Uso del analizador de flujo metabólico celular en tiempo real para monitorear la bioenergética de osteoblastos

El ensayo de flujo metabólico celular en tiempo real mide la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de acidificación extracelular, que corresponde a la producción mitocondrial y glicolítica de trifosfato de adenosina, utilizando sensores de pH y oxígeno. El manuscrito explica un método para comprender el estado energético de los osteoblastos y la caracterización e interpretación del estado bioenergético celular.

Este método es útil para determinar la energía celular, como la tasa de producción de ATP, y también para determinar la preferencia celular hacia un metabolito particular en tiempo real. Para comenzar, agregue 200 microlitros de calibrador XF e incube la placa de utilidad durante al menos una hora antes del ensayo. Prepare 80 mililitros de medios de ensayo XF utilizando DMEM XF suplementado.

Descongele la oligomicina A, la rotenona y la antimicina A en hielo. Pipetear los compuestos hacia arriba y hacia abajo para solubilizarlos antes de su uso. Agregue tres mililitros de medio de ensayo preparado a cada tubo, etiquetados A y B.Agregue 26.4 microlitros de oligomicina A milimolar de 2.5 milimolares en el tubo A y 3.1 microlitros de rotenona milimolar 12.67, 4.1 microlitros de antimicina A milimolar y 30 microlitros Tinción de Hook en el tubo B.Cargue una concentración de 10x de estos inhibidores en el puerto de inyección correspondiente.

Y finalmente, 20 microlitros de estos compuestos se cargarán en las células en 200 microlitros de medios de ensayo. Retire la microplaca de cultivo celular de la incubadora de 37 grados Celsius y observe las células bajo el microscopio. Retire el medio de ensayo del baño de agua.

Lave suavemente las células con 200 microlitros de medio de ensayo precalentado dos veces, y agregue 200 microlitros de medios de ensayo por pozo. Revise las células bajo el microscopio para asegurarse de que las células permanezcan adheridas a los pozos. Asegúrese de que las células de los pocillos D5 y E8 se adhieran a una monocapa consistente y no se laven durante la etapa de lavado.

El software de imágenes celulares utiliza estos dos pocillos para configurar el enfoque automático y la exposición automática. Abra el software de escritorio en la computadora junto al equipo. Compruebe el estado de la conexión en la esquina inferior izquierda del software del controlador.

Vaya a Plantillas y seleccione la plantilla de ensayo de tasa de ATP XF o la plantilla de ensayo adecuada. Seleccione Definiciones de grupo en la parte superior de la pantalla y defina los grupos. seleccionar el diseño del mapa de placas y asignar los pozos en función de los grupos definidos.

Verifique el protocolo del instrumento. Asegúrese de que los compuestos agregados estén correctamente enumerados e incluya la información del proyecto para futuras referencias. Haga clic en Ejecutar ensayo.

Esto provocará la selección de la ubicación de almacenamiento de archivos resultante. Seleccione la ubicación para guardar el archivo de resultados. Guarde el archivo con la fecha de ensayo y haga clic en Iniciar ejecución.

Coloque el cartucho del sensor y la placa de utilidad en la bandeja y haga clic en Estoy listo para iniciar la calibración. Abra el software de imágenes celulares en la computadora. Asegúrese de que el generador de imágenes de microplacas esté encendido y que los puertos estén conectados al equipo.

Compruebe la barra de estado en la parte inferior izquierda de la pantalla para asegurarse de que la temperatura esté ajustada a 37 grados centígrados y que el estado de la conexión se resalte en verde como listo. Escanee el código de barras de la placa para iniciar el proceso de obtención de imágenes. Proporcione un nombre a la placa celular y presione Guardar.

Las imágenes de campo brillante y fluorescentes se guardarán aquí. Haga clic en Realizar escaneo de campo brillante y, en la siguiente pantalla, el menú Placa y escaneo muestra las opciones para obtener imágenes. Antes del ensayo, seleccione Iniciar análisis de Campo Brillante.

Coloque la microplaca de cultivo celular y la cubierta de la placa en el soporte de la bandeja y alinee bien A1 con la marca A1. Haga clic en Cerrar bandeja. La adquisición de imágenes de Brightfield aparece en la siguiente pantalla con un mapa de placas.

Haga clic en Escanear todos los pozos y escanee durante 30 a 35 minutos. Al finalizar la calibración, el software muestra el cuadro de diálogo Placa de celda de carga. Luego, haga clic en Abrir bandeja para reemplazar la bandeja de utilidad con una microplaca de cultivo celular.

Tenga en cuenta que la placa de cultivo celular está en el generador de imágenes de microplacas. Después de la exploración, retire la microplaca de cultivo celular y colóquela en el analizador para realizar el ensayo. Luego, haga clic en Placa de celda de carga para iniciar el ensayo.

Espere hasta que comience el ensayo y muestre el tiempo estimado de finalización. Al finalizar el ensayo, el software muestra el cuadro de diálogo Descargar cartucho del sensor y placa celular. Haga clic en Expulsar y retire la microplaca de cultivo celular del analizador.

Retire con cuidado el cartucho del sensor y reemplace la tapa de la placa celular. Aparecerá el cuadro de diálogo Ensayo completo. Luego, haga clic en Ver resultados para abrir el archivo de resultados del ensayo o para normalizar los datos.

Después de completar el ensayo, escanee el código de barras de la placa con el lector de códigos de barras de mano. Si la placa ya ha sido fotografiada, no requerirá un nuevo nombre. Seleccione Fluorescencia y recuento de células.

Coloque la placa de la celda en el soporte de la bandeja y haga clic en Cerrar bandeja. En la ventana de adquisición de imágenes, seleccione Escanear todos los pozos para comenzar a crear imágenes. Revise las imágenes fluorescentes y los recuentos de células en la aplicación de imágenes e imágenes celulares haciendo clic al azar en un par de pozos.

Una vez que se completen las imágenes de fluorescencia, exporte las imágenes para obtener referencias adicionales. Una vez que se completen las imágenes y el recuento de células, abra el archivo de resultados y haga clic en Normalizar. Haga clic en Importar y seleccione Solicitar el software de escritorio para normalizar el ensayo con recuento de celdas automáticamente.

La inyección de oligomicina A y la inyección de combinación de factores estresantes FCCP aumentó la actividad basal del grupo de control. Los factores estresantes mostraron un nivel de energía significativamente alto en los grupos de control y tratamiento. Por otro lado, el tratamiento dos tuvo una actividad basal comparativamente más baja, y las células se volvieron más aeróbicas.

La figura indica que tanto las células de control como las experimentales utilizan la glucólisis y la fosforilación oxidativa mitocondrial para la generación de ATP. El grupo experimental muestra una reducción en la generación de ATP a través de la glucólisis y un aumento en la respiración mitocondrial. La tasa de respiración basal en el grupo de tratamiento es comparativamente menor que en el grupo de control.

Las tasas de respiración y producción de ATP en ambos grupos disminuyen, junto con la fuga de protones seguida de una inyección de oligomicina A. Las tasas de respiración de las células vuelven a subir a su respiración máxima después de la inyección de FCCP. La inyección final de rotenona y antimicina A disminuye el OCR nuevamente.

Después de la tercera inyección, la respiración mitocondrial se apaga por la combinación de rotenona y antimicina A.En comparación con el grupo de control, la respiración basal y máxima de los grupos de tratamiento no tiene relativamente ningún cambio. La figura muestra que el grupo de control es altamente dependiente de la vía de la glucosa, mientras que la oxidación de la glutamina fue eficiente en el grupo de control. La vía de los ácidos grasos muestra que el tratamiento ha aumentado la capacidad general de las células.

La disponibilidad de múltiples puertos de inyección en la placa ácida nos ayuda a determinar el efecto de múltiples medicamentos en la energía celular en un solo punto de tiempo.