Name: Focalización de la placa neural murina mediante nanoinyección in utero (NEPTUNE) en el día embrionario 7.5 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Aprende el protocolo NEPTUNE para manipulación genética del sistema nervioso embrionario murino mediante nanoinyección in utero en el día embrionario 7.5. Este método permite la transducción uniforme de la placa neural con mínimos efectos adversos.

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Agradecemos a Bettina Semsch y Jia Sun (Infinigene) por el cuidado experto de ratones; Florian Salomons y Göran Månsson de Biomedicum Imaging Core (BIC) por su asistencia con la adquisición y consulta de imágenes. Financiación: Agradecemos a los siguientes financiadores por su apoyo a este proyecto: El Consejo Sueco de Investigación, Karolinska Institutet (KI Foundations, Career Development Grant, Ph.D. estudiante KID funding, y SFO StratNeuro funding, el Centro de Medicina Innovadora), The Ollie and Elof Ericssons Foundation, the Tornspiran Foundation, the Jeansssons Foundation, Sven and Ebba-Christina Hagbergs Prize and research Grant, Knut and Alice Wallenberg Project Grant, Fredrik and Ingrid Thurings Foundation, Lars Hiertas Minne, The Childhood Cancer Foundation (Barncancerfonden), The Åhlen Foundation, Åke Wibergs Foundation, Tore Nilssons Foundation, and the Swedish Foundations Starting Grant to ERA. Las figuras 4D,E fueron creadas con BioRender.com.

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Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.

Hay varios pasos en este protocolo que influyen en la supervivencia embrionaria, la calidad de las inyecciones y la lectura. La edad gestacional de los embriones se define como E0.5 al mediodía del día del tapón vaginal después del apareamiento nocturno. Realizar la verificación de ultrasonido para el embarazo en E6.5 al final de la tarde / noche asegura que los embriones estén lo suficientemente desarrollados como para ser identificados por ultrasonido. El control (1) permite la preselección de cuántos ratones con tapón positivo están realmente embarazadas, (2) garantiza que ningún virus se descongele innecesariamente y se desperdicie en caso de que los ratones con tapón positivo no estén embarazadas, y (3) reduce las intervenciones innecesarias en ratones (evita la cirugía en hembras no embarazadas).
En E7.5, los embriones son sensibles a las fuerzas externas y deben manipularse con cuidado. Por ejemplo, tirar de los cuernos uterinos o apretar las deciduas puede conducir a la reabsorción embrionaria. El tejido uterino siempre debe mantenerse húmedo cuando está fuera del abdomen femenino para evitar que el tejido se seque. La mayoría de las deciduas deben permanecer dentro del abdomen femenino, con solo 3-4 expuestas para inyecciones. La nitidez de la aguja es otro determinante crucial para el éxito de las inyecciones. Las puntas de aguja romas o rotas dan como resultado un pinchazo repetido de deciduas o compresión contra la arcilla de modelado antes de ingresar al aire acondicionado, lo que puede aumentar la tasa de reabsorción. Por lo tanto, las agujas bien molidas y afiladas siempre deben almacenarse de manera segura y reemplazarse después de un máximo de 2 hembras.
Este protocolo describe cómo dirigirse a la placa neural con una sola inyección de lentivirus. Además, muestra cómo la eficacia de la transducción se puede adaptar de clones de células individuales a todo el cerebro. Sin embargo, otros tejidos no neurales, incluyendo la piel y el epitelio oral, también están dirigidos. Además, se transducen todos los tipos celulares (progenitores y células diferenciadas), lo que hace que este enfoque sea eficiente pero inespecífico. El uso de MiniPromoters en la construcción viral conduce a la expresión específica del transgén en neuronas o astrocitos15. Esto tiene la ventaja de evitar el uso de animales Cre transgénicos dedicados y, por lo tanto, reduce la cantidad de mano de obra (mantenimiento de cepas y genotipado) y los costos.
Las limitaciones de NEPTUNE incluyen su dificultad técnica, los desafíos para obtener hembras preñadas a un ritmo predecible y consistente, y los costos de adquirir instrumentación especializada. Además, la orientación no selectiva de las células por lentivirus puede verse como un beneficio y una limitación de la técnica. La inyección de mayores volúmenes en el CA resulta en exencefalia13, aunque las malformaciones cerebrales y la exencefalia se evitan con los volúmenes descritos aquí15. Un impacto negativo en el desarrollo del cerebro es, por lo tanto, un riesgo con nanoinyecciones in utero que deben evitarse cuidadosamente inyectando volúmenes correctos adaptados a la etapa embrionaria y al tamaño de AC.
Las adaptaciones futuras de la técnica pueden centrarse en el tropismo viral. Los virus adenoasociados (AAV) tienen diferentes serotipos, que han demostrado dirigirse robustamente a diferentes tipos de células en el SNC17,26. Sin embargo, los AAV no se integran en el genoma de la célula huésped y, por lo tanto, pueden perderse en células con una alta tasa de división. Aunque hay varias maneras de aumentar la especificidad de NEPTUNO, los animales transgénicos siguen siendo el estándar de oro cuando se trata de manipulación de genes in vivo. Los ratones Cas9 y el lentivirus que codifica sgRNA se han utilizado para el cribado genético en la epidermis embrionaria27 y también pueden adaptarse al SNC en desarrollo.
Las inyecciones en el CA en E7.5 se dirigen eficientemente a las células del neuroectodermo antes del inicio de la neurulación y se dirigen al cerebro en desarrollo de manera más eficiente que la electroporación en el útero . Esto permite el estudio de señales genéticas importantes para el desarrollo del cerebro desde un punto de tiempo anterior. A diferencia de los modelos genéticos clásicos de ratón, NEPTUNE ofrece un enfoque flexible para realizar análisis genéticos funcionales. Los fenotipos después de la sobreexpresión o la eliminación de genes se pueden estudiar en días o semanas en comparación con meses o años. Las inyecciones de múltiples construcciones virales permiten la manipulación de varios genes dentro de un embrión y evitan la generación de animales knockout doble o triple. Por lo tanto, NEPTUNE no solo ahorra tiempo, sino que también puede reducir el número de animales utilizados en la investigación.

El cerebro y la médula espinal están entre los primeros órganos en iniciar la formación durante la embriogénesis 1,2. Aunque se están identificando los genes asociados con los trastornos del neurodesarrollo, el interrogatorio funcional de las variantes genéticas se haquedado atrás 3,4. Como la generación de ratones knockout condicionales puede llevar meses o años, una técnica alternativa para investigar rápidamente la función de los genes en el cerebro en desarrollo es de interés. En embriones de ratón, la neurulación, el proceso morfogenético por el cual la placa neural se transforma en el tubo neural para dar lugar al sistema nervioso central (SNC), ocurre entre los días 8 y 10 después de la concepción5. Antes del inicio de la neurulación, la placa neural, como parte del ectodermo, consiste en una sola capa de células columnares que proliferarán y se diferenciarán en los numerosos tipos de células neuronales y gliales dentro del SNC 6,7. Por lo tanto, para inducir experimentalmente alteraciones duraderas en la expresión génica en el SNC, dirigirse a la placa neural ofrece ventajas obvias, incluida la accesibilidad de todas las células progenitoras.
En neurociencia, la electroporación in ovo 8,9 y la transducción viral de embriones de ratón se han utilizado para manipular la expresión génica embrionaria del SNC. El embrión de pollo en desarrollo ha sido un modelo de elección para estudiar la función génica durante el desarrollo de la médula espinal debido a la accesibilidad del embrión de pollo en el huevo y la facilidad resultante de manipular la expresión génica. En particular, la electroporación in ovo plásmido genera condiciones experimentales y de control en cada médula espinal de pollo. La electroporación causa permeabilización de la membrana celular y dirige el ADN cargado negativamente lejos del cátodo (negativo) hacia el ánodo (positivo) aplicando un pulso eléctrico a través de dos electrodos al embrión. En ratones, la electroporación in utero generalmente se ha limitado a etapas embrionarias en las que la neurulación se ha completado, y el cerebro o la médula espinal ya consta de varias capas celulares, lo que resulta en una baja eficiencia de electroporación10. La electroporación de plásmidos da lugar a la expresión génica transitoria y generalmente se dirige a pocas células.
La microinyección in utero guiada por ultrasonido se ha utilizado para manipular diferentes estructuras embrionarias como la piel y el cerebro11,12,13,14. Sin embargo, las inyecciones dirigidas al SNC murino en desarrollo han mostrado baja eficacia o han impactado negativamente la supervivencia embrionaria12,13,14. Por lo tanto, se desarrolló un protocolo mejorado para la administración de lentivirus de alto título en la cavidad amniótica (CA) en E7.5, que se denominó NEPTUNO para la integración final enel útero 15. Las inyecciones dieron como resultado una eficacia de focalización duradera del >95% de todo el cerebro en E13.5. Además, se introdujo un paso de estadificación durante la verificación por ultrasonido del embarazo para clasificar a las hembras y los embarazos por etapa de desarrollo para minimizar los procedimientos innecesarios en animales de investigación y maximizar el éxito de la inyección. La eficiencia de la inyección y la supervivencia están estrechamente relacionadas con el aumento del tamaño de la CA. Por lo tanto, este documento describe cómo medir el tamaño de CA antes de la inyección para entregar un volumen adecuado a la CA que no causará la reabsorción del embrión. NEPTUNE es una alternativa robusta a los enfoques actuales en el útero y puede adaptarse para varios usos, incluidos, entre otros, estudios de ganancia y pérdida de función, rastreo de linaje o detección15,16.

<table><tbody><tr><td>Jeringa de 1 mL</td><td>BD Bioscience</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>27 G Aguja</td><td>BD Bioscience</td><td>300635</td><td></td></tr><tr><td>capilares de 3.5 pulgadas</td><td>Drummond Scientific</td><td>3000203G/X</td><td>Se utilizaron para tirar de agujas en casa</td></tr><tr><td>Transductor de la serie MS de 70 MHz</td><td>Visual Sonics</td><td>MS700</td><td></td></tr><tr><td>Aquasonic gel de ultrasonido transparente</td> Parker <td>Laboratories</td><td>Mar-50</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador Autoclip 9 mm</td><td>Angthos</td><td>12020-09</td><td></td></tr><tr><td>Ratones CD1</td><td>Charles River, Alemania</td><td>Crl:CD1(ICR)</td><td>Hembras: a partir de las 8 semanas de edad Machos: a partir de las 12 semanas de edad</td></tr><tr><td>Hisopo de algodón</td><td>OneMed Sverige AB 120788</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de vendaje delicadas rectas 13 cm</td><td>Agnthos</td><td>08-032-130</td><td></td></tr><tr><td>EG-400 Narishige Molinillo de Micropipetas</td><td>Narishige</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>EZ clips 9 mm</td><td>Angthos</td><td>59027</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Iris, Super Cut, recta, 9 cm</td><td>Agnthos</td><td>307-336-090</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorano</td><td>Baxter Medical AB</td><td>EAN: 50085412586613</td><td>Comprado en la farmacia sueca</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clarke</td><td>7557</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de membrana</td><td>Visual Sonics</td><td>SA-11053</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Modelado Clay</td><td>Sense AB</td><td>10209</td><td></td></tr><tr><td>Mesa de manejo de ratón</td><td>Visual Sonics</td><td>50249</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II Kit de inyector automático</td><td>Drummond</td><td>3-000-205A</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Placa</td> de Petri <td>Bemis HS234526C</td><td></td></tr><tr><td>con apertura central (pared baja)</td><td>Visual Sonics</td><td>SA-11620</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri, (&Oslash; xH): 92 x 16 mm</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td></td></tr><tr><td>Rely+On Virkon</td><td>DuPont</td><td>130000132037</td><td></td></tr><tr><td>desinfectante Membrana de silicona</td><td>Visual Sonics</td><td>SA-11054</td><td></td></tr><tr><td>Steri 250, esterilizador de perlas calientes</td><td>Angthos</td><td>31100</td><td></td></tr><tr><td>Cinta quirúrgica (1,25 cm x 9,14 m)</td><td>Medicarrier</td><td>67034</td><td></td></tr><tr><td>Vevo Compact Dual (Med. Air & O2) Sistema de Anestesia</td><td>Visual Sonics</td><td>VS-12055</td><td></td></tr><tr><td>Vevo Imaging Station 2</td><td>Visual Sonics</td><td>VS-11983</td><td></td></tr><tr><td>Vevo2100</td><td>Visual Sonics</td><td>VS-20047</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 6-0; Aguja C-3, 45 cm filamento púrpura</td><td>Agnthos</td><td>J384H</td><td></td></tr></tbody></table>

focalización de la placa neural murina mediante nanoinyección in utero (neptune) en el día embrionario 7.5

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

La manipulación de la expresión génica en el cerebro del ratón en desarrollo en el útero tiene un gran potencial para los estudios de genética funcional. Sin embargo, anteriormente se ha restringido en gran medida a la manipulación de etapas embrionarias posteriores a la neurulación. Se desarrolló un protocolo para inyectar la cavidad amniótica en el día embrionario (E)7.5 y administrar lentivirus, codificando cDNA o shRNA, apuntando al >95% de las células de la placa neural y la cresta neural, contribuyendo al futuro cerebro, médula espinal y sistema nervioso periférico. Este protocolo describe los pasos necesarios para lograr una transducción exitosa, incluida la molienda de las agujas capilares de vidrio, la verificación del embarazo, la estadificación del desarrollo mediante imágenes de ultrasonido y los volúmenes de inyección óptimos adaptados a las etapas embrionarias. 
Siguiendo este protocolo, es posible lograr la transducción del >95% del cerebro en desarrollo con lentivirus de alto título y, por lo tanto, realizar la manipulación genética de todo el cerebro. En contraste, es posible lograr la transducción en mosaico utilizando títulos virales más bajos, lo que permite la detección genética o el rastreo del linaje. La inyección en E7.5 también se dirige al ectodermo y la cresta neural que contribuyen a distintos compartimentos del ojo, la lengua y el sistema nervioso periférico. Por lo tanto, esta técnica ofrece la posibilidad de manipular la expresión génica en tejidos derivados de la placa neuronal y el ectodermo de ratón desde las etapas de preneurulación, con el beneficio de reducir el número de ratones utilizados en experimentos.

Los embriones inyectados en E7.5 con lentivirus11,12 hPGK-H2B-GFP se recolectaron en E13.5 y se examinaron bajo el microscopio de disección fluorescente (Figura 5A). La transducción exitosa de la placa neural da como resultado embriones con una fuerte expresión de un reportero fluorescente en el cerebro principalmente y en otros tejidos derivados del ectodermo, por ejemplo, la piel (Figura 5A, B). La inyección de un volumen excesivamente alto (mayor que los volúmenes recomendados aquí, por ejemplo, ≥500 nL) aumenta la presión en la CA y puede resultar en una reabsorción completa (datos no mostrados) o defectos del tubo neural como exencefalia (Figura 5A). Las inyecciones exitosas en E7.5 dan como resultado una transducción uniforme del cerebro anterior al cerebro posterior (Figura 5C-J).
Los títulos lentivirales de alrededor de 2 × 10 10 unidades infecciosas (IFU) logran más del 95% de focalización, mientras que los títulos de ~1 ×10 9 IFU logran una eficiencia de focalización del 15%15. Además, también se dirigen a estructuras que anteriormente han sido difíciles de atacar mediante electroporación, como el plexo coroideo17,18 (Figura 5 E, F). La eficacia de la transducción se puede modificar ajustando el título viral administrado en la CA. Las inyecciones de título bajo dan como resultado la transducción de clones de células individuales (Figura 5C, Figura 5E y Figura 5G, H), mientras que el uso del virus de título alto transduce casi el 100% de todo el cerebro (Figura 5D, Figura 5F, Figura 5H y Figura 5J ). Por lo tanto, NEPTUNE se puede utilizar para la transducción clonal, el rastreo del linaje y los enfoques de detección genética o para estudiar los efectos globales de la sobreexpresión de genes o la regulación negativa en todo el cerebro.
El desarrollo del ojo de los mamíferos es el resultado de una comunicación bien organizada entre tres derivados del ectodermo embrionario: la retina neural (NR) y el epitelio pigmentario de la retina (EPR) se derivan del neuroepitelio del prosencéfalo ventral, mientras que el ectodermo superficial da lugar al futuro cristalino y epitelio corneal. Sin embargo, el estroma central y el endotelio posterior, las otras dos capas de la córnea, se derivan de las células de la cresta neural del mesénquima periocular19,20. Las secciones coronales a través de embriones E13.5, inyectados en E7.5 con lentivirus de alto título mostraron, similar al cerebro, una transducción alta y uniforme del tejido neural del ojo, así como del cristalino, la córnea y el mesénquima (Figura 5K). A medida que la neurulación progresa, las inyecciones en E8.5 y E9.5 dan como resultado la orientación continua del cristalino y el epitelio corneal (Figura 5L y Figura 5N), mientras que la transducción de los tejidos derivados del neuroectodermo del ojo es menos eficiente en E8.5 (Figura 5L, M) o no dirigida a E9.5 (Figura 5N).
Mientras que la mayoría de las partículas virales infectan los tejidos expuestos después de la inyección, algunas partículas transducen tejidos derivados no ectodérmicos que se desarrollan más tarde (Figura 6A). Las glándulas y conductos salivales se desarrollan alrededor de E11.5 a partir del epitelio oral21 y son atacados con NEPTUNO (Figura 6B). Después de las inyecciones en E9.5, el epitelio lingual de la lengua se transduce bien; sin embargo, el mesénquima subyacente es negativo (Figura 6C; los corchetes denotan células transducidas; asteriscos denotan señales de autofluorescencia no células transducidas). Además, hay grupos positivos dentro del epitelio lingual, separados por secciones negativas (Figura 6C, puntas de flecha blancas), lo que sugiere la transducción de la superficie de la papila. Las células de la cresta neural han sido descritas en el mesénquima subyacente de la lengua y dentro del epitelio lingual, donde están involucradas en el desarrollo de papilas gustativas y papilas gustativas22. De hecho, las inyecciones en E7.5 dan como resultado una transducción generalizada del mesénquima de la lengua en E13.5 (Figura 6D), lo que sugiere que las inyecciones tempranas se dirigen a las células de la cresta neural, contribuyendo al mesénquima en la lengua.
En los vertebrados, los ganglios de la raíz dorsal (GRD) son un componente central del sistema nervioso periférico (SNP), ya que toda la entrada somatosensorial de la periferia del cuerpo (temperatura, dolor, presión) se transmite al cerebro a través de la activación de las neuronas DRG23. Tanto las neuronas como las células gliales del DRG se derivan de las células de la cresta neural del tronco24. La inyección lentiviral, en la que el promotor ubicuo de hPGK controla la expresión del reportero fluorescente, conduce a una orientación generalizada del sistema nervioso central y periférico (Figura 7A), transduciendo tanto neuronas como progenitores en la médula espinal (Figura 7B), así como el DRG (Figura 7C). El uso de un MiniPromoter para la doble cortina25 permite limitar la expresión de GFP solo a las neuronas (15 y Figura 7D, E).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3.jpg"> Figura 5: Alta eficiencia o transducción clonal con NEPTUNE. (A) embriones E13.5 bajo un microscopio de disección iluminados con iluminación estándar (panel izquierdo) y los mismos embriones iluminados para GFP (panel derecho). Embrión no inyectado en el extremo izquierdo, embrión inyectado con éxito en el extremo derecho, produciendo señal positiva en el cerebro (embrión más a la derecha). Embrión exencefálico por exceso de volumen inyectado (embrión medio). (B) Orientación de la piel y el cerebro con inyección E7.5. Barra de escala = 50 μm. (C, D) E13.5 imágenes confocales del cerebro anterior con baja transducción clonal (C) o transducción de alta eficiencia (D). (C, E, G, I) Transducción clonal de diferentes regiones del cerebro. (D, F, H, J) Transducción de alta eficiencia de diferentes regiones del cerebro. Barras de escala = 200 μm. Las diferentes eficacias de transducción son representativas de otras áreas del SNC. (E, F) Orientación del plexo coroideo, clonalmente (E) o con alta eficiencia (F). Barras de escala = 200 μm. (G, H) Orientación clonal (G) y focalización de alta eficiencia (H) del cerebro posterior, ampliada en (I, J). Barras de escala = 200 μm. (K) Expresión del reportero de GFP en el ojo en E13.5 después de la inyección en el útero en E7.5 (L, M) Expresión del reportero de GFP en el ojo en E15.5 después de la inyección en el útero en E8.5 (L), región en caja ampliada en (M), o en E9.5 (N). Los vasos sanguíneos autofluorescentes están marcados con estrellas blancas. Barras de escala = 100 μm. Abreviaturas: NEPTUNO = ne ural plate targeting with in uteronano-injection; C = córnea; LE = epitelio del cristalino; LF = Fibras de lente; M = mesénquima; NR = retina neural; ON = nervio óptico; EPR = epitelio pigmentario de la retina; GFP = proteína verde fluorescente; SNC = sistema nervioso central. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig06.jpg"> Figura 6: Transducción in utero de tejidos no neurales. (A) Imagen confocal de la cavidad oral E15.5. El embrión fue inyectado con lentivirus reportero fluorescente en E9.5. Barra de escala = 200 μm. (B, C) (B) Ampliación del panel insertado; epitelio del conducto salival transducido con virus. (C) Ampliación del panel insertado; epitelio lingual dorsal transducido con el virus reportero GFP (corchete blanco). El mesénquima subyacente derivado de las células de la cresta neural es negativo. Las puntas de flecha blancas indican papilas con células negativas de la cresta neural rodeadas de células epiteliales transducidas por virus (las células / vasos sanguíneos autofluorescentes están marcados con estrellas blancas). Barras de escala = 50 μm. (D) Imagen esquemática y confocal del mesénquima de la lengua E13.5 después de inyecciones con virus reportero fluorescente en E7.5. Barra de escala = 50 μm. Abreviaturas: D = Dorsal; M = mesénquima; N = nasofaringe; SLD = conducto sublingual; SMD = conducto submandibular; T = lengua; V = Ventral; GFP = proteína verde fluorescente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig07.jpg"> Figura 7: Transducción de células ganglionares de la raíz dorsal derivadas de la cresta neural. (A) La focalización de NEPTUNO en E7.5 permite la focalización tanto del SNC como del SNP. (B) La imagen confocal de la médula espinal E13.5 y DRG inyectados con lentivirus reportero hPGK-H2B-GFP en E7.5 muestra la transducción de progenitores neurales SOX2 + y neuronas NeuN +. Barra de escala = 100 μm. (C) Región recuadrada de B que muestra el DRG con expresión de GFP en poblaciones celulares SOX2+ (flechas blancas) y NeuN+ (puntas de flecha blancas). Barra de escala = 20 μm. (D) Imagen confocal de la médula espinal E13.5 y DRG inyectada con lentivirus DCX-H2B-GFP en E7.5, dirigida solo a células DCX +. Barra de escala = 100 μm. (E) Región en caja de D que muestra DRG con expresión de GFP restringida a neuronas DCX+ (puntas de flecha blancas). Las celdas DCX son negativas para GFP (flechas blancas). Barra de escala = 20 μm. Abreviaturas: NEPTUNO = ne ural plate targeting with in utero nano-injection; SNC = sistema nervioso central; SNP = sistema nervioso periférico; DRG = ganglios de la raíz dorsal; GFP = proteína verde fluorescente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

En este protocolo, describimos cómo inyectar lentivirus la cavidad amniótica del ratón en E7.5, lo que lleva a una transducción uniforme de toda la placa neural, con efectos perjudiciales mínimos sobre la supervivencia o el desarrollo embrionario.

Focalización de la placa neural murina mediante nanoinyección in utero (NEPTUNE) en el día embrionario 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...

NEPTUNE permite la focalización y manipulación genética del sistema nervioso embrionario del ratón desde el día embrionario 7.5 y permite la generación de modelos de knockdown o rastreo de linaje en días. Este protocolo es adaptable, flexible y rápido. Podemos entregar shRNA, cdRNA o bibliotecas virales con código de barras para abordar diferentes preguntas en días en lugar de meses o años.Esperamos que NEPTUNE proporcione información en neurociencia, pero también se puede adaptar a otros sistemas de órganos. Identificar la cavidad amniótica puede ser bastante difícil, así que tómese su tiempo para mirar la imagen de ultrasonido y tal vez tenga un libro de texto u otro recurso de anatomía a mano. Para comenzar a cargar la aguja, deslice la aguja de vidrio sobre el émbolo de metal, manteniendo la pinza unida pero ligeramente aflojada.Luego, empuje la aguja capilar junto con el émbolo metálico a través de la junta delantera hasta que llegue al espaciador. Presione Empty para empujar el émbolo dentro de la aguja y expulsar el aceite de la punta de la aguja. Luego presione Rellenar para crear una burbuja de aire, dividiendo el aceite y la solución.Finalmente, baje la aguja, sumerja la punta en la solución y presione Rellenar nuevamente para cargar la aguja. Después de fijar un ratón hembra anestesiado con cavidades amnióticas de tamaño ideal en la mesa de calentamiento, aplique gel para los ojos en ambos ojos para evitar la desecación corneal e inyecte un analgésico por vía subcutánea. Luego, esterilice la parte inferior del abdomen limpiando con un paño empapado con 0.5 miligramos por mililitro de solución de clorhexidina y seque la piel.Luego, usando tijeras quirúrgicas, haga una incisión vertical de 1.5 a 2 centímetros en la línea media de la piel en la parte inferior del abdomen. Luego levante la piel suavemente y libérela de la capa muscular subyacente aproximadamente un centímetro alrededor del punto de incisión para facilitar la sutura después de la cirugía. A continuación, haga una incisión vertical de un centímetro en la línea media en la capa muscular.Usando un par de fórceps, levante un lado de la piel y la capa muscular, y con otro par, busque los cuernos uterinos. Luego, usando fórceps, sostenga el tejido entre los embriones y saque con cuidado ambos cuernos uterinos del abdomen. Cuente y numere los embriones, ya sea desde el ovario hasta el cuello uterino o desde el cuello uterino hasta el ovario, en ambos lados.Luego, con un hisopo de algodón húmedo, empuje suavemente todos los embriones hacia la cavidad abdominal, excepto los tres primeros que se inyectarán. Luego, coloque una gota de PBS en una membrana elástica pegada a la abertura central redonda de una placa de Petri modificada disponible comercialmente y sosténgala inmediatamente por encima de los embriones. Inserte fórceps cerrados en la incisión del elástico, luego suelte los fórceps para abrir la incisión elástica, dejando caer el líquido sobre los embriones.Usando fórceps, tire de la sección del útero correspondiente a los tres embriones a través del elástico y pose suavemente la placa de Petri en el abdomen del ratón. Usando cuatro pies de arcilla, asegure y fije la placa de Petri sobre el abdomen para reducir la presión sobre el ratón y también reducir la sensibilidad de las imágenes a la respiración y los latidos del corazón del ratón. Luego, usando fórceps y un hisopo de algodón húmedo, ajuste el útero y el elástico para asegurarse de que el elástico esté sellado alrededor de la piel del ratón, evitando fugas de PBS.Luego, para fijar el útero, presione el cilindro de arcilla de modelar hacia abajo a la derecha de los embriones o el útero y agregue PBS a la placa de Petri hasta que los embriones y el útero estén completamente cubiertos con el PBS. Para facilitar el registro de las inyecciones, sumerja la sonda de ultrasonido en el PBS y ajuste el ratón o la mesa quirúrgica para que el primer embrión esté alineado con la sonda de ultrasonido. Escanee a través de los tres embriones e inspeccione las cavidades amnióticas.Luego, usando la máquina de ultrasonido, mida el diámetro de la cavidad amniótica para determinar el volumen de inyección apropiado. Usando el controlador de inyección, ajuste los volúmenes de inyección determinados y la velocidad de inyección a disminuir, con una velocidad de inyección de 23 nanolitros por segundo. Después de bajar la aguja en el PBS, utilizando las ruedas principales del sistema de riel, presione Empty en el controlador del nanoinyector hasta que el líquido llegue a la punta de la aguja.Luego, levante la aguja fuera del PBS y presione Inyectar para verificar que se descargue una gota del volumen deseado aproximado. Baje la aguja en el PBS nuevamente y mueva el nanoinyector con la rueda del plano Y en el micromanipulador para alinear la aguja con la sonda de ultrasonido y el embrión. Ajuste el ángulo de la aguja con la rueda angular de inyección para asegurar un ángulo de inyección casi perpendicular en relación con la pared uterina.Luego, usando la rueda de inyección en el micromanipulador, inserte la aguja en la cavidad amniótica en un solo movimiento. Si la punta de la aguja desaparece de la imagen de ultrasonido, mueva la sonda hacia adelante o hacia atrás para volver a enfocar la aguja. Luego, inyecte el volumen deseado presionando Inyectar durante el número apropiado de veces.Después de inyectar el volumen requerido, espere de 5 a 10 segundos antes de retraer la aguja en un movimiento suave. Mueva la etapa al siguiente embrión y repita la inyección para los otros dos embriones como se demuestra. A continuación, levante la sonda de ultrasonido y la aguja fuera del PBS usando el micromanipulador, alejando la aguja del operador para evitar daños y lesiones.Usando fórceps, coloque el primer y segundo embriones de nuevo en el abdomen empujándolos suavemente a través del elástico. Luego, agarre suavemente el tejido adyacente al tercer embrión y tire del útero hacia el extremo superior de la incisión elástica. Tire suavemente del cuarto al sexto embrión con fórceps y permita que el tercer embrión vuelva a entrar en el abdomen.Después de inyectar todos los embriones con cavidades amnióticas óptimas, empuje suavemente los embriones y el útero hacia el abdomen del ratón. La transducción exitosa de la placa neural da como resultado embriones con una fuerte expresión de un reportero fluorescente en el cerebro y otros tejidos derivados del ectodermo, como la piel. La inyección de volúmenes excesivamente altos puede provocar defectos del tubo neural, como exencefalia.Las inyecciones exitosas en el día embrionario 7.5 dan como resultado una transducción uniforme del cerebro anterior al cerebro posterior, incluido el plexo coroideo. Las inyecciones de título bajo dan como resultado la transducción de clones unicelulares, mientras que el virus de título alto transduce casi el 100% de todo el cerebro. Las secciones coronales hasta embriones embrionarios del día 13.5 mostraron una transducción alta y uniforme del tejido neural del ojo, el cristalino, la córnea y el mesénquima.Después de la inyección en el día embrionario 9.5, las glándulas salivales y los conductos se desarrollan alrededor del día embrionario 11.5 del epitelio oral. El epitelio lingual de la lengua está bien transducido, mientras que el mesénquima subyacente es negativo. Además, los grupos positivos dentro del epitelio lingual están separados por secciones negativas, lo que sugiere la transducción de la superficie del papilar.Las inyecciones en el día embrionario 7.5 dan como resultado una transducción generalizada del mesénquima de la lengua en el día embrionario 13.5, lo que sugiere que las inyecciones tempranas se dirigen a las células de la cresta neural, contribuyendo al mesénquima en la lengua. Las inyecciones lentivirales también conducen a una orientación generalizada del sistema nervioso central y periférico, transduciendo neuronas y progenitores en la médula espinal, así como los ganglios de la raíz dorsal. Una buena preparación es esencial.Asegúrese de que no haya fugas y que los embriones estén bien fijados, de modo que pueda concentrarse completamente en las inyecciones en la cavidad de la rata. Después de NEPTUNO, el análisis se puede realizar mediante varios métodos, como el análisis inmunofluorescente del cerebro, la secuenciación de ARN de una sola célula o permitir que los embriones inyectados nazcan para el análisis del comportamiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

En la cirugía de la supervivencia en ratones in utero permite la manipulación molecular de la expresión génica durante el desarrollo. A continuación se describe el uso de alta frecuencia, la ecografía para guiar la inyección de vectores retrovirales en el cerebro del ratón en el día embrionario (E) 9.5.

Guiada por ultrasonido microinyección en el cerebro anterior Ratón In Utero En E9.5

En la electroporación in utero es un método valioso para la transfección de células progenitoras neuronales in vivo. Dependiendo de la colocación de los electrodos y el punto de tiempo en el desarrollo de la electroporación, ciertos subconjuntos de células corticales pueden ser atacadas. Células afectadas puede ser analizada en vivo o in vitro para los efectos de la alteración genética.

En el útero de electroporación seguido por cultivos neuronales primarias para estudiar la función génica en el subconjunto de neuronas corticales

En el útero de la electroporación permite la entrega rápida de genes en un espacio-temporal y controlado de manera en el desarrollo del sistema nervioso central (SNC). Aquí se describe una muy adaptable en el protocolo de electroporación in utero que puede ser utilizado para entregar las construcciones de expresión en múltiples dominios del SNC embrionario, incluyendo el telencéfalo, diencéfalo y la retina.

Entrega génica eficaz en los territorios del SNC múltiples utilizando In Utero La electroporación

Un método de transferencia de genes en el cerebro del ratón en desarrollo se describe mediante el uso de un método único quirúrgica y la forma especial de los electrodos. Esta técnica única permite la transfección de ADN de plásmido temporal y espacialmente, lo que ayudará a muchos neurocientíficos en el estudio de desarrollo del cerebro.

Del ratón en el útero de electroporación: Transefection controlada Gene espacio-temporal

Un método que permite la manipulación directa farmacológico de embriones de ratón durante la neurulación que no pasa por el metabolismo materno se describe. La técnica se puede adaptar a estudiar diferentes aspectos de la neurulación variando el punto en el tiempo y el agente farmacológico.

Cierre del tubo neural en el cultivo de embriones de ratón entero

Fuente: Mangold, K., H el. al., Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5. J. Vis. Exp. (2022)Este video demuestra el método de nanoinyección en el útero para la orientación de la placa neural en un modelo de ratón embrionario. Se inyecta una solución lentiviral de alto título en la cavidad amniótica, donde se integra en las células de la placa neural, lo que permite una manipulación génica estable para la investigación del neurodesarrollo y las...

Manipulación de células de placa neural a través de nanoinyección en el útero en un modelo de ratón embrionario

El objetivo de este protocolo es para describir un deficitaria y ganancia de función que el método es aplicable para identificar neogenin como un receptor de la etapa específica que lleva a trophectoderm y diferenciación masa celular interna de embriones de preimplantación ratón.

Deficitaria y en el enfoque de ganancia de función de investigar la célula destino temprano Determinantes de preimplantación embriones de ratón

Aquí, presentamos un protocolo para utilizar mapas de destino y trazadores de linaje para dirigir inyecciones en blastómeros individuales que dan lugar al riñón de embriones de Xenopus laevis.

Técnica de microinyección a Target a los países en desarrollo<em&gt; Xenopus</em&gt; riñón

La combinación de microscopía electrónica de transmisión y transducción de señales en el útero es un poderoso enfoque para estudiar los cambios morfológicos en la ultraestructura fina del sistema nervioso durante el desarrollo. Este método combinado permite penetraciones profundas en cambios en los detalles estructurales subyacentes de neuroplasticidad con respecto a su representación topográfica.

Evaluación de parámetros de neuroplasticidad ultraestructurales después en la transducción de útero de cerebro de ratón en desarrollo y a la médula espinal

Células neurales del tallo/progenitor exhiben varias dinámicas de expresión de los componentes de señalización de la muesca que conducen a diferentes resultados de los eventos celulares. Dicha expresión dinámica puede revelarse mediante monitoreo en tiempo real, no mediante análisis estáticos, utilizando un sistema de imágenes de bioluminiscencia altamente sensible que permite la visualización de cambios rápidos en expresiones génicas.

Imágenes de bioluminiscencia en tiempo real de la dinámica de señalización de muesca durante la neurogénesis de la murino

Aquí se presenta un protocolo para realizar la manipulación genética en el cerebro de hurón embrionario utilizando en la electroporación del útero. Este método permite la focalización de células progenitoras neuronales en el neocórtex in vivo.

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

Aprende el protocolo NEPTUNE para manipulación genética del sistema nervioso embrionario murino mediante nanoinyección in utero en el día embrionario 7.5. Este método permite la transducción uniforme de la placa neural con mínimos efectos adversos.

Focalización de la placa neural murina mediante nanoinyección in utero (NEPTUNE) en el día embrionario 7.5

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