Aislar ARN específicos del tipo de célula de muestras de tejido heterogéneo congeladas a presión sin clasificación celular
8 de diciembre de 2021
Este protocolo tiene como objetivo aislar los ARNm ribosómicos de traducción específicos del tipo celular utilizando el modelo de ratón NuTRAP.
Este protocolo tiene como objetivo obtener ARN específicos de tipos celulares de alta calidad a partir de un pequeño número de células en un tejido complejo sin clasificación celular. Emplea un modelo de ratón recientemente disponible que permite a los investigadores aislar un ARN unido a ribosomas utilizando GLP pull down. El método también es adecuado para aislar ARN unidos a ribosomas de cualquier célula que exprese EGFP.
Para comenzar, agregue dos mililitros de tampón de trabajo de homogeneización helada a un juego de molinillo de papel de vidrio. Coloque rápidamente la muestra congelada en el molinillo y homogeneice el tejido con 30 golpes en hielo con un mortero suelto. transfiera el homogeneizado a un tubo inferior redondo de dos mililitros y centrifugar a 12, 000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Luego transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de dos mililitros sin alterar el pellet, reservando 100 microlitros como entrada. Incubar el sobrenadante con el anticuerpo anti-GFP a cuatro grados centígrados en un rotador de extremo a extremo durante la noche. Transfiera la mezcla de homogeneización y anticuerpos a un nuevo tubo inferior redondo de dos mililitros que contenga perlas de proteína g lavadas e incube cuatro grados centígrados en el rotador a 24 RPM durante dos horas.
Separe las perlas magnéticas del sobrenadante utilizando una rejilla magnética. Guarde el sobrenadante como la fracción negativa que contiene los ARN en las células negativas de EGFP y los ARN en las células positivas de EGFP que no están unidas a los ribosomas. Agregue un mililitro de tampón de lavado con alto contenido de sal a las perlas y vorete brevemente el tubo para lavar las perlas.
Luego coloque el tubo en una rejilla magnética. Retire el tampón de lavado y repita los pasos de lavado dos veces más para obtener el complejo de ARN ribosómico de las perlas de las células positivas para EGFP. Incubar las perlas con 50 microlitros de tampón de extracción del kit de aislamiento de ARN en un ThermoMixer durante 30 minutos para liberar ARN de las perlas.
Separe las perlas con una rejilla magnética y transfiera el sobrenadante a un tubo de 1,5 mililitros. Centrifugar el tubo a 3000 g durante dos minutos. A continuación, pipetear el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros.
Para acondicionar previamente la columna de purificación de ARN, pipetear 250 microlitros de tampón de acondicionamiento en la columna de purificación e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego centrifugar la columna a 16, 000 g durante un minuto. Pipetear un volumen igual de etanol al 70% en el extracto celular y mezclar bien mediante pipeteo.
Pipetear hasta 200 microlitros de la mezcla en la columna de purificación de ARN preacondicionada. Para reducir la pérdida de muestras no llene la columna más del 80% de su capacidad. Repita este paso varias veces hasta que todos los ARN se recojan en la misma columna de cada fracción.
Centrifugar la columna durante dos minutos para unir el ARN a la membrana de la columna. Luego continúe la centrifugación durante 30 segundos. Deseche el flujo a través y pipete 100 microlitros de tampón de lavado uno en la columna.
Centrifugar durante un minuto, luego desechar el flujo a través. La pipeta 75 microlitros de solución de ADN se mezcla directamente en la membrana de la columna de purificación. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
Luego, pipetear 40 microlitros de tampón de lavado uno en la columna y centrifugar durante otros 30 segundos. Deseche el flujo a través. Pipetear 100 microlitros de tampón de lavado dos en la columna y centrifugar a 8, 000 g durante un minuto.
Deseche el flujo a través. Compre PET 100 microlitros de tampón de lavado dos en la columna y centrifugar a 16, 000 g durante dos minutos. Deseche el flujo y vuelva a centrifugar la misma columna a 16, 000 g durante un minuto para eliminar todos los restos de tampón de lavado.
Transfiera la columna a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. pipetear 12 microlitros de agua libre de RNasa directamente sobre la membrana de la columna de purificación asegurando que la punta de la pipeta no toque la membrana. Incubar a temperatura ambiente durante un minuto y centrifugar a 1000 g durante un minuto.
Luego, a 16, 000 G durante un minuto para eluyir el ARN. Utilice un bioanalizador para evaluar la calidad y cantidad del ARN extraído. Almacene los ARN en un congelador de 80 grados o envíelos para su posterior análisis.
Ratones portadores de alelos genéticos genéticamente modificados, Gli1-CreERT2 y NuTRAP se nos inyecta tamoxifeno una vez al día, cada dos días para tres inyecciones. El análisis de inmunofluorescencia de los tejidos recolectados muestra que el EGFP se expresó en células intersticiales en los testículos. EGFP también se encontró en células capsulares suprarrenales en ratones Gli1-CreERT2, NuTRAP.
En Sonic Hedgehog-CreERT2, ratones NuTRAP La población celular positiva de EGFP reside en la corteza externa de la glándula suprarrenal debajo de la cápsula, confirmando la expresión de células que expresan previamente EGFP. Después de la extracción de los ARN específicos del tipo de célula, el ARN extraído se envió para el análisis de microarrays. Los resultados mostraron que alrededor de 3000 genes se enriquecieron en la fracción positiva, en comparación con los genes en la fracción negativa, mientras que alrededor de 4.000 genes se enriquecieron en la fracción negativa.
Entre los genes diferenciales expresados, los genes asociados a células de Leydig Hsd11b1 y Hsd3b6 se enriquecieron en la fracción positiva. En la fracción negativa, se enriquecieron los genes asociados a las células de Sertoli Desert Hedgehog y Gstm6. Solo se identificaron unos pocos genes expresados diferencialmente al comparar la fracción negativa con la entrada.
Se utilizó RT-PCR cuantitativa en tiempo real para confirmar la expresión de genes clave en las fracciones positiva y negativa. Similar a lo que se encontró en el ensayo de microarrays, las enzimas esteroidogénicas 3-beta hidroxi esteroide deshidrogenasa y la enzima de escisión de la cadena lateral del colesterol se enriquecieron en la fracción positiva. Mientras tanto, el marcador celular de Sertoli SRY box factor de transcripción nueve y el marcador de células germinales sinaptonemal proteína tres del complejo se enriquecieron en la fracción negativa.
Al intentar este protocolo, es importante preparar un nuevo tampón de trabajo de homogeneización Agregue DTT, ribonucleasa recombinante de cicloheximida y cóctel de inhibidores de proteinasa a la solución madre de homogeneización solo antes de usar. También es importante preparar tampones frescos bajos en sal y los tampones de lavado con alto contenido de sal antes de su uso.
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Descripción general
Este protocolo describe un método para aislar ARN mensajeros ribosomales específicos de un tipo celular mediante el uso del modelo de ratón NuTRAP, lo que permite la extracción de ARN de alta calidad a partir de pequeñas poblaciones celulares sin necesidad de ordenación celular. El método es particularmente útil para estudiar células que expresan EGFP e identificar genes diferencialmente expresados asociados con tipos celulares específicos.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Biología celular
- Biología molecular
Antecedentes
- El modelo de ratón NuTRAP permite el aislamiento de ARN unido a ribosomas.
- Este enfoque evita las complicaciones del ordenamiento celular en tejidos heterogéneos.
Métodos Utilizados
- Recolección mediante GLP para aislamiento de ARN unido a ribosomas
- Modelo de ratón NuTRAP
- Análisis de microarrays y RT-PCR para validación de la expresión génica
Resultados principales
- Aproximadamente 3000 genes se enriquecieron en la fracción positiva de ARN, mientras que 4000 genes se enriquecieron en la fracción negativa.
- Se identificaron genes específicos relacionados con las células de Leydig y las células de Sertoli en las fracciones de ARN respectivas.
- Los genes de enzimas clave mostraron un enriquecimiento coherente con los hallazgos del microarreglo.
Conclusiones
- El estudio demuestra un método confiable para aislar ARN específicos de tipo celular.
- Los hallazgos contribuyen a la comprensión de la expresión génica en tipos celulares testiculares distintos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Aislar ARN específicos de tipos celulares a partir de tejidos heterogéneos sin clasificación celular aborda un desafío clave en la validación de objetivos y la reducción mecanicista de riesgos. El método NuTRAP basado en TRAP permite un perfilado transcriptómico cuantitativo y reproducible de poblaciones celulares definidas, lo que respalda la confianza predictiva en las etapas iniciales del descubrimiento. Este enfoque reduce el ruido biológico y mejora la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas en tipos celulares específicos dentro de tejidos complejos.
- Valor operativo: Evita artefactos derivados del ordenamiento celular, preservando los estados nativos del ARN para una validación fiable de dianas.
- Valor predictivo: Facilita el descubrimiento de biomarcadores y la clarificación de vías en sistemas relevantes para la enfermedad.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera entradas de ARN estandarizadas unidas a ribosomas para el desarrollo de ensayos posteriores.
- Valor operativo: Proporciona resultados cuantitativos reproducibles adecuados para la preparación de cribado de alto rendimiento.
- Escalabilidad: Compatible con material inicial limitado, lo que permite su reutilización en múltiples modelos que expresan EGFP.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la relevancia para la enfermedad al capturar transcriptomas específicos de cada tipo celular a partir de contextos tisulares nativos.
- Valor operativo: Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante una lógica consistente de aislamiento de ARN.
- Reducción de riesgos: Disminuye la ambigüedad mecanicista en los resultados de la interacción con el blanco y en los ensayos fenotípicos.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la identificación del blanco hasta la optimización del fármaco inicial, especialmente cuando la resolución por tipo celular es fundamental para obtener una comprensión mecanicista. Permite la verificación de hipótesis y la reducción de riesgos biológicos antes de las campañas de cribado de compuestos.
- Biología del Descubrimiento: Permite pruebas de hipótesis precisas en tejidos heterogéneos mediante el aislamiento de ARN en traducción a partir de poblaciones celulares definidas.
- Selección: Genera reservorios estandarizados de ARN asociados a ribosomas, adecuados para la validación de ensayos y pruebas de reproducibilidad.
- Análisis: Proporciona datos cuantitativos de expresión génica (por ejemplo, microarreglos, RT-PCR) que permiten comparaciones entre condiciones y la priorización de objetivos.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento inicial con trabajos preclínicos al preservar señales específicas de tipo celular en órganos complejos como el testículo y la glándula suprarrenal.
- Reutilización Empresarial: Adaptable a múltiples líneas de activadores Cre y NuTRAP, lo que la posiciona como una plataforma escalable para ómicas específicas de tipo celular.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del blanco al reducir las señales de confusión provenientes de tejidos heterogéneos.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización entre laboratorios mediante pasos estandarizados de lisis, inmunoprecipitación y recuperación de ARN.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos transcriptómicos más limpios e interpretables para la clasificación de carteras.
- Impacto en la cartera: Permite un avance ajustado al riesgo al aislar señales verdaderas específicas de tipo celular, reduciendo los falsos positivos en la validación posterior.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en manipulación de tejidos, inmunoprecipitación y técnicas de preservación de ARN.
- Depende del acceso a gradillas magnéticas, termomixers, centrífugas y columnas de purificación de ARN.
- Necesita la preparación estandarizada de tampones (homogeneización, lavado, elución) recién preparados antes de su uso para prevenir la actividad de RNasas.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen la validación de los niveles de expresión de EGFP y la eficiencia de unión a ribosomas en nuevos modelos con conductor Cre.
- Las limitaciones prácticas incluyen restricciones en la cantidad de tejido de entrada y la necesidad de concentraciones optimizadas de anticuerpos y perlas.
