Drosophila melanogaster Protocolo de inyección de larvas
19 de octubre de 2021
Las moscas adultas de Drosophila melanogaster se han utilizado ampliamente como organismos modelo para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a las respuestas inmunes innatas antimicrobianas del huésped y las estrategias de infección microbiana. Para promover la etapa de larva de D. melanogaster como un sistema modelo adicional o alternativo, se describe una técnica de inyección larvaria.
Este protocolo aborda las dificultades y desafíos con la larva microinyectante al describir un método preciso que permitirá el uso de la larva Drosophila melanogaster como modelo para diversos estudios inmunológicos y moleculares. Esta es una técnica de inyección simple que presenta un método eficiente, rentable y rápido para administrar repetidamente una variedad de sustancias de manera uniforme, lo que permite resultados consistentes y confiables. Comience seleccionando las larvas de la tercera etapa instar y lavándolas con la solución de Ringer en una pequeña placa de Petri.
Coloque un papel de filtro en una placa de Petri y humedézcalo con 5 ml de solución de Ringer. Luego coloque las larvas en el papel de filtro. Prepare los capilares utilizando tubos capilares de vidrio de 3.5 "en un extractor de micropipetas.
Abra el capilar de vidrio con la ayuda de pinzas de punto medio dentadas rectas. Llene el capilar abierto con aceite mineral con una jeringa desechable de plástico. Luego, expulse el aceite fuera del tubo capilar con un inyector de nanolitros.
Llene el capilar con la preparación bacteriana deseada para inyección. Transfiera las larvas anestesiadas a un papel de filtro humedecido con la solución de Ringer. Usando fórceps, aplique una presión firme en el lado dorsal del extremo posterior de las larvas, donde los espiráculos traqueales son evidentes.
Luego, inserte la aguja horizontalmente, hacia el extremo posterior de las larvas, e inyecte las existencias bacterianas. Retire los fórceps para evitar derrames de hemolinfa o intestino. Luego, retire la aguja previamente insertada en las larvas.
Infectar 20 larvas por cada condición experimental. Con un pincel, transfiera suavemente las larvas inyectadas a un papel de filtro húmedo separado. Agregue la solución de Ringer según sea necesario para evitar la desecación.
Incubar la placa de Petri en una incubadora a 25 C.Las larvas de Drosophila melanogaster infectadas con Photorhabdus asymbiotica exhibieron una tasa de supervivencia del 57% durante 24 horas después de la inyección, mientras que la larva inyectada con Escherichia coli mostró una tasa de supervivencia del 85% en el mismo punto de tiempo. La importancia de este método es que la aguja se mantiene aproximadamente paralela a la larva. La presión aplicada para retener a la larva es muy pequeña, lo que reduce la posibilidad de fuga de hemolinfa, lesiones fatales o entrega inadecuada de la sustancia deseada.
Esta técnica se puede perfeccionar con la práctica.
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Descripción general
Este protocolo describe una técnica de inyección en larvas de Drosophila melanogaster, diseñada para facilitar el uso de larvas en estudios inmunológicos y moleculares. El método aborda los desafíos asociados con la microinyección de larvas y proporciona un enfoque confiable para la administración de sustancias.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Microbiología
- Inmunología
Antecedentes
- Drosophila melanogaster es un organismo modelo ampliamente utilizado.
- Comprender las respuestas inmunitarias innatas antimicrobianas es crucial.
- Las etapas larvarias ofrecen información adicional sobre las estrategias de infección microbiana.
- Las técnicas de microinyección son esenciales para la consistencia experimental.
Objetivo del estudio
- Para promover a las larvas de D. melanogaster como un sistema modelo.
- Para proporcionar un método detallado para la microinyección en larvas.
- Para mejorar la confiabilidad de los estudios inmunológicos y moleculares.
Métodos Utilizados
- Seleccione larvas de tercer estadio para la inyección.
- Lave las larvas con solución de Ringer.
- Prepare capilares utilizando tubos capilares de vidrio.
- Injectione sustancias de manera uniforme en las larvas.
Resultados principales
- La técnica permite una administración eficiente de sustancias.
- Los resultados son consistentes y confiables entre experimentos.
- Método rentable adecuado para diversos estudios.
- Facilita la exploración de las respuestas inmunitarias en larvas.
Conclusiones
- La técnica de inyección en larvas es una herramienta valiosa para los investigadores.
- Amplía la utilidad de D. melanogaster en estudios científicos.
- La investigación futura puede aprovechar este método para obtener conocimientos más profundos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Las larvas de Drosophila melanogaster ofrecen un modelo genéticamente accesible y rentable para estudiar la inmunidad innata y las interacciones huésped-patógeno, lo que permite la validación temprana de dianas con una carga ética y financiera reducida. El protocolo de inyección en larvas mejora la reproducibilidad en los ensayos de respuesta inmune, apoyando la desactivación mecanicista de candidatos antimicrobianos e inmunomoduladores. Este enfoque conecta la biología del descubrimiento con la evaluación preclínica al proporcionar resultados cuantificables de supervivencia e infección en un sistema relevante para la enfermedad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas relacionadas con vías inmunitarias innatas y mecanismos de virulencia.
- Valor operativo: Proporciona un sistema escalable para la validación funcional de dianas mediante modelos de desafío microbiano.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al generar datos cuantitativos sobre infección y supervivencia para la evaluación de compuestos líderes.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Listo para ensayo: Proporciona procedimientos estandarizados de preparación e inyección de larvas para una exposición consistente a sustancias.
- Resultado cuantitativo: Permite la medición de tasas de supervivencia y carga de patógenos como variables dependientes en campañas de cribado.
- Reproducibilidad: Reduce la variabilidad técnica mediante un control de la mecánica de inyección y de las condiciones ambientales.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Modela respuestas inmunitarias innatas relevantes para el ser humano frente a patógenos bacterianos como Photorhabdus asymbiotica y Escherichia coli.
- Continuidad traslacional: Facilita el avance desde la validación de dianas iniciales hasta las pruebas de eficacia preclínicas en un contexto de organismo completo.
- Reducción del riesgo mecanicista: Clarifica las vías de defensa del huésped y las contribuciones de los factores de virulencia antes de realizar estudios en mamíferos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método de inyección en larvas se integra en la fase inicial del descubrimiento, apoya la validación de dianas basada en hipótesis y permite formatos de ensayo reproducibles para la selección de compuestos antes de la optimización del fármaco líder.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la validación funcional de dianas relacionadas con el sistema inmunitario mediante el desafío controlado con patógenos en larvas.
- Tamizaje: Genera datos de respuesta a la dosis y de supervivencia adecuados para el tamizaje de alto contenido de agentes inmunomoduladores o antimicrobianos.
- Análisis: Proporciona métricas cuantitativas de supervivencia (por ejemplo, tasas de supervivencia a las 24 horas) que permiten comparaciones entre diferentes condiciones experimentales y tratamientos.
- Investigación Traducional: Establece un sistema relevante para la enfermedad que permite evaluar el impacto terapéutico sobre los resultados de la infección antes de avanzar a modelos en roedores.
- Reutilización Empresarial: Representa una plataforma estandarizada y de bajo costo aplicable en múltiples proyectos de investigación en inmunología y enfermedades infecciosas.
Impacto Operacional y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en las interacciones huésped-patógeno.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad y la estandarización entre laboratorios mediante parámetros definidos de inyección y controles ambientales.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia en las decisiones de avance o interrupción al proporcionar señales tempranas de eficacia y toxicidad en un modelo de animal completo.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos basada en datos de supervivencia y eliminación de infección.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de larvas, anestesia y técnicas de microinyección.
- Depende del acceso a micropipeteadoras, inyectores de nanolitros y herramientas para la preparación de capilares de vidrio.
- Necesita la preparación estandarizada de solución de Ringer y el incubado ambiental a 25°C para obtener resultados consistentes.
- Implica consideraciones de adaptación al probar diferentes cepas microbianas o viscosidades de sustancias.
- Está limitado por el tamaño de las larvas y las restricciones de volumen de inyección, lo que puede restringir la administración de moléculas grandes o partículas.
