Name: Cromatografía semidirigida de ultra alto rendimiento acoplada al análisis de espectrometría de masas de metabolitos fenólicos en plasma de adultos mayores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Aprende a detectar metabolitos fenólicos en plasma mediante cromatografía UPLC-MS/MS semidirigida. Este método permite evaluar intervenciones nutricionales en adultos mayores y mejorar su estado metabólico.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Los autores agradecen el apoyo financiero del CONACYT, México (CB- 2016-01-286449) y UACJ-PIVA (Proyectos 313-17-16 y 335-18-13). OAMB desea agradecer al CONACYT por su beca de doctorado. Se agradece el apoyo técnico de la oficina de Producción Multimedia de la UACJ.

Las muestras de plasma utilizadas en este protocolo fueron recolectadas en un estudio previo siguiendo todos los lineamientos éticos y aprobado por el Comité Institucional de Ética y Bioética (CIEB-2018-1-37) de la Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. El protocolo completo para la extracción e identificación de los compuestos fenólicos y metabolitos en plasma por UPLC-MS/MS está representado en la Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63164/63164fig01.jpg"> Figura 1: Representación esquemática de la extracción e identificación de compuestos fenólicos y metabolitos en plasma mediante el método semi-dirigido UPLC-MS/MS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63164/63164fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
1. Preparación de la muestra
<ol><li>Conservar las muestras de plasma a -80 °C hasta su análisis.</li>
	<li>Descongelar las muestras de plasma a temperatura ambiente durante 15 min. NOTA: Las muestras se pueden colocar en un baño de agua a 37 °C para acelerar el proceso (5 min).</li>
	<li>Coloque 200 μL de muestra de plasma en un microtubo de 2 ml y mezcle con 1.000 μL de etanol puro. Vórtice la muestra de plasma durante 30 s. NOTA: Siempre use guantes cuando trabaje con muestras de plasma.</li>
	<li>Centrifugar la muestra a 6.580 x g durante 5 min. Después de la centrifugación, recoja el sobrenadante con una micropipeta o pipeta Pasteur y colóquelo en un nuevo microtubo. Conservar el sobrenadante a 4 °C.</li>
	<li>Mezclar el pellet del paso anterior con 1.000 μL de etanol al 100%, vórtice durante 30 s, y luego centrifugar a 6.580 x g durante 5 min. NOTA: El pellet está fuertemente envasado y debe resuspendirse bien para garantizar el contacto entre la muestra y el etanol puro. Se recomienda el uso de una micropipeta para enjuagar el pellet con etanol.</li>
	<li>Después de la centrifugación, recoger el sobrenadante y mezclar con el sobrenadante previamente obtenido del Paso 1.4. en un microtubo de 2 ml.</li>
	<li>Elimine el etanol de la muestra mediante el uso de nitrógeno puro (99.997%) a 135 psi. Mantenga la aguja a 1 cm de distancia de la parte superior del microtubo para evitar la pérdida de muestra y enjuague hasta que la muestra esté seca. No se necesita calor para evaporar el etanol. NOTA: El flujo de nitrógeno debe ser bajo para evitar la pérdida de muestra. Una vez que el etanol se haya secado, mantenga el flujo de nitrógeno durante al menos 5 minutos para garantizar la sequedad de la muestra. El protocolo se puede pausar en este punto; las muestras deberán almacenarse a -20 °C. Evite almacenar las muestras durante más de 12 h.</li>
	<li>Resuspend las muestras secas en 100 μL de una mezcla de acetonitrilo: agua en una proporción de 50:50 (v:v).</li>
	<li>Filtre la muestra a través de una membrana de jeringa de nylon de 0,45 μm directamente en un microinserto de vial de HPLC. NOTA: Las muestras en el vial se pueden almacenar a -20 °C antes del análisis. Almacene las muestras durante no más de 8 h. Se recomienda inyectar las muestras en el sistema UPLC justo después de la filtración.</li>
</ol>2. Análisis UPLC-MS/MS
<ol><li>Inyectar 3 μL de muestra en un UPLC equipado con una columna de fase inversa C18 (50 mm x 2,1 mm; 1,8 μm). Ajuste la temperatura del muestreador automático a 20 °C y el termostato de columna a 25 °C. Inyecte cada muestra por triplicado.</li>
	<li>Use ácido fórmico al 0.1% (v:v) en agua como solvente A, y 100% acetonitrilo como solvente B. Establezca el caudal en 0.4 mL/min y un programa de gradiente de la siguiente manera: 0-1 min 10% B, 1-4 min 30% B, 4-6 min 38% B, 6-8 min 60% B, 8-8.5 min 60% B, 8.5-9 min 10% B (Tabla 1).</li>
	<li>Ajuste el espectrómetro de masas a ionización en modo negativo. Utilice nitrógeno como gas de secado a 340 °C y un caudal de 13 L/min. Ajuste la presión del nebulizador a 60 psi. Ajuste el voltaje capilar a 4.000 V, el voltaje del fragmentor a 175 V y el voltaje skimmer a 65 V. Utilice la energía de colisión a 20 V (Tabla 2).</li>
	<li>Escanee las masas entre 100-1100 la relación masa-carga (m/z) y, para MS/MS, escanee masas entre 50-1000 m/z (Tabla 2). Establezca la adquisición de datos en modo MS/MS automático. Utilice la siguiente masa de referencia: 119.036 y 966.0007.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tiempo (min)</td>
			<td>Disolvente A (0,1 % de ácido fórmico en agua HPLC)</td>
			<td>Disolvente B (100 % acetonitrilo)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 a 1</td>
			<td>90</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 a 4</td>
			<td>70</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>De 4 a 6</td>
			<td>62</td>
			<td>38</td>
		</tr>
<tr>
<td>De 6 a 8</td>
			<td>40</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>De 8 a 8,5</td>
			<td>40</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>8,5 a 9</td>
			<td>90</td>
			<td>10</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Gradiente de fase móvil utilizado para la separación de compuestos fenólicos por UPLC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Modo de ionización</td>
			<td>Negativo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gas de secado</td>
			<td>Nitrógeno a 340 °C, caudal 13 L/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Presión del nebulizador</td>
			<td>60 psi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tensión capilar</td>
			<td>175 V</td>
		</tr>
<tr>
<td>Masas de escaneo MS</td>
			<td>100-1100 m/z</td>
		</tr>
<tr>
<td>Masas de escaneo MS/MS</td>
			<td>50-1000 m/z</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Parámetros de ionización para el análisis MS/MS.
3. Construcción de bases de datos
<ol><li>Búsqueda de compuestos fenólicos, metabolitos fenólicos u otros compuestos de interés en la literatura científica.</li>
	<li>Abra el software de gestión de bases de datos incluido en el sistema UPLC. Seleccione archivo | Nueva biblioteca compuesta de base de datos personales (PCDL) | Crear nuevo PCDL. Seleccione el tipo de PCDL: LC/MS Metabolomics. Establezca un nombre para el PCDL. A continuación, seleccione Crear.</li>
	<li>En la barra de herramientas, seleccione PCDL y, a continuación, la opción Permitir edición . A continuación, haga clic en el botón Buscar compuestos . NOTA: Dado que se trata de un nuevo PCDL, los resultados de la tabla estarán vacíos. Esto cambiará una vez que se agreguen nuevos compuestos al PCDL.<ol>
<li>Agregue compuestos a la biblioteca de compuestos de la base de datos personal especializada copiándolos de la biblioteca general del instrumento. Abra la base de datos existente del instrumento incluida en el software de administración de bases de datos. Haga clic en el botón Buscar compuestos. En la opción Búsqueda única , introduzca los criterios de búsqueda de compuestos para encontrar el compuesto de interés. NOTA: Los compuestos se pueden encontrar por nombre, fórmula molecular, masa exacta y tiempo de retención.</li>
		<li>En la tabla de resultados compuestos, seleccione el compuesto de interés. Para seleccionar más de un compuesto, haga clic en el primer compuesto, mantenga presionada la tecla CTRL y, a continuación, haga clic en cada compuesto de interés. Luego, haga clic derecho en todos los compuestos resaltados y seleccione Anexar a PCDL.</li>
		<li>En la nueva ventana, busque y seleccione el archivo de base de datos personal especializado. Marque las casillas Incluya espectros para compuestos si están presentes e Incluya información de movilidad iónica para compuestos si está presente. Haga clic en el botón Anexar . En el nuevo cuadro de diálogo, seleccione Sí para comprobar los nuevos compuestos agregados. Seleccione No para seguir buscando más compuestos de interés.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si los compuestos de interés no están disponibles en la biblioteca general del instrumento, agregue nuevos compuestos manualmente.<ol>
<li>Abra la base de datos personal especializada. Una vez abierto, siga el paso 3.3. Seleccione la opción Editar compuestos . Haga clic en el botón Agregar nuevo .</li>
		<li>En la sección superior de la ventana, complete la información del nuevo compuesto. Rellene la fórmula, el nombre, el nombre de la IUPAC, el número CAS, el ID de Chemspider y otros identificadores.</li>
		<li>Utilice la información disponible en las bibliotecas en línea gratuitas (Chemspider, PubChem y Phenol Explorer) para completar la información del nuevo compuesto de interés. Una vez terminado, haga clic en el botón Guardar como nuevo para guardar la nueva información compuesta en la base de datos personal especializada. NOTA: Al agregar información de bibliotecas gratuitas, asegúrese de incluir la información del compuesto sin la presencia de iones cloruro o yoduro. Esto puede modificar la masa exacta y la fórmula molecular del compuesto de interés.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repite el proceso con todos los compuestos de interés para completar la base de datos personal especializada.</li>
</ol>4. Análisis de datos
<ol><li>Utilice el software de gestión cualitativa del instrumento para identificar los compuestos fenólicos y los metabolitos fenólicos presentes en las muestras.</li>
	<li>Abra el archivo de ejemplo. En el panel Cromatograma, seleccione Definir cromatogramas y extraiga el cromatograma iónico total (TIC), el cromatograma iónico extraído de MS (EIC) y el EIC de MS/MS. Seleccione la opción integrar cromatograma.</li>
	<li>En el panel Buscar compuestos , seleccione Buscar por opciones de fórmula. En la nueva ventana, seleccione Origen de fórmula y, a continuación, la opción Base de datos/Biblioteca . Encuentre la base de datos personal creada anteriormente y haga clic en Abrir.</li>
	<li>Seleccione la opción Coincidencia de fórmulas y establezca una tolerancia de coincidencia de masa de 5 partes por millón (ppm). NOTA: Se puede establecer una tolerancia de coincidencia diferente de masas en 10 ppm; esta diferencia depende del espectrómetro de masas utilizado.</li>
	<li>Seleccione la opción Iones negativos y seleccione sólo el cuadro de diálogo -H . En la opción Resultados , marque los cuadros de diálogo Extraer EIC, Extraer espectro limpio, Extraer espectro sin procesar e Incluir estructura .</li>
	<li>Seleccione la opción Filtros de resultados . Marque Advertir si la puntuación es y establecer la coincidencia de puntuación en 80.00%. Marcar No coincidir si la puntuación es y establecer la puntuación en 75.00%. NOTA: Las puntuaciones de coincidencia/no coincidencia se pueden cambiar a valores más bajos si es necesario. Esto reducirá la precisión de la identificación.</li>
	<li>Haga clic en Buscar compuestos por fórmula para identificar compuestos de interés en la muestra.</li>
</ol>

<ol><li>Morley, J. E., Anker, S. D., von Haehling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence%2C+incidence%2C+and+clinical+impact+of+sarcopenia%3A+facts%2C+numbers%2C+and+epidemiology-update+2014%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cachexia%2C+Sarcopenia+and+Muscle%22%5BJournal%5D)">Prevalence, incidence, and clinical impact of sarcopenia: facts, numbers, and epidemiology-update 2014.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 5 (4), 253-259 (2014).</li>
<li>Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcopenia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Sarcopenia.</a> The Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).</li>
<li>Beaudart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrition+and+physical+activity+in+the+prevention+and+treatment+of+sarcopenia%3A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporosis+International%22%5BJournal%5D)">Nutrition and physical activity in the prevention and treatment of sarcopenia: systematic review.</a> Osteoporosis International. 28 (6), 1817-1833 (2017).</li>
<li>Ozer, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenolic+compositions+and+antioxidant+activities+of+Maya+nut+%28Brosimum+alicastrum%29%3A+Comparison+with+commercial+nuts%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Properties%22%5BJournal%5D)">Phenolic compositions and antioxidant activities of Maya nut (Brosimum alicastrum): Comparison with commercial nuts.</a> International Journal of Food Properties. 20 (11), 2772-2781 (2017).</li>
<li>Subiria-Cueto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brosimum+alicastrum+Sw.+%28Ram%C3%B3n%29%3A+An+alternative+to+improve+the+nutritional+properties+and+functional+potential+of+the+wheat+flour+tortilla%5BTitle%5D)+AND+%22Foods%22%5BJournal%5D)">Brosimum alicastrum Sw. (Ramón): An alternative to improve the nutritional properties and functional potential of the wheat flour tortilla.</a> Foods. 8 (12), 1-18 (2019).</li>
<li>Martínez-Ruiz, N., Torres, L. E. J., del Hierro-Ochoa, J. C., Larqué-Saavedra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bebida+adicionada+con+Brosimum+alicastrum+sw.%3A+Una+alternativa+para+requerimientos+dietarios+especiales%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Salud+P%C3%BAblica+y+Nutrici%C3%B3n%22%5BJournal%5D)">Bebida adicionada con Brosimum alicastrum sw.: Una alternativa para requerimientos dietarios especiales.</a> Revista Salud Pública y Nutrición. 18 (3), 1-10 (2019).</li>
<li>Rodríguez-Tadeo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionality+of+bread+and+beverage+added+with+brosimum+alicastrum+sw.+Seed+flour+on+the+nutritional+and+health+status+of+the+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22Foods%22%5BJournal%5D)">Functionality of bread and beverage added with brosimum alicastrum sw. Seed flour on the nutritional and health status of the elderly.</a> Foods. 10 (8), 1-21 (2021).</li>
<li>Muñoz-Bernal, ÓA., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuevo+acercamiento+a+la+interacci%C3%B3n+del+reactivo+de+Folin-Ciocalteu+con+az%C3%BAcares+durante+la+cuantificaci%C3%B3n+de+polifenoles+totales%5BTitle%5D)+AND+%22TIP+Revista+Especializada+en+Ciencias+Qu%C3%ADmico-Biol%C3%B3gicas%22%5BJournal%5D)">Nuevo acercamiento a la interacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con azúcares durante la cuantificación de polifenoles totales.</a> TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas. 20 (2), 28-33 (2017).</li>
<li>Luca, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactivity+of+dietary+polyphenols%3A+The+role+of+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Food+Science+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Bioactivity of dietary polyphenols: The role of metabolites.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 60 (4), 626-659 (2020).</li>
<li>Kawabata, K., Yoshioka, Y., Terao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+intestinal+microbiota+in+the+bioavailability+and+physiological+functions+of+dietary+polyphenols%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Role of intestinal microbiota in the bioavailability and physiological functions of dietary polyphenols.</a> Molecules. 24 (2), (2019).</li>
<li>de Llano, D. G., Moreno-Arribas, M. V., Bartolomé, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranberry+polyphenols+and+prevention+against+urinary+tract+Infections%3A+Relevant+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Cranberry polyphenols and prevention against urinary tract Infections: Relevant considerations.</a> Molecules. 25 (15), (2020).</li>
<li>Alsaleh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry%3A+A+guide+for+the+clinician%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+and+Experimental+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry: A guide for the clinician.</a> Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 9 (5), 597-606 (2019).</li>
<li>Wang, X., Sun, H., Zhang, A., Wang, P., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-performance+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry+as+a+sensitive+and+powerful+technology+for+metabolomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">Ultra-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry as a sensitive and powerful technology for metabolomic studies.</a> Journal of Separation Science. 34 (24), 3451-3459 (2011).</li>
<li>Feliciano, R. P., Mills, C. E., Istas, G., Heiss, C., Rodriguez-Mateos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absorption%2C+metabolism+and+excretion+of+cranberry+%28poly%29phenols+in+humans%3A+A+dose+response+study+and+assessment+of+inter-individual+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Absorption, metabolism and excretion of cranberry (poly)phenols in humans: A dose response study and assessment of inter-individual variability.</a> Nutrients. 9 (3), (2017).</li>
<li>Mateos, R., Goya, L., Bravo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+metabolism+of+hydroxycinnamic+acids+%28chlorogenic%2C+caffeic%2C+and+ferulic+acids%29+by+HepG2+cells+as+a+model+of+the+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Uptake and metabolism of hydroxycinnamic acids (chlorogenic, caffeic, and ferulic acids) by HepG2 cells as a model of the human liver.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (23), 8724-8732 (2006).</li>
<li>Rodriguez Lanzi,, Perdicaro, C., Antoniolli, D. J., Piccoli, A., Vazquez Prieto, M. A., Fontana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenolic+metabolites+in+plasma+and+tissues+of+rats+fed+with+a+grape+pomace+extract+as+assessed+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Phenolic metabolites in plasma and tissues of rats fed with a grape pomace extract as assessed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. , 28-33 (2018).</li>
<li>Hou, Y., He, D., Ye, L., Wang, G., Zheng, Q., Hao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+detection+and+identification+strategy+for+untargeted+metabolomics+based+on+UPLC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">An improved detection and identification strategy for untargeted metabolomics based on UPLC-MS.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113531(2020).</li>
<li>Nagy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+identification+of+dimethoxycinnamic+acids+in+human+plasma+after+coffee+intake+by+liquid+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">First identification of dimethoxycinnamic acids in human plasma after coffee intake by liquid chromatography-mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (3), 491-497 (2011).</li>
<li>Marmet, C., Actis-Goretta, L., Renouf, M., Giuffrida, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+phenolic+acids+and+their+methylates%2C+glucuronides%2C+sulfates+and+lactones+metabolites+in+human+plasma+by+LC-MS%2FMS+after+oral+ingestion+of+soluble+coffee%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Quantification of phenolic acids and their methylates, glucuronides, sulfates and lactones metabolites in human plasma by LC-MS/MS after oral ingestion of soluble coffee.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 617-625 (2014).</li>
<li>McCord, J., Strynar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+per-and+polyfluorinated+chemical+species+with+a+combined+targeted+and+non-targeted-screening+high-resolution+mass+spectrometry+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Identifying per-and polyfluorinated chemical species with a combined targeted and non-targeted-screening high-resolution mass spectrometry workflow.</a> Journal of Visualized Experiments. 2019 (146), 1-15 (2019).</li>
<li>Muñoz-Bernal, ÓA., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytochemical+characterization+and+antiplatelet+activity+of+Mexican+red+wines+and+their+by-products%5BTitle%5D)+AND+%22South+African+Journal+of+Enology+and+Viticulture%22%5BJournal%5D)">Phytochemical characterization and antiplatelet activity of Mexican red wines and their by-products.</a> South African Journal of Enology and Viticulture. 42 (1), 77-90 (2021).</li>
<li>Muñoz-Bernal, ÓA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enriquecimiento+de+un+vino+tinto+con+un+extracto+de+compuestos+fen%C3%B3licos+provenientes+de+orujo+de+uva%3A+bioaccesibilidad%2C+an%C3%A1lisis+sensorial+y+respuesta+biol%C3%B3gica%5BTitle%5D)+AND+%22Universidad+Aut%C3%B3noma+de+Ciudad+Ju%C3%A1rez%22%5BJournal%5D)">Enriquecimiento de un vino tinto con un extracto de compuestos fenólicos provenientes de orujo de uva: bioaccesibilidad, análisis sensorial y respuesta biológica.</a> Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. , (2021).</li>
<li>Low, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data+sharing+in+PredRet+for+accurate+prediction+of+retention+time%3A+Application+to+plant+food+bioactive+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Data sharing in PredRet for accurate prediction of retention time: Application to plant food bioactive compounds.</a> Food Chemistry. , 357(2021).</li>
<li>Sánchez-Patán, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbial+catabolism+of+grape+seed+flavan-3-ols+by+human+faecal+microbiota.+Targeted+analysis+of+precursor+compounds%2C+intermediate+metabolites+and+end-products%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Gut microbial catabolism of grape seed flavan-3-ols by human faecal microbiota. Targeted analysis of precursor compounds, intermediate metabolites and end-products.</a> Food Chemistry. 131 (1), 337-347 (2012).</li>
<li>Zhang, X., Sandhu, A., Edirisinghe, I., Burton-Freeman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+and+urinary+%28poly%29phenolic+profiles+after+4-week+red+raspberry+%28Rubus+idaeus+L.%29+intake+with+or+without+fructo-oligosaccharide+supplementation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Plasma and urinary (poly)phenolic profiles after 4-week red raspberry (Rubus idaeus L.) intake with or without fructo-oligosaccharide supplementation.</a> Molecules. 25 (20), (2020).</li>
</ol>

Todos los autores declaran no tener conflicto de intereses.

La identificación y cuantificación de los fitoquímicos bioactivos que se absorben después del consumo de un alimento o complemento alimenticio son cruciales para demostrar y comprender los beneficios para la salud de estos compuestos y los alimentos que los contienen. En el presente trabajo se desarrolló el método UPLC-MS/MS, dirigido únicamente a la identificación de los principales compuestos fenólicos y sus metabolitos que aumentaron en concentración en plasma tras una intervención nutricional de 30 días con dos produ...

La sarcopenia es un trastorno esquelético progresivo relacionado con una pérdida acelerada de músculo en la población de edad avanzada. Esta condición aumenta el riesgo de caídas y conduce a actividades limitadas de la vida diaria. La sarcopenia está presente en aproximadamente el 5%-10% de las personas mayores de 65 años y alrededor del 50% de las personas de 80 años o más1. No se han aprobado fármacos específicos para el tratamiento de la sarcopenia, por lo que la prevención con actividad física y una dieta equilibrada es importante1,2. Las intervenciones nutricionales con alimentos especialmente formulados enriquecidos con proteína láctea y aminoácidos esenciales han mostrado resultados positivos en la prevención de la sarcopenia2. En otros estudios, los autores han incluido vitaminas y antioxidantes, como la vitamina E y las isoflavonas, en la dieta, aumentando los beneficios para la ganancia muscular en la cintura y las caderas3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) es un árbol que crece en las regiones tropicales mexicanas; ha sido consumido por los cultivos mayas debido a su alto valor nutricional4. Es una buena fuente de proteínas, fibra, minerales y antioxidantes fenólicos, como el ácido clorogénico5. Dado que puede ser molido en polvo y utilizado en productos de panadería o consumido en bebidas, estudios recientes han evaluado la incorporación de harina de semilla de Ramón (RSF) en diferentes alimentos para mejorar su valor nutricional. Se formuló una bebida con sabor a capuchino suplementada con RSF, que era alta en fibra dietética y tenía más de 6 g de proteína por porción, y fue altamente aceptada por los consumidores; por lo tanto, se consideró una alternativa potencial para satisfacer necesidades dietéticas especiales6. En un estudio de seguimiento, RSF también se utilizó para formular un muffin y una nueva bebida rica en proteínas, fibra dietética, micronutrientes y antioxidantes fenólicos. El muffin y la bebida se utilizaron en una intervención dietética para personas mayores, que consumieron ambos productos dos veces al día durante 30 días. Después de este período, el estado nutricional y sarcopénico de los participantes mejoró, y el contenido fenólico total de plasma aumentó7. Sin embargo, la determinación de los compuestos fenólicos totales en plasma se llevó a cabo por un método espectrofotométrico, por lo que no fue posible la identificación de los compuestos fenólicos reales que se absorbieron; además, este método no es completamente específico para los compuestos fenólicos, por lo que puede producirse cierta sobreestimación8.
La identificación y cuantificación de los compuestos fenólicos que se absorben después del consumo de alimentos ricos en estos antioxidantes es una tarea difícil pero es necesaria para demostrar la actividad biológica de estos fitoquímicos. La biodisponibilidad de la mayoría de los compuestos fenólicos es baja; menos del 5% de ellos se pueden encontrar sin transformación estructural en plasma. Los compuestos fenólicos sufren varias biotransformaciones, como la metilación, la sulfonación o la glucuronidación, que son llevadas a cabo por enterocitos y hepatocitos9. Los compuestos fenólicos también son biotransformados por la microbiota en catabolitos bacterianos que pueden ejercer sus efectos beneficiosos en el cuerpo después de ser absorbidos por el plasma10. Por ejemplo, el ácido fenilacético es un producto de la transformación bacteriana de flavonoides y proantocianidinas oligoméricas, que pueden inhibir hasta el 40% de la adhesión de bacterias (Escherichia coli) en el tracto urinario después del consumo de arándano11.
La diversidad estructural de los compuestos fenólicos naturales, sumada a la diversidad de sus metabolitos y su baja biodisponibilidad, hace que su identificación en plasma sea aún más difícil. El perfil metabolómico, utilizando plataformas de análisis espectroscópico como la resonancia magnética nuclear (RMN) y la espectroscopia de masas en tándem (MS / MS), es probablemente el mejor enfoque para lograr este objetivo; desafortunadamente, el equipo no es de fácil acceso, y el desarrollo de protocolos de análisis aún es limitado12. Varios estudios han reportado EM / EM junto con un sistema de separación (como la cromatografía líquida) como una estrategia para reducir la complejidad de los espectros de masas en estudios metabolómicos. La reciente introducción de métodos de separación por cromatografía líquida (UPLC) de ultra alto rendimiento ha reducido el tiempo de análisis y ha aumentado la resolución y la sensibilidad en comparación con los protocolos líquidos convencionales de alto rendimiento, por lo que los sistemas UPLC-MS/MS han sido rápidamente ampliamente aceptados por la comunidad de metabolómica analítica13. De esta manera, algunos estudios han investigado metabolitos fenólicos y detectado derivados glucuronidados del ácido cafeico, quercetina y ácido ferúlico, así como derivados sulfonados del ácido siríngrico y vanílico en el plasma de individuos después de la ingesta de arándano14. Los protocolos anteriores han destinado a encontrar compuestos fenólicos y metabolitos fenólicos en biofluidos como el plasma. Estos protocolos se basaron en la identificación y cuantificación mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) acoplada a un detector UV-vis15. Sin embargo, tales protocolos requieren el uso de estándares auténticos para evaluar la identificación absoluta y la cuantificación precisa. Una amplia gama de estudios han identificado los metabolitos más comunes en los biofluidos (formas sulfonadas, glucuronidas y metiladas) por UPLC-MS y UPLC-MS/MS; sin embargo, gran parte de los metabolitos bacterianos no ha sido reportado debido a la falta de bases de datos que contengan su información completa16. La identificación de metabolitos se complica por el costo y la disponibilidad comercial de los estándares de metabolitos. Por lo tanto, la mejor estrategia puede ser el análisis de metabolitos MS/MS no dirigido o semidirigido, que se basa en el uso de información de características moleculares (m/z, masa exacta monoisotópica, distribución isotópica y patrón de fragmentación) para determinar la identidad química y compararla con bases de datos en línea disponibles gratuitamente que contienen metabolitos de polifenoles identificados en biofluidos después del consumo de ricos en polipolifenoles12 . Las bases de datos más importantes utilizadas en los estudios UPLC-MS/MS para la identificación de compuestos fenólicos y sus metabolitos son la Human Metabolome Database (HMDB), LipidBlast Library, METLIN Library y otras bases de datos complementarias, como PubChem, ChemSpider y Phenol Explorer17.
En el presente estudio, se desarrolló un método semi-dirigido UPLC-MS/MS para analizar las muestras plasmáticas del grupo de ancianos involucrados en el estudio de consumo de magdalenas y bebidas que contenía RSF7. Los datos de diferentes bases de datos gratuitas en línea de metabolitos plasmáticos se recopilaron e integraron en una base de datos especializada. El software del equipo puede acceder automáticamente a esta base de datos para identificar los metabolitos polifenólicos en las cinco muestras de plasma antes y después de la intervención nutricional de 30 días. Esto se hace para identificar los principales compuestos fenólicos, o sus metabolitos, que se absorben de los alimentos funcionales especialmente formulados diseñados para la prevención de la sarcopenia.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Tedia</td><td>Al1129-001</td><td>LC Espectrometría de masas</td></tr><tr><td>Automuestreador</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4226A</td><td>1290 Serie Infinity</td></tr><tr><td>C18 columna de fase inversa</td><td>Agilent Technologies</td><td>959757-902</td><td>Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 &mu; m; Centrífuga HD de resolución rápida</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5452000018</td><td>Mini Spin; Rotor F-45-12-11</td></tr><tr><td>Compartimento de columna con termostato</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1316C</td><td>1290</td></tr><tr><td>Detector de matriz de diodos de la serie Infinity (UV-Vis)</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4212B</td><td>1260 Infinity series</td></tr><tr><td>Fuente de ionización por electrospray</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3251B</td><td>Pulverizador doble Fuente ESI</td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>J.T. Baker</td><td>0128-02</td><td>Reactivo Baker, ACS</td></tr><tr><td>Mass Hunter Data Acquisition</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3338AA</td><td></td></tr><tr><td>Mass Hunter Personal Compound Datbase y Gerente de Biblioteca</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3338AA</td><td></td></tr><tr><td>Análisis cualitativo de Mass Hunter</td><td>Agilent Technologies G3338AA</td><td></td> Tubo de microcentrífuga Marca BR780546 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Tubo de microcentrífuga, 2 mL con tapa</td></tr><tr><td>Pure etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-1L</td><td>200 proof, para biología molecular</td></tr><tr><td>Q-TOF LC/MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>G6530B</td><td>6530</td></tr><tr><td>Bomba cuaternaria</td> de masa precisa <td>Agilent Technologies</td><td>G4204A</td><td>1290 Infinity series</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa</td><td>Thermo Scientific</td><td>44514-NN</td><td>17 mm, 0,45 &mu; m, membrana de nailon</td></tr><tr><td>Termostato</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1330B</td><td>1290 Infinity series</td></tr><tr><td>Vial</td><td>Agilent Technologies</td><td>8010-0199</td><td>Ámbar, silicona roja PFTE 2 mL con tapa de rosca y tapones azules</td></tr><tr><td>Inserto de vial</td><td>Agilent Technologies</td><td>5183-2089</td><td>Inserto de vial 200 &mu; L para apertura estándar de 2 ml, cónica</td></tr><tr><td>Water</td><td>Tedia</td><td>WL2212-001</td><td>LC Espectrometría de masas</td></tr></tbody></table>

cromatografía semidirigida de ultra alto rendimiento acoplada al análisis de espectrometría de masas de metabolitos fenólicos en plasma de adultos mayores

Semi-Targeted Ultra-High-Performance Chromatography Coupled to Mass Spectrometry Analysis of Phenolic Metabolites in Plasma of Elderly Adults

Un grupo de 23 ancianos recibió comidas funcionales (una bebida y un muffin) especialmente formuladas para la prevención de la sarcopenia (pérdida de masa muscular relacionada con la edad). Se tomaron muestras de plasma al inicio de la intervención y después de 30 días de consumir las comidas funcionales. Se llevó a cabo una cromatografía semi-dirigida de ultra alto rendimiento junto con un análisis de masa en tándem (UPLC-MS/MS) para identificar compuestos fenólicos y sus metabolitos. Las proteínas plasmáticas se precipitaron con etanol y las muestras se concentraron y resuspendieron en la fase móvil (acetonitrilo 1:1: agua) antes de la inyección en el instrumento UPLC-MS/MS. La separación se llevó a cabo con una columna de fase inversa C18 , y los compuestos se identificaron utilizando su masa experimental, distribución isotópica y patrón de fragmentos. Los compuestos de interés se compararon con los de los bancos de datos y la biblioteca interna semi-dirigida. Los resultados preliminares mostraron que los principales metabolitos identificados después de la intervención fueron ácido fenilacético, glicitina, ácido 3-hidroxifenilvalérico y gomisina M2.

El proceso paso a paso para la identificación de metabolitos fenólicos a través del análisis semi-dirigido UPLC-MS/MS, en modo negativo, de muestras de plasma se representa en la Figura 2. En primer lugar, el cromatograma iónico total (TIC) del extracto fenólico plasmático (obtenido después de la precipitación proteica de la muestra plasmática total) se obtuvo a través del software cualitativo del instrumento. Luego, se utilizó el cromatograma iónico extraído, y se comp...

El objetivo de este protocolo es detectar metabolitos fenólicos en plasma utilizando un método de cromatografía semi-dirigida-espectrometría de masas.

Cromatografía semidirigida de ultra alto rendimiento acoplada al análisis de espectrometría de masas de metabolitos fenólicos en plasma de adultos mayores

A group of 23 elderly persons was given functional meals (a beverage and a muffin) specially formulated for the prevention of sarcopenia (age-related loss ...

El objetivo de este protocolo es detectar metabolitos fenólicos en plasma mediante un método semi-dirigido UPLC-MS/MS. Las proteínas plasmáticas se precipitaron con etanol y se concentraron muestras, y se volvieron a suspender en la fase móvil, antes de la inyección en el equipo UPLC. Los compuestos se identificaron utilizando una biblioteca semi dirigida ensamblada en el laboratorio, utilizando el administrador PCDL para metabolómica, software y diferentes bases de datos en línea gratuitas.Implementamos una intervención nutricional con un muffin y una bebida formulada con harina de semilla de brosimum alicastrum. Al final de la intervención, se mejoró el estado nutricional y sarcopénico de los participantes, y se aumentó el contenido fenólico total de plasma. Pero necesitamos identificar qué compuestos fenólicos habían sido absorbidos y aportado el efecto positivo.La identificación y cuantificación de los compuestos fenólicos que se absorben después del consumo de alimentos ricos en estos antioxidantes es una tarea difícil pero necesaria, si se quiere demostrar la actividad biológica de estos fitoquímicos. La biodisponibilidad de la mayoría de los componentes fenólicos es baja, ad

semi-targeted-ultra-high-performance-chromatography-coupled-to-mass

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

El perfil de metabolitos no dirigido mediante cromatografía líquida de ultra rendimiento junto con espectrometría de masas (UPLC-MS) es una técnica poderosa para investigar el metabolismo.  Este artículo describe un flujo de trabajo típico utilizado para la elaboración de perfiles de metabolitos no dirigidos en suero, incluida la organización y preparación de muestras, la adquisición de datos, el análisis de datos, el control de calidad y la identificación de metabolitos.

A gran escala que no son objeto de perfiles metabolómicos de Serum Ultra Performance Liquid Chromatography-espectrometría de masas (UPLC-MS)

Untargeted metabolómica ofrece una hipótesis de generación instantánea de un perfil metabólico. Este protocolo se demostrará la extracción y el análisis de los metabolitos de las células, suero, o tejidos. Una gama de metabolitos se examinó utilizando extracción en fase líquido-líquido, microflujo UltraPerformance cromatografía líquida / de alta resolución de la espectrometría de masas (UPLC-HRMS) acoplado al software de análisis diferencial.

Metabolómica no focalizados de fuentes biológicas Uso UltraPerformance cromatografía líquida-espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS)

Metabolito de perfiles ha sido un valioso activo en el estudio del metabolismo en la salud y la enfermedad. La utilización de la cromatografía en fase normal líquida acoplada a espectrometría de masas de alta resolución con el cambio de polaridad y un ciclo de trabajo rápido, se describe un protocolo para analizar la composición metabólica polar de material biológico con una alta sensibilidad, precisión y resolución.

Una estrategia para sensibles, grande escala cuantitativa Metabolómica

La fiabilidad de los resultados en experimentos metabolómica depende de la eficacia y reproducibilidad de la preparación de la muestra. Se describe un método riguroso y en profundidad que permite la extracción de metabolitos a partir de fluidos biológicos con la opción de analizar posteriormente hasta miles de compuestos, o sólo las clases de compuestos de interés.

Multivelocidad Técnica Preparación recuperar múltiples clases de compuestos de metabolitos para en profundidad y análisis de Metabolómica Informativo

Aquí describimos un método de alto rendimiento para farmacovigilancia integral que permite mejorar la resolución y detección de paneles grandes de drogas de abuso y sus metabolitos, con control de calidad basado en siguientes inyección capilar electroforesis-espectrometría de masas.

Alto rendimiento y amplio farmacovigilancia mediante espectrometría de masas siguientes electroforesis capilar de inyección

Se presenta un método para el análisis no focalizado de metabolitos y lípidos de grano de trigo. El protocolo incluye un método de extracción de metabolito de acetonitrilo y una metodología de espectrometría de masas de cromatografía líquida de fase inversa, con adquisición en modos de ionización de electrospray positivo según lo negativo y negativo.

Análisis de metabolómica basada en cromatografía líquida no dirigida de grano de trigo

Los ácidos fenólicos son fitoquímicos importantes que están presentes en los granos enteros. Poseen propiedades bioactivas como funciones protectoras antioxidantes. Este trabajo tuvo como objetivo informar sobre un método generalizado para la identificación de HPLC, la estimación del contenido fenólico total y la determinación de la capacidad antioxidante de los ácidos fenólicos en cereales y legumbres.

Un método generalizado para determinar la composición del ácido fenólico soluble libre y la capacidad antioxidante de los cereales y las legumbres

Este protocolo describe el flujo de trabajo para el etiquetado metabólico de células senescentes y no en división con SILAC pulsado, análisis de espectrometría de masas no dirigido y un cálculo simplificado de las vidas medias de las proteínas.

Medición de las tasas de recambio de proteínas en células cultivadas senescentes y no divisorias con etiquetado metabólico y espectrometría de masas

Describimos un protocolo general que integra el análisis de espectrometría de masas de alta resolución y el acoplamiento molecular en la investigación de la medicina tradicional china.

Espectrometría de masas en tándem de alta resolución para el estudio de los constituyentes químicos de Gynura bicolor DC

flexibilidad conformacional desempeña un papel crítico en la función de la proteína. En este documento, se describe el uso de la espectrometría de masas de ionización por electrospray resuelta en el tiempo junto con el intercambio de hidrógeno-deuterio para sondear los rápidos cambios estructurales que impulsan función en proteínas ordenadas y desordenadas.

Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

Aprende a detectar metabolitos fenólicos en plasma mediante cromatografía UPLC-MS/MS semidirigida. Este método permite evaluar intervenciones nutricionales en adultos mayores y mejorar su estado metabólico.

Cromatografía semidirigida de ultra alto rendimiento acoplada al análisis de espectrometría de masas de metabolitos fenólicos en plasma de adultos mayores (Video) | JoVE Journal

Cromatografía semidirigida de ultra alto rendimiento acoplada al análisis de espectrometría de masas de metabolitos fenólicos en plasma de adultos mayores

Explorar más videos