Name: Uso del analizador de flujo metabólico celular en tiempo real para monitorear la bioenergética de osteoblastos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T12:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Aprende a medir la bioenergética celular en osteoblastos mediante un analizador de flujo metabólico en tiempo real. Este método evalúa el consumo de oxígeno y la acidificación para determinar la producción de ATP y las preferencias metabólicas.

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Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud (NIH) Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel (NIAMS) Subvención AR072123 y el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (NIA) Subvención AG069795 (a ERR).

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Los autores no tienen nada que revelar.

El analizador de flujo metabólico celular en tiempo real se puede utilizar para explorar la energía celular en diferentes condiciones. El protocolo ilustra el aislamiento eficiente de las BMSC, el cultivo de células en placas de cultivo celular apropiadas y su diferenciación a osteoblastos maduros, que se pueden usar para diversos ensayos utilizando el analizador de flujo extracelular. Además, también se explican en detalle los pasos críticos del ensayo de flujo metabólico celular en tiempo real, incluida la hidratación ...

La formación de hueso por el osteoblasto se acompaña de destrucción coordinada o reabsorción de huesos por osteoclastos. El equilibrio entre la formación de hueso osteoblástico y la reabsorción de osteoclastos es un proceso acoplado que describe el recambio óseo o la remodelación, que es esencial para la homeostasis esquelética. La disfunción osteoblástica conduce a una formación ósea deteriorada y da lugar a diversas enfermedades, incluida la osteoporosis 1,2,3. La diferenciación ex vivo/in vitro de células madre del estroma de la médula ósea (BMSC) a precursores de osteoblastos y osteoblastos maduros da como resultado la formación y deposición de la matriz ósea mineralizada en el vaso de cultivo a lo largo del tiempo 4,5,6. Esta formación ósea por el osteoblasto requiere una cantidad significativa de energía celular. Específicamente, se ha demostrado que la síntesis y secreción de colágeno dependen en gran medida de las proporciones celulares de ATP: ADP, y presumiblemente, el tráfico y la secreción de vesículas mineralizadas requieren ATPadicional 7,8,9,10,11. Muchos investigadores han demostrado que el proceso de osteoblastogénesis y función osteoblástica requiere un suministro adecuado de energía para satisfacer la demanda metabólica de formación ósea 12,13,14,15,16. Por lo tanto, el objetivo de este método es caracterizar el estado bioenergético de las células del estroma murino primario a lo largo de la diferenciación de osteoblastos utilizando el analizador de flujo metabólico celular en tiempo real. Estas técnicas ayudan a desarrollar una mejor comprensión de la homeostasis esquelética, lo que en última instancia puede conducir al desarrollo de nuevas opciones terapéuticas capaces de mejorar los trastornos esqueléticos.
El analizador de flujo metabólico celular en tiempo real se puede utilizar para medir la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR) de los osteoblastos vivos, que corresponde a la producción de ATP mitocondrial y glicolítico, respectivamente. Fundamental para esta metodología es el hecho de que un ion H+ por lactato se libera durante la glucólisis en la conversión de glucosa en lactato, lo que altera el pH de los medios reflejado en los valores de ECAR. Por el contrario, durante el ciclo del TCA (ácido tricarboxílico), la fosforilación oxidativa a través de las mitocondrias produce CO2 utilizando o consumiendo oxígeno, y por lo tanto el monitoreo de OCR refleja este proceso metabólico. El analizador mide tanto OCR como ECAR en el microambiente extracelular simultáneamente y en tiempo real, lo que permite un tremendo potencial al estudiar la bioenergética celular 6,17. Además, realizar estos ensayos es relativamente sencillo y fácilmente personalizable dependiendo del objetivo experimental. Se han empleado técnicas similares para comprender mejor la regulación metabólica de las células T del sistema inmunitario18,19, el inicio del cáncer y la progresión20, junto con otros múltiples tipos de células que contribuyen a los síndromes metabólicos21,22.
Las ventajas del analizador de flujo metabólico en tiempo real sobre las técnicas alternativas incluyen (1) la capacidad de medir la bioenergética celular de las células vivas en tiempo real, (2) la capacidad de realizar ensayos con un número relativamente pequeño de células (requiere tan solo 5.000 células), (3) los puertos de inyección para manipular paralelamente múltiples tratamientos en un sistema de 96 pocillos de alto rendimiento, (4) el uso de imágenes celulares automatizadas sin etiquetas radiactivas para la normalización18, 23,24. Los siguientes métodos tienen como objetivo proporcionar una descripción generalizada pero detallada del monitoreo de la bioenergética celular en BMSC murinas a lo largo de la diferenciación de osteoblastos utilizando el analizador. Incluirá ensayos realizados rutinariamente; sin embargo, al igual que con muchas técnicas y métodos, se recomienda encarecidamente que los laboratorios individuales determinen detalles específicos para sus experimentos.
Selección de ensayos y diferentes tipos de ensayos disponibles: Una amplia variedad de kits de ensayo y reactivos están disponibles para estudiar la bioenergética de las células, al tiempo que se garantiza la fiabilidad y consistencia de los resultados experimentales. Además, el software de escritorio también ofrece plantillas de ensayo que se pueden personalizar fácilmente. El ensayo se puede definir en función de las necesidades del usuario para medir diferentes parámetros metabólicos. Estos ensayos pueden ser modificados de varias maneras en función del objetivo experimental y/o la cuestión científica. Por ejemplo, con cuatro puertos de inyección, se pueden inyectar múltiples compuestos en los medios de ensayo para analizar la respuesta celular específica de cada vía metabólica.
Prueba de fenotipo de energía celular: Este ensayo mide el fenotipo metabólico y el potencial metabólico de las células vivas. Este ensayo también se recomienda como el primer paso para tener una idea generalizada del metabolismo específico de la vía. Se inyecta una mezcla de oligomicina A-un inhibidor de la ATP sintasa y cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP), un agente de desacoplamiento mitocondrial para comprender el potencial de energía celular. La inyección de oligomicina A inhibe la síntesis de ATP, lo que resulta en un aumento en la tasa de glucólisis (ECAR) para permitir que las células satisfagan sus demandas de energía; por otro lado, la inyección de FCCP resulta en un mayor OCR debido a la despolarización de la membrana mitocondrial. Esencialmente, este ensayo representa la respiración metabólica basal, y después de las inyecciones duales, empujones o tensiones, la respuesta metabólica. Sobre la base de estos parámetros, el software traza OCR y ECAR de las células clasificando las células como estado aeróbico, quiescente, glucolítico o energético a lo largo del tiempo25,26.
Ensayo de tasa de producción en tiempo real de ATP: Esto mide la producción celular de ATP simultáneamente a partir de la glucólisis y la respiración mitocondrial. Este ensayo mide cuantitativamente los cambios metabólicos de las dos vías de energía y proporciona datos sobre las tasas de producción de ATP mitocondrial y glicolítico a lo largo del tiempo. El ensayo obtiene datos basales de OCR y ECAR seguidos del cálculo de la tasa de producción de ATP mitocondrial a través de la inyección de oligomicina A y la tasa de producción de ATP glicolítico a través de la inyección de rotenona + mezcla de antimicina A (inhibición total de la función mitocondrial), lo que resulta en acidificación mitocondrial17,27.
Prueba de esfuerzo de mitocondrias celulares (o prueba de esfuerzo de mito celular): Esto mide la función mitocondrial a través de la respiración ligada al ATP, cuantifica la bioenergética celular, identifica la disfunción mitocondrial y mide la respuesta de las células al estrés. Varios parámetros, incluida la capacidad respiratoria basal y sobrante, la respiración ligada a ATP, la respiración máxima y el consumo de oxígeno no mitocondrial, se pueden obtener en un solo ensayo. Este ensayo implica inyecciones secuenciales de oligomicina A, FCCP (agente desacoplamiento mitocondrial), una mezcla de inhibidores de rotenona /antimicina A para analizar eficientemente el efecto de estos en la función mitocondrial28.
Prueba de flexibilidad de flexión de combustible mito: Esto mide la tasa de respiración mitocondrial por la oxidación de los tres combustibles mitocondriales primarios por la presencia y ausencia de sus inhibidores. La inhibición secuencial de glucosa, glutamina y ácidos grasos ayuda a medir la dependencia, capacidad y flexibilidad de las células y la dependencia de las células en varias vías celulares para satisfacer la demanda de energía. Cuando las mitocondrias no pueden satisfacer las demandas de la vía bloqueada de interés oxidando otros combustibles, las células entran en un estado de dependencia. La capacidad de las células se calcula mediante la inhibición de las otras dos vías alternativas seguida de la inhibición de la vía de interés. La flexibilidad de las células ayuda a comprender la capacidad de las mitocondrias para compensar y satisfacer las necesidades de combustible de la vía inhibida. Se calcula restando la dependencia de las células de la capacidad de las células. Tres inhibidores diferentes se utilizan de forma independiente o como una mezcla de dos para calcular eficazmente los parámetros del ensayo. El ácido 2-ciano-3-(1-fenil-1H-indol-3-il)-2-propenoico (UK5099) inhibe la oxidación de la glucosa al bloquear el portador de piruvato en la glucólisis. El sulfuro de etilo bis-2-(5-fenilacetamidado-1,3,4-tiadiazol-2-il) (BPTES) inhibe la vía de oxidación de la glutamina, y el etomoxir inhibe la oxidación de los ácidos grasos de cadena larga29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig01.jpg"> Figura 1: Representación esquemática de la metodología de cultivo y preparación de osteoblastos para su análisis. Las BMSC murinas se aíslan de huesos largos, se cultivan y se siembran en placas de 96 pocillos a una densidad de 25,000 células / pozo. El cultivo de estas células en medios específicos de osteoblastos se inicia cuando alcanzan el 80%-100% de confluencia para iniciar su diferenciación. Los ensayos se realizan en diferentes etapas de diferenciación. Las placas de los cartuchos se hidratan un día antes del ensayo. El día del ensayo, se inyectan diferentes inhibidores en los puertos de los cartuchos del sensor según los requisitos del ensayo, y se agrega un búfer de calibración a la placa de calibración de 96 pocillos. Después de la calibración, se realiza el ensayo de flujo metabólico celular en tiempo real, seguido de la obtención de imágenes de la microplaca de cultivo celular utilizando el generador de imágenes de microplacas para normalizar los datos del analizador de flujo metabólico celular en tiempo real con el recuento de células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63142/63142fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>0.25% Tripsina EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 2-ciano-3-(1-fenil-1H-indol-3-il)-2-propenoico</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>PZ0160</td><td>UK5099</td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544-100G</td><td></td></tr><tr><td>Bis-2-(5-fenilacetamido-1,3,4-tiadiazol-2-il)sulfuro de etilo</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>SML0601</td><td>BPTES</td></tr><tr><td>Cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C2920</td><td>FCCP</td></tr><tr><td>Lector de imágenes Cytation 5</td><td>BioTek</td><td>N/A</td><td>Generador de imágenes de microplacas</td></tr><tr><td>Etomoxir hidrato de sal sódica</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>E1905</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Solución (20 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Ácido oleico-albúmina de suero bovino</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>O3008</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina A - 5 mg</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>R8875-1G</td><td></td></tr><tr><td>Caballito de mar XF 1.0 M Solución de glucosa</td><td>Agilent Technologies</td><td>103577-100</td><td></td></tr><tr><td>Caballito de mar XF 100mM Piruvato Solución</td><td>Agilent Technologies</td><td>103578-100</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF 200mM Glutamina solución</td><td>Agilent Technologies</td><td>103579-100</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF Medios DMEM</td><td>Agilent Technologies</td><td>103575-100</td><td>DMEM con 5mM HEPES, pH 7,4, sin rojo fenol, bicarbonato de sodio, glucosa, piruvato y L-glutamina</td></tr><tr><td>Analizador Seahorse XFe96</td><td>Agilent Technologies</td><td>S7800B</td><td>Analizador de flujo metabólico en tiempo real</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent Technologies</td><td>102416-100</td><td>Incluye cartuchos de sensor XFe96, microplacas de cultivo celular y solución Seahorse XF Calibrant</td></tr><tr><td>El software Cell Imaging 1.1.0.11</td><td>Agilent Technologies - BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Wave 2.6.1</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerol fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422-50G</td><td></td></tr></tbody></table>

uso del analizador de flujo metabólico celular en tiempo real para monitorear la bioenergética de osteoblastos

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

La formación ósea por osteoblastos es un proceso esencial para la adquisición ósea adecuada y el recambio óseo para mantener la homeostasis esquelética y, en última instancia, prevenir la fractura. En el interés tanto de optimizar el pico de masa ósea como de combatir diversas enfermedades musculoesqueléticas (es decir, osteoporosis posmenopáusica, anorexia nerviosa, diabetes mellitus tipo 1 y 2), se han realizado esfuerzos increíbles en el campo de la biología ósea para caracterizar completamente los osteoblastos a lo largo de su proceso de diferenciación. Dado el papel principal de los osteoblastos maduros para secretar proteínas de la matriz y vesículas de mineralización, se ha observado que estos procesos requieren una cantidad increíble de energía celular, o trifosfato de adenosina (ATP). El estado general de la energía celular a menudo se conoce como bioenergética celular, e incluye una serie de reacciones metabólicas que detectan la disponibilidad de sustrato para derivar ATP para satisfacer las necesidades celulares. Por lo tanto, el método actual detalla el proceso de aislamiento de las células estromales primarias de la médula ósea murina (BMSC) y el monitoreo de su estado bioenergético utilizando el analizador de flujo metabólico celular en tiempo real en varias etapas de la diferenciación de osteoblastos. Es importante destacar que estos datos han demostrado que el perfil metabólico cambia drásticamente a lo largo de la diferenciación de osteoblastos. Por lo tanto, se requiere el uso de este tipo de célula fisiológicamente relevante para apreciar completamente cómo el estado bioenergético de una célula puede regular la función general.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig06.jpg"> Figura 6: Gráficos representativos para ensayos realizados rutinariamente para comprender el perfil bioenergético celular del grupo de control vs. tratamiento con sus respectivos errores estándar. (A) La prueba de fenotipo de energía celular. La gráfica representa la glucólisis (ECAR) vs. respiración mitocondrial (OCR) del co...

El ensayo de flujo metabólico celular en tiempo real mide la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de acidificación extracelular, que corresponde a la producción mitocondrial y glicolítica de trifosfato de adenosina, utilizando sensores de pH y oxígeno. El manuscrito explica un método para comprender el estado energético de los osteoblastos y la caracterización e interpretación del estado bioenergético celular.

Uso del analizador de flujo metabólico celular en tiempo real para monitorear la bioenergética de osteoblastos

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Este método es útil para determinar la energía celular, como la tasa de producción de ATP, y también para determinar la preferencia celular hacia un metabolito particular en tiempo real. Para comenzar, agregue 200 microlitros de calibrador XF e incube la placa de utilidad durante al menos una hora antes del ensayo. Prepare 80 mililitros de medios de ensayo XF utilizando DMEM XF suplementado.Descongele la oligomicina A, la rotenona y la antimicina A en hielo. Pipetear los compuestos hacia arriba y hacia abajo para solubilizarlos antes de su uso. Agregue tres mililitros de medio de ensayo preparado a cada tubo, etiquetados A y B.Agregue 26.4 microlitros de oligomicina A milimolar de 2.5 milimolares en el tubo A y 3.1 microlitros de rotenona milimolar 12.67, 4.1 microlitros de antimicina A milimolar y 30 microlitros Tinción de Hook en el tubo B.Cargue una concentración de 10x de estos inhibidores en el puerto de inyección correspondiente.Y finalmente, 20 microlitros de estos compuestos se cargarán en las células en 200 microlitros de medios de ensayo. Retire la microplaca de cultivo celular de la incubadora de 37 grados Celsius y observe las células bajo el microscopio. Retire el medi

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Una descripción de un método para crear perfiles de la función mitocondrial en las células se proporciona. El perfil de las mitocondrias generan proporciona cuatro parámetros de la función mitocondrial que se puede medir en un experimento: la tasa de respiración basal, la respiración ATP-linked, fuga de protones, y la capacidad de reserva.

Experimento perfil bioenergético utilizando células C2C12 mioblastos

Este protocolo proporciona un enfoque bioquímico para medir la tasa de acidificación extracelular (ECAR) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR) de células leucémicas primarias con ensayo de flujo extracelular. La evaluación del perfil metabólico de estas células ayuda a caracterizar sus demandas, lo que conduce a una terapia personalizada.

Ensayo de flujo extracelular: un método para medir el perfil metabólico de las células

Fuente:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Instrumentos OroborosEste video explica cómo se utiliza el flujo de oxígeno para evaluar la respiración mitocondrial en células de mamíferos vivas y permeabilizadas. Demuestra el uso secuencial de digitonina, sustratos metabólicos, ADP, un desacoplador y un inhibidor para caracterizar diferentes estados respiratorios. El perfil de flujo de oxígeno resultante revela la función mitocondrial y la eficiencia de acoplamiento...

Mediciones de flujo de oxígeno para evaluar la respiración mitocondrial en células vivas y permeabilizadas

Este video muestra el método para analizar el metabolismo energético en células NK humanas activadas utilizando un analizador de flujo extracelular. Diferentes inhibidores de los complejos de la cadena de transporte de electrones influyen en la síntesis de ATP, que se mide a través de la tasa de consumo de oxígeno u OCR, lo que proporciona información sobre el metabolismo celular y la bioenergética.

Monitorización en tiempo real del metabolismo energético en células NK humanas mediante un analizador de flujo extracelular

La reprogramación metabólica es una característica y un requisito previo para la polarización de los macrófagos M1 y M2. Este manuscrito describe un ensayo para la medición de los parámetros fundamentales de la glucólisis y la función mitocondrial en macrófagos derivados de la médula ósea de ratón. Esta herramienta se puede aplicar para investigar cómo factores particulares afectan el metabolismo y el fenotipo del macrófago.

Caracterización metabólica de polarizado M1 y macrófagos derivados de Médula ósea M2 Uso del análisis extracelular Flux en tiempo real

El estado metabólico de las células epiteliales pigmentarias de la retina humana (H-RPE) refleja su salud y función. Aquí se presenta un protocolo optimizado para examinar el flujo metabólico en tiempo real de H-RPE utilizando respirometría de alta resolución.

Análisis en tiempo real de la bioenergética en células epiteliales pigmentarias de la retina humana primaria mediante respirometría de alta resolución

Describimos protocolos paso a paso que miden la respiración mitocondrial de neutrófilos de ratón y humanos y células HL60 utilizando el analizador de flujo extracelular metabólico.

Medición en tiempo real del perfil bioenergético mitocondrial de neutrófilos

Aquí, describimos en detalle los métodos para extraer macrófagos de la médula ósea, el bazo y el corazón infartado, y posteriormente evaluar el flujo metabólico en células vivas.

Análisis del flujo metabólico ex vivo en macrófagos esplénicos y cardíacos y monocitos de médula ósea

Presentamos un protocolo para permeabilizar selectivamente la membrana plasmática, permitiendo la administración dirigida de sustratos e inhibidores para evaluar la fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS) en células cultivadas, superando las barreras de transporte de la membrana plasmática que normalmente dificultan dichos análisis. Utilizando esta técnica, demostramos cómo la función de OXPHOS es modulada por agonistas y antagonistas muscarínicos.

Modulación dependiente del ligando colinérgico del acoplamiento fosforilado oxidativo en células neuroblastoma BE(2)-C permeabilizadas por digitonina

Se presenta un nuevo y poderoso de integración de la nanofotónica (QD-FRET) y microfluídica para investigar la formación de polyplexes polielectrolito, que se espera que proporcione un mejor control y síntesis de polyplexes uniforme y personalizable para a base de ácido nucleico futuras terapias.

La combinación de QD-FRET y microfluídica para monitorear Nanocomplex ADN auto-ensamblado en tiempo real

Aprende a medir la bioenergética celular en osteoblastos mediante un analizador de flujo metabólico en tiempo real. Este método evalúa el consumo de oxígeno y la acidificación para determinar la producción de ATP y las preferencias metabólicas.

Uso del analizador de flujo metabólico celular en tiempo real para monitorear la bioenergética de osteoblastos

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