Name: Aislar ARN específicos del tipo de célula de muestras de tejido heterogéneo congeladas a presión sin clasificación celular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Aprende a aislar ARN específicos del tipo celular de tejidos heterogéneos congelados usando el modelo NuTRAP con GLP pull down. Este método evita la clasificación celular y permite estudiar expresión génica en células EGFP.

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Este trabajo fue parcialmente apoyado por NIH R00HD082686. Agradecemos la beca de investigación de verano de la Endocrine Society a H.S.Z. También agradecemos al Dr. Yuan Kang por criar y mantener la colonia de ratones.

Todos los experimentos con animales realizados siguieron los protocolos aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Auburn.
NOTA: El siguiente protocolo utiliza un testículo (aproximadamente 100 mg) en P28 de Gli1-CreERT2; Ratones NuTRAP (Mus musculus). Es posible que sea necesario ajustar los volúmenes de reactivos en función de los tipos de muestras y el número de tejidos.
1. Recolección de tejidos
<ol><li>Eutanasia a los ratones usando una cámara deCO2 , desinfecte la superficie del abdomen con etanol al 70%.</li>
	<li>Abra la parte inferior del abdomen con tijeras y retire los testículos. Use nitrógeno líquido (LN2) para congelar los testículos inmediatamente.</li>
	<li>Almacene las muestras en la fase de vapor de LN2 hasta su uso.</li>
</ol>2. Preparación de reactivos y perlas
<ol><li>Preparar la solución madre de homogeneización: Añadir 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40 y 1 mg/ml de heparina. Conservar la solución a 4 °C hasta su uso (hasta 1 mes).</li>
	<li>Preparar el tampón de trabajo de homogeneización a partir de la solución madre (paso 2.1) antes de su uso: Añadir DTT (concentración final: 1 mM), cicloheximida (concentración final: 100 μg/ml), ribonucleasa recombinante (concentración final: 200 unidades/ml) y cóctel inhibidor de proteasa (concentración final: 1x) a la solución madre de homogeneización para producir la cantidad necesaria del tampón de trabajo de homogeneización. Guarde el tampón de trabajo recién preparado en hielo hasta que lo use.</li>
	<li>Prepare los tampones de lavado bajos en sal y altos en sal:<ol><li>Para preparar tampón de lavado bajo en sal, mezcle 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl y 1% NP-40. Añadir TDT (concentración final: 1 mM) y cicloheximida (concentración final: 100 μg/ml) antes de usar.</li>
		<li>Para preparar tampón de lavado con alto contenido de sal mezcle 50 mM Tris (pH 7.4), 12 mM MgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40. Añadir TDT (concentración final: 2 mM) y cicloheximida (concentración final: 100 μg/mL) antes de usar.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare cuentas de proteína G (Tabla de materiales):<ol><li>Cada muestra necesitará 50 μL de perlas de proteína G. Coloque la cantidad requerida de perlas en un tubo de centrífuga de 1,5 ml y separe las perlas de la solución utilizando una rejilla magnética dejando el tubo en la rejilla durante 30-60 s.</li>
		<li>Retire el sobrenadante mediante pipeteo. Lave las perlas tres veces con 1 ml de tampón de lavado helado y bajo en sal cada vez.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Lisis tisular y homogeneización
<ol><li>Añadir 2 ml de tampón de trabajo de homogeneización helada (recién preparado a partir del paso 2.2) a un juego de amoladora de papel tisú de vidrio. Coloque rápidamente la muestra congelada en el molinillo y homogeneice el tejido con 30 golpes en hielo con un mortero suelto.</li>
	<li>Transfiera el homogeneizado a un tubo de fondo redondo de 2 ml y centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C.</li>
	<li>Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 2 ml. Guarde 100 μL en un tubo de 1,5 ml como "entrada".</li>
	<li>Incubar el sobrenadante en el tubo de 2 ml con el anticuerpo anti-GFP (5 μg/ml; 1:400) a 4 °C en un rotador de extremo a extremo (24 rpm) durante la noche.</li>
</ol>4. Inmunoprecipitación
<ol><li>Transfiera la mezcla de homogeneizado/anticuerpo a un nuevo tubo de fondo redondo de 2 ml que contenga las perlas de proteína G lavadas del paso 2.4. Incubar a 4 °C en un rotador de extremo a extremo (24 rpm) durante 2 h.</li>
	<li>Separe las perlas magnéticas del sobrenadante con una rejilla magnética. Guarde el sobrenadante como la "fracción negativa". La fracción negativa contiene (1) ARN en células negativas para EGFP y (2) ARN en células positivas para EGFP que no están unidas a ribosomas.</li>
	<li>Agregue 1 ml de tampón de lavado con alto contenido de sal a las perlas y voltee brevemente el tubo para lavar las perlas. Coloque el tubo en una rejilla magnética.</li>
	<li>Retire el tampón de lavado. Repita el paso de lavado dos veces más. Las perlas ahora contienen el complejo perlas-ribosoma-ARN de células positivas para EGFP.</li>
</ol>5. Extracción de ARN
NOTA: Los siguientes pasos están adaptados del kit de aislamiento de ARN (Tabla de materiales). Trate cada fracción (es decir, entrada, positiva y negativa) como una muestra independiente y aísle los ARN de forma independiente.
<ol><li>Incubar las perlas del paso 4.4 con 50 μL de tampón de extracción (del kit de aislamiento de ARN) en un termomezclador (42 °C, 500 rpm) durante 30 min para liberar ARN de las perlas.</li>
	<li>Separe las perlas con un estante magnético, transfiera el sobrenadante que contiene el complejo perlas-ribosoma-ARN a un tubo de 1,5 ml.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 3000 x g durante 2 min, luego pipetear el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml. Este tubo contiene la "fracción positiva" del paso TRAP. NOTA: Para las fracciones de entrada y negativas, extraer ARN de 25 μL de muestras utilizando 1 ml de tampón de extracción. Incubar en un termomezclador (42 °C, 500 rpm) durante 30 min.</li>
	<li>Preacondicionar la columna de purificación de ARN: pipetear 250 μL de tampón de acondicionamiento en la columna de purificación. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente (RT). Centrifugar la columna a 16.000 x g durante 1 min.</li>
	<li>Pipet igual volumen de 70% de EtOH en el sobrenadante desde el paso 5.3 (alrededor de 50 μL de 70% de EtOH para la fracción positiva y 1 mL de 70% de EtOH para la entrada y las fracciones negativas). Mezclar bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo.</li>
	<li>Pipetear la mezcla en la columna a partir del paso 5.4.</li>
	<li>Centrifugar la columna a 100 x g durante 2 minutos para permitir que el ARN se una a la membrana en la columna, luego continúe la centrifugación a 16,000 x g durante 30 s inmediatamente. Deseche el flujo continuo. NOTA: Para las fracciones de entrada y negativas, agregue 250 μL de la mezcla a la columna cada vez. Repita los pasos 5.6 y 5.7 hasta que se utilicen todas las mezclas.</li>
	<li>Pipetear 100 μL de tampón de lavado 1 (W1) en la columna y centrifugar a 8.000 x g durante 1 min. Deseche el flujo continuo.</li>
	<li>Pipetear 75 μL de solución de DNasa mezclar directamente en la membrana de la columna de purificación. Incubar en RT durante 15 min.</li>
	<li>Pipetear 40 μL de W1 en la columna y centrifugar a 8.000 x g durante 30 s. Deseche el flujo continuo.</li>
	<li>Pipetear 100 μL de tampón de lavado 2 (W2) en la columna y centrifugar a 8.000 x g durante 1 min. Deseche el flujo continuo.</li>
	<li>Pipetear 100 μL de W2 en la columna y centrifugar a 16.000 x g durante 2 min. Deseche el flujo continuo. Vuelva a centrifugar la misma columna a 16.000 x g durante 1 minuto para eliminar todos los restos de tampón de lavado antes de la etapa de elución.</li>
	<li>Transfiera la columna a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.</li>
	<li>Pipetear 12 μL de agua libre de RNasa directamente sobre la membrana de la columna de purificación. La punta de la pipeta no debe tocar la membrana. Incubar a RT durante 1 min y centrifugar a 1000 x g durante 1 min. Luego continúe la centrifugación a 16,000 x g durante 1 minuto para eluyir el ARN.</li>
</ol>6. Concentración y calidad del ARN
<ol><li>Utilice un bioanalizador para evaluar la calidad y cantidad del ARN extraído10.</li>
</ol>7. Almacenamiento y análisis posterior
<ol><li>Almacene el ARN a -80 °C (hasta 1 año) hasta un análisis adicional (p. ej., microarray, PCR cuantitativa (qPCR) y RNA-seq, etc.). NOTA: Para obtener detalles sobre el análisis de qPCR, incluida la síntesis de ADNc, consulte Lyu et al.11. Los cebadores para qPCR se enumeran en la Tabla de materiales.</li>
</ol>

<ol><li>Yang, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+RNA+sequencing+reveals+dynamic+regulation+of+myocardial+noncoding+RNAs+in+failing+human+heart+and+remodeling+with+mechanical+circulatory+support%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support.</a> Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).</li>
<li>Soumillon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+source+and+mechanisms+of+high+transcriptome+complexity+in+the+mammalian+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis.</a> Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li>
<li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li>
<li>Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRAP-rc%2C+translating+ribosome+affinity+purification+from+rare+cell+populations+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985(2015).</li>
<li>Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+ribosome+affinity+purification+%28trap%29+to+investigate+Arabidopsis+thaliana+root+development+at+a+cell+type-specific+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919(2020).</li>
<li>Moran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+ribosome+affinity+purification+%28TRAP%29+for+RNA+isolation+from+endothelial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624(2019).</li>
<li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+transcriptional+and+epigenomic+profiling+from+specific+cell+types+within+heterogeneous+tissues+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li>
<li>Varjosalo, M., Taipale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog%3A+functions+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog: functions and mechanisms.</a> Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).</li>
<li>Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+integrity+number+%28RIN%29-standardization+of+RNA+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Agilent+Technologies%22%5BJournal%5D)">RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control.</a> Agilent Technologies. , Application Note 1 1-8 (2004).</li>
<li>Lyu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+reveals+sub-zones+in+mouse+adrenal+zona+fasciculata+and+the+sexually+dimorphic+responses+to+thyroid+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone.</a> Endocrinology. 161 (9), (2020).</li>
<li>King, P., Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shh+signaling+regulates+adrenocortical+development+and+identifies+progenitors+of+steroidogenic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).</li>
<li>Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cell+expansion+and+organ+size+of+mouse+adrenal+is+regulated+by+sonic+hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog.</a> Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).</li>
<li>Benton, L., Shan, L. -X., Hardy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+adult+Leydig+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of adult Leydig cells.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).</li>
<li>Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+11%CE%B2-hydroxysteroid+dehydrogenase.+Testicular+11%CE%B2-hydroxysteroid+dehydrogenase%3A+development+of+a+model+for+the+mediation+of+Leydig+cell+function+by+corticosteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids.</a> Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).</li>
<li>Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sertoli+cell+signaling+by+Desert+hedgehog+regulates+the+male+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline.</a> Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).</li>
<li>Beverdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9-dependent+expression+of+Gstm6+in+Sertoli+cells+during+testis+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice.</a> Reproduction. 137 (3), 481(2009).</li>
<li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+for+single-cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Technologies for single-cell isolation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
<li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+considerations+for+single-cell+rna+sequencing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches.</a> Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108(2018).</li>
<li>Chucair-Elliott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+cell-specific+mouse+models+for+paired+epigenetic+and+transcriptomic+studies+of+microglia+and+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia.</a> Communications Biology. 3 (1), 693(2020).</li>
<li>Barsoum, I., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+and+differential+roles+of+transcription+factors+Gli1+and+Gli2+in+the+development+of+mouse+fetal+Leydig+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells.</a> Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).</li>
<li>Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+analysis+of+testicular+Leydig+cells+in+normal+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice.</a> The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

La utilidad del análisis del transcriptoma de tejido completo podría amortiguarse, especialmente cuando se estudian tejidos heterogéneos complejos. Cómo obtener ARN específicos de tipo celular se convierte en una necesidad urgente para desatar la poderosa técnica RNA-seq. El aislamiento de ARN específicos del tipo celular generalmente se basa en la recolección de un tipo específico de células mediante micromanipulación, clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o microdisección por captura láser (LCM)<sup c...

Los enfoques de alto rendimiento, incluida la secuenciación de ARN (RNA-seq) y el microarray, han permitido interrogar los perfiles de expresión génica a nivel de todo el genoma. Para tejidos complejos como el corazón, el cerebro y los testículos, los datos específicos del tipo de célula proporcionarán más detalles comparando el uso de ARN de todo el tejido 1,2,3. Para superar el impacto de la heterogeneidad celular, el método de purificación de afinidad ribosómica traducida (TRAP) se ha desarrollado desde principios de la década de 20104. TRAP es capaz de aislar ARN unidos a ribosomas de tipos celulares específicos sin disociación tisular. Este método se ha utilizado para el análisis de translatoma (ARNm que están siendo reclutados para el ribosoma para la traducción) en diferentes organismos, incluyendo la orientación a una población extremadamente rara de células musculares en embriones de Drosophila5, el estudio de diferentes células radiculares en la planta modelo Arabidopsis thaliana6, y la realización de análisis del transcriptoma de células endoteliales en mamíferos7.
TRAP requiere una modificación genética para marcar el ribosoma de un organismo modelo. Evan Rosen y sus colegas desarrollaron recientemente un modelo de ratón llamado Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mouse 8, que ha estado disponible a través del Laboratorio Jackson desde 2017. Al cruzarse con una línea de ratón Cre, los investigadores pueden usar este modelo de ratón NuTRAP para aislar ARN unidos a ribosomas y núcleos celulares de células que expresan Cre sin clasificación celular. En las células que expresan Cre que también portan el alelo NuTRAP , el ribosoma marcado con EGFP / L10a permite el aislamiento de la traducción de ARNm utilizando ensayos de afinidad pulldown. En la misma célula, la membrana nuclear marcada con el péptido de reconocimiento de biotina ligasa (BLRP), que también es mCherry positivo, permite el aislamiento nuclear mediante el uso de purificación basada en afinidad o fluorescencia. El mismo equipo de investigación también generó una línea de ratón similar en la que la membrana nuclear se etiqueta solo con mCherry sin biotina8. Estas dos líneas de ratones modificados genéticamente dan acceso a caracterizar perfiles epigenómicos y transcriptómicos pareados de tipos específicos de células de interés.
La vía de señalización del erizo (Hh) juega un papel crítico en el desarrollo del tejido9. GLI1, un miembro de la familia GLI, actúa como un activador transcripcional y media la señalización de Hh. Las células Gli1+ se pueden encontrar en muchos órganos secretores de hormonas, incluyendo la glándula suprarrenal y los testículos. Para aislar ADN y ARN específicos del tipo de célula de las células Gli1+ utilizando el modelo de ratón NuTRAP, se cruzaron ratones Gli1-CreERT2 con ratones NuTRAP. Los ratones Shh-CreERT2 también se cruzaron con los ratones NuTRAP con el objetivo de aislar las células que expresan erizo sónico (Shh). El siguiente protocolo muestra cómo utilizar Gli1-CreERT2; Ratones NuTRAP para aislar ARN unidos a ribosomas de células Gli1+ en testículos de ratones adultos.

<table><tbody><tr><td>Actb</td><td>eurofins</td><td>cebadores qPCR</td><td>ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (cebador directo/cebador inverso)</td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>2100 Bioanalyzer Instrument</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini Cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA</td><td>Millipore</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>cicloheximida</td><td>Millipore</td><td>239764-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Cyp11a1</td><td>eurofins</td><td>cebadores qPCR</td><td>CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (cebador directo/cebador inverso)</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>DTT, Ditiothreitol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P2325</td><td></td></tr><tr><td>Imán DynaMag-2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Falcon 15 mL</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Juego de molinos de vidrio</td><td>DWK Life Sciences</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>heparina</td><td>BEANTOWN CHEMICAL</td><td>139975-250MG</td><td></td></tr><<tr><td>em>Hsd3b</td><td>eurofins</td><td>cebadores qPCR</td><td>GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (cebador directo/cebador inverso)</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Biosciences</td><td>R005</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosciences</td><td>R004</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga 2 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-707-354</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Clariom S Microarrays de ensayo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Microarray service</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Millipore</td><td>492018-50 Ml</td><td></td></tr><tr><td>oligo (dT)20</td><td>Invitrogen</td><td>18418020</td><td></td></tr><tr><td>Kit de aislamiento de ARN PicoPure</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Dynabead</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D Células</td><td></td></tr><tr><td>de cultivo de agua sin ARNasa</td><td></td><td>NUPW-0500</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT Inhibidor recombinante de la ribonucleasa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>Sox9</td><td>eurofins</td><td>cebadores qPCR</td><td>TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (cebador directo/cebador inverso</td></tr><tr><td>Superíndice IV transcriptasa inversa</td><td>Invitrogen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>Sycp3</td><td>eurofins</td><td>cebadores</td> <td>qPCRGAATGTGTTCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (cebador delantero/cebador inverso)</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62848</td><td></td></tr></tbody></table>

aislar arn específicos del tipo de célula de muestras de tejido heterogéneo congeladas a presión sin clasificación celular

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

La heterogeneidad celular plantea desafíos para comprender la función de los tejidos complejos a nivel del transcriptoma. El uso de ARN específicos del tipo de célula evita posibles dificultades causadas por la heterogeneidad de los tejidos y desencadena el poderoso análisis del transcriptoma. El protocolo descrito aquí demuestra cómo utilizar el método de purificación de afinidad ribosómica (TRAP) para aislar ARN unidos a ribosomas de una pequeña cantidad de células que expresan EGFP en un tejido complejo sin clasificación celular. Este protocolo es adecuado para aislar ARN específicos de tipo celular utilizando el modelo de ratón NuTRAP recientemente disponible y también podría usarse para aislar ARN de cualquier célula que exprese EGFP.

El ratón Gli1-CreERT2 (Jackson Lab Stock Number: 007913) se cruzó por primera vez con el ratón reportero NuTRAP (Jackson Lab Stock Number: 029899) para generar ratones de doble mutación. Los ratones portadores de ambos alelos genéticos genéticamente modificados (es decir, Gli1-CreERT2 y NuTRAP) fueron inyectados con tamoxifeno una vez al día, cada dos días, para tres inyecciones. Las muestras de tejido se recogieron el 7º día después del1º día de la inyección.<s...

Este protocolo tiene como objetivo aislar los ARNm ribosómicos de traducción específicos del tipo celular utilizando el modelo de ratón NuTRAP.

Aislar ARN específicos del tipo de célula de muestras de tejido heterogéneo congeladas a presión sin clasificación celular

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...

Este protocolo tiene como objetivo obtener ARN específicos de tipos celulares de alta calidad a partir de un pequeño número de células en un tejido complejo sin clasificación celular. Emplea un modelo de ratón recientemente disponible que permite a los investigadores aislar un ARN unido a ribosomas utilizando GLP pull down. El método también es adecuado para aislar ARN unidos a ribosomas de cualquier célula que exprese EGFP.Para comenzar, agregue dos mililitros de tampón de trabajo de homogeneización helada a un juego de molinillo de papel de vidrio. Coloque rápidamente la muestra congelada en el molinillo y homogeneice el tejido con 30 golpes en hielo con un mortero suelto. transfiera el homogeneizado a un tubo inferior redondo de dos mililitros y centrifugar a 12, 000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.Luego transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de dos mililitros sin alterar el pellet, reservando 100 microlitros como entrada. Incubar el sobrenadante con el anticuerpo anti-GFP a cuatro grados centígrados en un rotador de extremo a extremo durante la noche. Transfiera la mezcla de homogeneización y anticuerpos a un nuevo tubo inferior redondo de dos mililitros que contenga perlas de proteína g lavadas e incube cuatro grados centígrados en el rotador a 24 RPM durante dos horas.Separe las perlas magnéticas del sobrenadante utilizando una rejilla magnética. Guarde el sobrenadante como la fracción negativa que contiene los ARN en las células negativas de EGFP y los ARN en las células positivas de EGFP que no están unidas a los ribosomas. Agregue un mililitro de tampón de lavado con alto contenido de sal a las perlas y vorete brevemente el tubo para lavar las perlas.Luego coloque el tubo en una rejilla magnética. Retire el tampón de lavado y repita los pasos de lavado dos veces más para obtener el complejo de ARN ribosómico de las perlas de las células positivas para EGFP. Incubar las perlas con 50 microlitros de tampón de extracción del kit de aislamiento de ARN en un ThermoMixer durante 30 minutos para liberar ARN de las perlas.Separe las perlas con una rejilla magnética y transfiera el sobrenadante a un tubo de 1,5 mililitros. Centrifugar el tubo a 3000 g durante dos minutos. A continuación, pipetear el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros.Para acondicionar previamente la columna de purificación de ARN, pipetear 250 microlitros de tampón de acondicionamiento en la columna de purificación e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego centrifugar la columna a 16, 000 g durante un minuto. Pipetear un volumen igual de etanol al 70% en el extracto celular y mezclar bien mediante pipeteo.Pipetear hasta 200 microlitros de la mezcla en la columna de purificación de ARN preacondicionada. Para reducir la pérdida de muestras no llene la columna más del 80% de su capacidad. Repita este paso varias veces hasta que todos los ARN se recojan en la misma columna de cada fracción.Centrifugar la columna durante dos minutos para unir el ARN a la membrana de la columna. Luego continúe la centrifugación durante 30 segundos. Deseche el flujo a través y pipete 100 microlitros de tampón de lavado uno en la columna.Centrifugar durante un minuto, luego desechar el flujo a través. La pipeta 75 microlitros de solución de ADN se mezcla directamente en la membrana de la columna de purificación. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.Luego, pipetear 40 microlitros de tampón de lavado uno en la columna y centrifugar durante otros 30 segundos. Deseche el flujo a través. Pipetear 100 microlitros de tampón de lavado dos en la columna y centrifugar a 8, 000 g durante un minuto.Deseche el flujo a través. Compre PET 100 microlitros de tampón de lavado dos en la columna y centrifugar a 16, 000 g durante dos minutos. Deseche el flujo y vuelva a centrifugar la misma columna a 16, 000 g durante un minuto para eliminar todos los restos de tampón de lavado.Transfiera la columna a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. pipetear 12 microlitros de agua libre de RNasa directamente sobre la membrana de la columna de purificación asegurando que la punta de la pipeta no toque la membrana. Incubar a temperatura ambiente durante un minuto y centrifugar a 1000 g durante un minuto.Luego, a 16, 000 G durante un minuto para eluyir el ARN. Utilice un bioanalizador para evaluar la calidad y cantidad del ARN extraído. Almacene los ARN en un congelador de 80 grados o envíelos para su posterior análisis.Ratones portadores de alelos genéticos genéticamente modificados, Gli1-CreERT2 y NuTRAP se nos inyecta tamoxifeno una vez al día, cada dos días para tres inyecciones. El análisis de inmunofluorescencia de los tejidos recolectados muestra que el EGFP se expresó en células intersticiales en los testículos. EGFP también se encontró en células capsulares suprarrenales en ratones Gli1-CreERT2, NuTRAP.En Sonic Hedgehog-CreERT2, ratones NuTRAP La población celular positiva de EGFP reside en la corteza externa de la glándula suprarrenal debajo de la cápsula, confirmando la expresión de células que expresan previamente EGFP. Después de la extracción de los ARN específicos del tipo de célula, el ARN extraído se envió para el análisis de microarrays. Los resultados mostraron que alrededor de 3000 genes se enriquecieron en la fracción positiva, en comparación con los genes en la fracción negativa, mientras que alrededor de 4.000 genes se enriquecieron en la fracción negativa.Entre los genes diferenciales expresados, los genes asociados a células de Leydig Hsd11b1 y Hsd3b6 se enriquecieron en la fracción positiva. En la fracción negativa, se enriquecieron los genes asociados a las células de Sertoli Desert Hedgehog y Gstm6. Solo se identificaron unos pocos genes expresados diferencialmente al comparar la fracción negativa con la entrada.Se utilizó RT-PCR cuantitativa en tiempo real para confirmar la expresión de genes clave en las fracciones positiva y negativa. Similar a lo que se encontró en el ensayo de microarrays, las enzimas esteroidogénicas 3-beta hidroxi esteroide deshidrogenasa y la enzima de escisión de la cadena lateral del colesterol se enriquecieron en la fracción positiva. Mientras tanto, el marcador celular de Sertoli SRY box factor de transcripción nueve y el marcador de células germinales sinaptonemal proteína tres del complejo se enriquecieron en la fracción negativa.Al intentar este protocolo, es importante preparar un nuevo tampón de trabajo de homogeneización Agregue DTT, ribonucleasa recombinante de cicloheximida y cóctel de inhibidores de proteinasa a la solución madre de homogeneización solo antes de usar. También es importante preparar tampones frescos bajos en sal y los tampones de lavado con alto contenido de sal antes de su uso.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este artículo se describe un método simple para la recolección de las células individuales de rata cultivos primarios de neuronas y posterior análisis de transcriptoma utilizando la amplificación ARNA. Este enfoque es generalizable a cualquier tipo de célula.

El análisis del transcriptoma de células individuales

La expresión de genes de un subconjunto de células en un tejido específico representa un reto importante. En este artículo se describe cómo aislar el ARN total de alta calidad a partir de una población de células específicas mediante la combinación de un método immunolabeling rápida con láser captura microdissection.

Aislamiento de ARN a partir de células subpoblaciones específicas utilizando láser captura Microdissection Combinado con Rapid Immunolabeling

Aquí presentamos un protocolo para la microdisección asistida por láser de tipos específicos de células vegetales para el perfil transcripcional. Si bien el protocolo es adecuado para diferentes especies y tipos de células, la atención se centra en células altamente inaccesibles de la línea germinal femenina importantes para la reproducción sexual y apomíctica en el género de crucíferas Boechera.

Asistida por láser microdisección (LAM) como herramienta para la transcripción de perfiles de distintos tipos de células

Aquí, presentamos un protocolo para aislar rápidamente a núcleos de alta calidad del tejido fresco o congelado para la descendente secuencia de RNA masivamente paralelo. Nos incluyen tejido detergente-mecánica y de mecánica hipotónica interrupción y célula opciones de lisis, que pueden utilizarse para el aislamiento de los núcleos.

Aislamiento de núcleos de adultos de la médula espinal para secuenciación masivamente paralela solo núcleo ARN

Este protocolo describe el manual de clasificación procedimiento para aislar neuronas fluorescencia etiquetadas solo seguidas en vitro basada en la transcripción ARNm amplificación de la secuencia de RNA de alta profundidad unicelular.

Secuenciación de ARN unicelular de las neuronas de ratón fluorescencia etiquetada con clasificación Manual y doble transcripción In Vitro con recuentos absolutos secuenciación (DIVA-Seq)

Se desarrolló un protocolo de microdisección de captura láser (LCM) para obtener una cantidad suficiente de ARN de alta calidad para el análisis de la expresión génica en células óseas. El estudio actual se centra en las secciones del fémur del ratón. Sin embargo, el protocolo LCM reportado aquí se puede utilizar para estudiar la expresión génica en células de cualquier tejido duro.

Un protocolo de microdisección de captura láser que produce ARN de alta calidad a partir de huesos de ratón congelados

Esta publicación describe un protocolo para el aislamiento de núcleos de adipocitos maduros, purificación por clasificación activada por fluorescencia y transcriptómica a nivel de una sola célula.

Aislamiento de núcleos de tejido adiposo para aplicaciones genómicas de una sola célula

El aislamiento de núcleos individuales se basa en la disociación y la permeabilización basada en detergente de la membrana celular, pasos que necesitan optimización y son propensos a introducir artefactos técnicos. Demostramos un protocolo libre de detergente y enzimas para el aislamiento rápido de núcleos intactos directamente de todo el tejido, produciendo núcleos adecuados para ARN-seq de un solo núcleo (snRNA-Seq) o ATAC-seq.

Aislamiento de núcleos de tejido entero utilizando un método de detergente y libre de enzimas

Aquí, presentamos un protocolo para aislar núcleos de tejidos hepáticos archivados congelados por flash para RNA-seq de núcleo único, ATAC-seq y multiómica articular (RNA-seq y ATAC-seq).

Aislamiento de núcleos de tejido hepático congelado rápidamente para multiómica unicelular

Aquí, presentamos un protocolo que describe la preparación de los núcleos celulares. Después de la microdisección y la disociación enzimática del tejido cardíaco en células individuales, las células progenitoras se congelaron, seguidas del aislamiento de células viables puras, que se utilizaron para la secuenciación de ARN de un solo núcleo y el ensayo de núcleo único para la cromatina accesible a transposasa con análisis de secuenciación de alto rendimiento.

Aislamiento de núcleos de células progenitoras cardíacas de ratón para epigenoma y perfil de expresión génica a resolución de una sola célula

El estudio describe un protocolo simple, rápido y parcialmente automatizado para aislar núcleos de alta calidad de tejidos de mamíferos congelados para la secuenciación posterior de ARN de núcleos individuales.

Un protocolo simple, rápido y parcialmente automatizado para el aislamiento de núcleos individuales de tejidos de mamíferos congelados para la secuenciación de núcleos únicos

Aprende a aislar ARN específicos del tipo celular de tejidos heterogéneos congelados usando el modelo NuTRAP con GLP pull down. Este método evita la clasificación celular y permite estudiar expresión génica en células EGFP.

Aislar ARN específicos del tipo de célula de muestras de tejido heterogéneo congeladas a presión sin clasificación celular

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