWR</td><td>76470-402</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri pequeña, 60 mm</td><td>Fisher</td><td></td> Scientific FB0875713A <td></td></tr><tr><td>Temporizador</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-649-17</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr></tbody></table>

detectsyn: un método fluorescente rápido e imparcial para detectar cambios en la densidad de la sinapsis

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

Las sinapsis son el sitio de comunicación entre las neuronas. La fuerza del circuito neuronal está relacionada con la densidad sináptica, y la descomposición de las sinapsis es característica de estados de enfermedad como el trastorno depresivo mayor (TDM) y la enfermedad de Alzheimer. Las técnicas tradicionales para investigar los números de sinapsis incluyen la expresión genética de marcadores fluorescentes (por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP)), colorantes que llenan una neurona (por ejemplo, colorante de carbocianina, DiI) y detección inmunofluorescente de marcadores de columna vertebral (por ejemplo, densidad postsináptica 95 (PSD95)). Una advertencia importante a estas técnicas de proxy es que solo identifican cambios postsinápticos. Sin embargo, una sinapsis es una conexión entre un terminal presináptico y una columna vertebral postsináptica. El estándar de oro para medir la formación / eliminación de sinapsis requiere técnicas de microscopía electrónica o tomografía de matriz que consumen mucho tiempo. Estas técnicas requieren capacitación especializada y equipo costoso. Además, solo se puede evaluar un número limitado de neuronas y se utilizan para representar cambios en toda una región del cerebro. DetectSyn es una técnica fluorescente rápida que identifica cambios en la formación o eliminación de sinapsis debido a un estado de enfermedad o actividad farmacológica. DetectSyn utiliza un ensayo de ligadura de proximidad rápida para detectar proteínas pre y postsinápticas yuxtapuestas y microscopía fluorescente estándar, una técnica fácilmente disponible para la mayoría de los laboratorios. La detección fluorescente de la puntería resultante permite un análisis rápido e imparcial de los experimentos. DetectSyn proporciona resultados más representativos que la microscopía electrónica porque se pueden analizar áreas más grandes que un número limitado de neuronas fluorescentes. Además, DetectSyn funciona para neuronas cultivadas in vitro y cortes de tejido fijo. Finalmente, se proporciona un método para analizar los datos recopilados de esta técnica. En general, DetectSyn ofrece un procedimiento para detectar cambios relativos en la densidad de sinapsis a través de tratamientos o estados de enfermedad y es más accesible que las técnicas tradicionales.

Los datos modificados de Heaney et al.6 se presentan para demostrar un experimento en el que se espera una mayor formación de sinapsis (consulte6 para obtener más información y una discusión más profunda del mecanismo). Anteriormente, se demostró que los antidepresivos rápidos requieren la activación del receptor metabotrópico inhibidor, GABAB (gamma-aminobutyric acid subtype B), para serefectivos 13. Además, los datos anteriores indicaron que los an...

DetectSyn es un ensayo fluorescente rápido e imparcial que mide los cambios en el número relativo de sinapsis (compromiso pre y postsináptico) en todos los tratamientos o estados de enfermedad. Esta técnica utiliza una técnica de ligadura de proximidad que se puede utilizar tanto en neuronas cultivadas como en tejido fijo.

DetectSyn: un método fluorescente rápido e imparcial para detectar cambios en la densidad de la sinapsis

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

DetectSyn aprovecha la tecnología de ensayo de ligadura de proximidad para identificar rápidamente los cambios en las sinapsis. También proporcionamos un protocolo para analizar los resultados. La principal ventaja de DetectSyn es la rapidez con la que se pueden obtener los resultados en las grandes regiones de tejido que se pueden analizar.Para comenzar, retire cuidadosamente la solución de bloqueo con una pipeta Pasteur de plástico sin perturbar las células. Luego forra una gran placa de Petri de plástico con Parafilm. Y usando fórceps, transfiera cuidadosamente los resbalones de la cubierta al Parafilm.Agregue 60 microlitros de la solución de anticuerpos primarios a la parte superior del resbalón de la cubierta, asegurándose de que la solución de anticuerpos no se derrame sobre los lados del deslizamiento de la cubierta. Para proporcionar humedad y evitar que las muestras se sequen durante la incubación, agregue agua ultrapura a una placa de Petri más pequeña y coloque cuidadosamente la placa alrededor de los resbalones de la cubierta. Luego cubra la placa de Petri más grande e incube las células cultivadas durante una hora a temperatura ambiente.Después de la incubación con el anticuerpo primario, use fórceps para golpear cuidadosamente la solución de anticuerpos primarios de los resbalones de la cubierta en una toalla de papel y transfiera los trozos de la cubierta a su placa original de 24 pocillos llena de 500 microlitros de PBS. Luego lave las muestras con PBS tres veces durante 10 minutos cada una con una agitación suave en un agitador orbital. Después del último lavado, transfiera los resbalones de la cubierta a la placa de Petri grande y agregue 40 microlitros de la solución de anticuerpos secundaria a la parte superior del deslizamiento de la cubierta.Cubra la placa de Petri e incube las muestras a 37 grados centígrados durante una hora. Para la ligadura, mientras mantiene la ligasa en un bloque frío, diluya la ligasa 1 a 40 usando el material de ligadura e inmediatamente agregue 40 microlitros de la mezcla de ligasa a los resbalones de la cubierta. Cubra la placa de Petri e incube las muestras a 37 grados centígrados durante 30 minutos.Para la amplificación, diluya la polimerasa 1280 en un bloque frío utilizando el material de amplificación. Luego agregue 40 microlitros de la mezcla de amplificación a los resbalones de la cubierta e incube las muestras durante 100 minutos a 37 grados centígrados. A continuación, para el montaje, deje caer tres microlitros de medios de montaje en una diapositiva.Retire el exceso de búfer de lavado del resbalón de la cubierta y coloque el resbalón de la cubierta con las celdas hacia abajo en el medio de montaje. Selle los lados con una pequeña cantidad de esmalte de uñas transparente para mantener el deslizamiento de la cubierta en su lugar. Para el montaje de tejido en rodajas, transfiera cuidadosamente una rebanada de tejido al portaobjetos preparado y colóquelo plano.Luego deje caer de 5 a 10 microlitros de medios de montaje en la rebanada de tejido. Coloque un resbalón de cubierta de vidrio sobre la rebanada de tejido y selle el resbalón de la cubierta con esmalte de uñas transparente, como se demostró anteriormente. Para obtener imágenes digitales con un microscopio confocal, ajuste la ganancia, el desplazamiento y la potencia del láser para cada canal fluorescente para disminuir el ruido de fondo y mejorar la señal fluorescente.Asegúrese de que la señal fluorescente no esté sobresaturada. Para las neuronas de cultivo, en la pestaña Adquisición de ND, haga clic en Guardar en archivo. Luego, en Examinar, elija un archivo para guardar la imagen e ingrese el nombre del archivo.A continuación, en la pestaña Z, seleccione la opción Modo simétrico definido por rango. Establezca el enfoque en el mejor mapa de dos planos y haga clic en el botón Relativo para establecer este plano focal como el centro de la pila z. A continuación, ajuste el rango a cinco micrómetros con pasos de un micrómetro y marque Cerrar obturador activo durante el movimiento Z.En la pestaña Longitud de onda, seleccione el nombre del botón óptico con los ajustes de adquisición configurados previamente en Configuración óptica y haga clic en Ejecutar ahora. Para el tejido en rodajas, en el menú adquirir, elija Escanear imagen grande y, a continuación, en el panel de captura, seleccione el botón óptico con los ajustes de adquisición configurados previamente. Además, seleccione el objetivo correcto en este panel.A continuación, debajo del panel de área y el ocular, use las teclas de flecha para establecer los límites de la región de interés o ROI. Luego haga clic en Guardar imagen grande en archivo y cree un nombre de archivo de ruta de guardado para la imagen. Finalmente, en el panel de configuración, asegúrese de que la captura multicanal esté marcada.A continuación, elija el nombre del botón óptico con los ajustes de adquisición configurados previamente en Configuración óptica. En ImageJ, abra la opción de umbral yendo al menú de la imagen, haciendo clic en Ajustar y luego en Umbral. Elija la opción Fondo oscuro si la imagen tiene un fondo oscuro.A continuación, ajuste los límites superior e inferior del umbral según la configuración de umbral optimizada previamente determinada y haga clic en Aplicar. Para las células cultivadas, utilice el canal MAP2 y una herramienta de ROI a mano alzada para dibujar un ROI para cada neurona, incluidas las dendritas y el soma. Para el tejido en rodajas, dibuje un ROI a mano alzada dentro de la imagen de la rebanada que encapsule el área de interés.Luego obtenga el área del ROI abriendo el menú Analizar y haciendo clic en Medir. Para detectar el número de puntas dentro de cada ROI, utilice una herramienta de detección automática como el análisis de partículas. En el menú Analizado, seleccione Partículas analizadas y defina el diámetro del tamaño de la punta.A continuación, en el menú desplegable mostrar, elija la opción Máscaras superpuestas, luego marque la opción Mostrar resultados y haga clic en Aceptar. Para dividir el número de punta por el área del ROI individual, copie y pegue los resultados de cada imagen de los resultados emergentes en una hoja de cálculo. Identificar de qué archivo y muestra los datos que obtenemos, y dividir el área del ROI por el número de punta.Finalmente, para normalizar los resultados a muestras de control, promediar los resultados de las muestras de control y dividir los resultados obtenidos de todas las muestras por el promedio del control. El agonista GABAB, baclofeno, es necesario para la eficacia in vitro del antidepresivo rápido Ro-256981. Un aumento en la formación de sinapsis se demuestra por un aumento en la punta blanca.Sin baclofeno, no se observa un aumento en la formación de sinapsis. In vivo, la inyección intraperitoneal del antidepresivo rápido resulta en un aumento en la formación de sinapsis en comparación con el control salino. Si bien algunas puntas aparecen en las imágenes de control técnico, generalmente no son del mismo tamaño que lo demuestra la especificación blanca en comparación con la punta grande en los otros paneles.Además, estas puntas no están en el mismo lugar como lo demuestra alguna punta que aparece dentro del soma. DetectSyn puede identificar cambios en las sinapsis debido a un estado de enfermedad o tratamiento farmacológico. Este método puede ayudar a proporcionar información sobre cualquier área de investigación que estudie los trastornos que afectan el desarrollo o la descomposición de las sinapsis.

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Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

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