Name: Cromatografía semidirigida de ultra alto rendimiento acoplada al análisis de espectrometría de masas de metabolitos fenólicos en plasma de adultos mayores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Aprende a detectar metabolitos fenólicos en plasma mediante cromatografía UPLC-MS/MS semidirigida. Este método permite evaluar intervenciones nutricionales en adultos mayores y mejorar su estado metabólico.

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Los autores agradecen el apoyo financiero del CONACYT, México (CB- 2016-01-286449) y UACJ-PIVA (Proyectos 313-17-16 y 335-18-13). OAMB desea agradecer al CONACYT por su beca de doctorado. Se agradece el apoyo técnico de la oficina de Producción Multimedia de la UACJ.

Las muestras de plasma utilizadas en este protocolo fueron recolectadas en un estudio previo siguiendo todos los lineamientos éticos y aprobado por el Comité Institucional de Ética y Bioética (CIEB-2018-1-37) de la Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. El protocolo completo para la extracción e identificación de los compuestos fenólicos y metabolitos en plasma por UPLC-MS/MS está representado en la Figura 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63164/63164fig01.jpg"> Figura 1: Representación esquemática de la extracción e identificación de compuestos fenólicos y metabolitos en plasma mediante el método semi-dirigido UPLC-MS/MS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63164/63164fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
1. Preparación de la muestra
<ol><li>Conservar las muestras de plasma a -80 °C hasta su análisis.</li>
	<li>Descongelar las muestras de plasma a temperatura ambiente durante 15 min. NOTA: Las muestras se pueden colocar en un baño de agua a 37 °C para acelerar el proceso (5 min).</li>
	<li>Coloque 200 μL de muestra de plasma en un microtubo de 2 ml y mezcle con 1.000 μL de etanol puro. Vórtice la muestra de plasma durante 30 s. NOTA: Siempre use guantes cuando trabaje con muestras de plasma.</li>
	<li>Centrifugar la muestra a 6.580 x g durante 5 min. Después de la centrifugación, recoja el sobrenadante con una micropipeta o pipeta Pasteur y colóquelo en un nuevo microtubo. Conservar el sobrenadante a 4 °C.</li>
	<li>Mezclar el pellet del paso anterior con 1.000 μL de etanol al 100%, vórtice durante 30 s, y luego centrifugar a 6.580 x g durante 5 min. NOTA: El pellet está fuertemente envasado y debe resuspendirse bien para garantizar el contacto entre la muestra y el etanol puro. Se recomienda el uso de una micropipeta para enjuagar el pellet con etanol.</li>
	<li>Después de la centrifugación, recoger el sobrenadante y mezclar con el sobrenadante previamente obtenido del Paso 1.4. en un microtubo de 2 ml.</li>
	<li>Elimine el etanol de la muestra mediante el uso de nitrógeno puro (99.997%) a 135 psi. Mantenga la aguja a 1 cm de distancia de la parte superior del microtubo para evitar la pérdida de muestra y enjuague hasta que la muestra esté seca. No se necesita calor para evaporar el etanol. NOTA: El flujo de nitrógeno debe ser bajo para evitar la pérdida de muestra. Una vez que el etanol se haya secado, mantenga el flujo de nitrógeno durante al menos 5 minutos para garantizar la sequedad de la muestra. El protocolo se puede pausar en este punto; las muestras deberán almacenarse a -20 °C. Evite almacenar las muestras durante más de 12 h.</li>
	<li>Resuspend las muestras secas en 100 μL de una mezcla de acetonitrilo: agua en una proporción de 50:50 (v:v).</li>
	<li>Filtre la muestra a través de una membrana de jeringa de nylon de 0,45 μm directamente en un microinserto de vial de HPLC. NOTA: Las muestras en el vial se pueden almacenar a -20 °C antes del análisis. Almacene las muestras durante no más de 8 h. Se recomienda inyectar las muestras en el sistema UPLC justo después de la filtración.</li>
</ol>2. Análisis UPLC-MS/MS
<ol><li>Inyectar 3 μL de muestra en un UPLC equipado con una columna de fase inversa C18 (50 mm x 2,1 mm; 1,8 μm). Ajuste la temperatura del muestreador automático a 20 °C y el termostato de columna a 25 °C. Inyecte cada muestra por triplicado.</li>
	<li>Use ácido fórmico al 0.1% (v:v) en agua como solvente A, y 100% acetonitrilo como solvente B. Establezca el caudal en 0.4 mL/min y un programa de gradiente de la siguiente manera: 0-1 min 10% B, 1-4 min 30% B, 4-6 min 38% B, 6-8 min 60% B, 8-8.5 min 60% B, 8.5-9 min 10% B (Tabla 1).</li>
	<li>Ajuste el espectrómetro de masas a ionización en modo negativo. Utilice nitrógeno como gas de secado a 340 °C y un caudal de 13 L/min. Ajuste la presión del nebulizador a 60 psi. Ajuste el voltaje capilar a 4.000 V, el voltaje del fragmentor a 175 V y el voltaje skimmer a 65 V. Utilice la energía de colisión a 20 V (Tabla 2).</li>
	<li>Escanee las masas entre 100-1100 la relación masa-carga (m/z) y, para MS/MS, escanee masas entre 50-1000 m/z (Tabla 2). Establezca la adquisición de datos en modo MS/MS automático. Utilice la siguiente masa de referencia: 119.036 y 966.0007.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tiempo (min)</td>
			<td>Disolvente A (0,1 % de ácido fórmico en agua HPLC)</td>
			<td>Disolvente B (100 % acetonitrilo)</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 a 1</td>
			<td>90</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 a 4</td>
			<td>70</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>De 4 a 6</td>
			<td>62</td>
			<td>38</td>
		</tr>
<tr>
<td>De 6 a 8</td>
			<td>40</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>De 8 a 8,5</td>
			<td>40</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>8,5 a 9</td>
			<td>90</td>
			<td>10</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Gradiente de fase móvil utilizado para la separación de compuestos fenólicos por UPLC.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Modo de ionización</td>
			<td>Negativo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gas de secado</td>
			<td>Nitrógeno a 340 °C, caudal 13 L/min</td>
		</tr>
<tr>
<td>Presión del nebulizador</td>
			<td>60 psi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tensión capilar</td>
			<td>175 V</td>
		</tr>
<tr>
<td>Masas de escaneo MS</td>
			<td>100-1100 m/z</td>
		</tr>
<tr>
<td>Masas de escaneo MS/MS</td>
			<td>50-1000 m/z</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: Parámetros de ionización para el análisis MS/MS.
3. Construcción de bases de datos
<ol><li>Búsqueda de compuestos fenólicos, metabolitos fenólicos u otros compuestos de interés en la literatura científica.</li>
	<li>Abra el software de gestión de bases de datos incluido en el sistema UPLC. Seleccione archivo | Nueva biblioteca compuesta de base de datos personales (PCDL) | Crear nuevo PCDL. Seleccione el tipo de PCDL: LC/MS Metabolomics. Establezca un nombre para el PCDL. A continuación, seleccione Crear.</li>
	<li>En la barra de herramientas, seleccione PCDL y, a continuación, la opción Permitir edición . A continuación, haga clic en el botón Buscar compuestos . NOTA: Dado que se trata de un nuevo PCDL, los resultados de la tabla estarán vacíos. Esto cambiará una vez que se agreguen nuevos compuestos al PCDL.<ol>
<li>Agregue compuestos a la biblioteca de compuestos de la base de datos personal especializada copiándolos de la biblioteca general del instrumento. Abra la base de datos existente del instrumento incluida en el software de administración de bases de datos. Haga clic en el botón Buscar compuestos. En la opción Búsqueda única , introduzca los criterios de búsqueda de compuestos para encontrar el compuesto de interés. NOTA: Los compuestos se pueden encontrar por nombre, fórmula molecular, masa exacta y tiempo de retención.</li>
		<li>En la tabla de resultados compuestos, seleccione el compuesto de interés. Para seleccionar más de un compuesto, haga clic en el primer compuesto, mantenga presionada la tecla CTRL y, a continuación, haga clic en cada compuesto de interés. Luego, haga clic derecho en todos los compuestos resaltados y seleccione Anexar a PCDL.</li>
		<li>En la nueva ventana, busque y seleccione el archivo de base de datos personal especializado. Marque las casillas Incluya espectros para compuestos si están presentes e Incluya información de movilidad iónica para compuestos si está presente. Haga clic en el botón Anexar . En el nuevo cuadro de diálogo, seleccione Sí para comprobar los nuevos compuestos agregados. Seleccione No para seguir buscando más compuestos de interés.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Si los compuestos de interés no están disponibles en la biblioteca general del instrumento, agregue nuevos compuestos manualmente.<ol>
<li>Abra la base de datos personal especializada. Una vez abierto, siga el paso 3.3. Seleccione la opción Editar compuestos . Haga clic en el botón Agregar nuevo .</li>
		<li>En la sección superior de la ventana, complete la información del nuevo compuesto. Rellene la fórmula, el nombre, el nombre de la IUPAC, el número CAS, el ID de Chemspider y otros identificadores.</li>
		<li>Utilice la información disponible en las bibliotecas en línea gratuitas (Chemspider, PubChem y Phenol Explorer) para completar la información del nuevo compuesto de interés. Una vez terminado, haga clic en el botón Guardar como nuevo para guardar la nueva información compuesta en la base de datos personal especializada. NOTA: Al agregar información de bibliotecas gratuitas, asegúrese de incluir la información del compuesto sin la presencia de iones cloruro o yoduro. Esto puede modificar la masa exacta y la fórmula molecular del compuesto de interés.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repite el proceso con todos los compuestos de interés para completar la base de datos personal especializada.</li>
</ol>4. Análisis de datos
<ol><li>Utilice el software de gestión cualitativa del instrumento para identificar los compuestos fenólicos y los metabolitos fenólicos presentes en las muestras.</li>
	<li>Abra el archivo de ejemplo. En el panel Cromatograma, seleccione Definir cromatogramas y extraiga el cromatograma iónico total (TIC), el cromatograma iónico extraído de MS (EIC) y el EIC de MS/MS. Seleccione la opción integrar cromatograma.</li>
	<li>En el panel Buscar compuestos , seleccione Buscar por opciones de fórmula. En la nueva ventana, seleccione Origen de fórmula y, a continuación, la opción Base de datos/Biblioteca . Encuentre la base de datos personal creada anteriormente y haga clic en Abrir.</li>
	<li>Seleccione la opción Coincidencia de fórmulas y establezca una tolerancia de coincidencia de masa de 5 partes por millón (ppm). NOTA: Se puede establecer una tolerancia de coincidencia diferente de masas en 10 ppm; esta diferencia depende del espectrómetro de masas utilizado.</li>
	<li>Seleccione la opción Iones negativos y seleccione sólo el cuadro de diálogo -H . En la opción Resultados , marque los cuadros de diálogo Extraer EIC, Extraer espectro limpio, Extraer espectro sin procesar e Incluir estructura .</li>
	<li>Seleccione la opción Filtros de resultados . Marque Advertir si la puntuación es y establecer la coincidencia de puntuación en 80.00%. Marcar No coincidir si la puntuación es y establecer la puntuación en 75.00%. NOTA: Las puntuaciones de coincidencia/no coincidencia se pueden cambiar a valores más bajos si es necesario. Esto reducirá la precisión de la identificación.</li>
	<li>Haga clic en Buscar compuestos por fórmula para identificar compuestos de interés en la muestra.</li>
</ol>

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<li>Martínez-Ruiz, N., Torres, L. E. J., del Hierro-Ochoa, J. C., Larqué-Saavedra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bebida+adicionada+con+Brosimum+alicastrum+sw.%3A+Una+alternativa+para+requerimientos+dietarios+especiales%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Salud+P%C3%BAblica+y+Nutrici%C3%B3n%22%5BJournal%5D)">Bebida adicionada con Brosimum alicastrum sw.: Una alternativa para requerimientos dietarios especiales.</a> Revista Salud Pública y Nutrición. 18 (3), 1-10 (2019).</li>
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</ol>

Todos los autores declaran no tener conflicto de intereses.

La identificación y cuantificación de los fitoquímicos bioactivos que se absorben después del consumo de un alimento o complemento alimenticio son cruciales para demostrar y comprender los beneficios para la salud de estos compuestos y los alimentos que los contienen. En el presente trabajo se desarrolló el método UPLC-MS/MS, dirigido únicamente a la identificación de los principales compuestos fenólicos y sus metabolitos que aumentaron en concentración en plasma tras una intervención nutricional de 30 días con dos produ...

La sarcopenia es un trastorno esquelético progresivo relacionado con una pérdida acelerada de músculo en la población de edad avanzada. Esta condición aumenta el riesgo de caídas y conduce a actividades limitadas de la vida diaria. La sarcopenia está presente en aproximadamente el 5%-10% de las personas mayores de 65 años y alrededor del 50% de las personas de 80 años o más1. No se han aprobado fármacos específicos para el tratamiento de la sarcopenia, por lo que la prevención con actividad física y una dieta equilibrada es importante1,2. Las intervenciones nutricionales con alimentos especialmente formulados enriquecidos con proteína láctea y aminoácidos esenciales han mostrado resultados positivos en la prevención de la sarcopenia2. En otros estudios, los autores han incluido vitaminas y antioxidantes, como la vitamina E y las isoflavonas, en la dieta, aumentando los beneficios para la ganancia muscular en la cintura y las caderas3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) es un árbol que crece en las regiones tropicales mexicanas; ha sido consumido por los cultivos mayas debido a su alto valor nutricional4. Es una buena fuente de proteínas, fibra, minerales y antioxidantes fenólicos, como el ácido clorogénico5. Dado que puede ser molido en polvo y utilizado en productos de panadería o consumido en bebidas, estudios recientes han evaluado la incorporación de harina de semilla de Ramón (RSF) en diferentes alimentos para mejorar su valor nutricional. Se formuló una bebida con sabor a capuchino suplementada con RSF, que era alta en fibra dietética y tenía más de 6 g de proteína por porción, y fue altamente aceptada por los consumidores; por lo tanto, se consideró una alternativa potencial para satisfacer necesidades dietéticas especiales6. En un estudio de seguimiento, RSF también se utilizó para formular un muffin y una nueva bebida rica en proteínas, fibra dietética, micronutrientes y antioxidantes fenólicos. El muffin y la bebida se utilizaron en una intervención dietética para personas mayores, que consumieron ambos productos dos veces al día durante 30 días. Después de este período, el estado nutricional y sarcopénico de los participantes mejoró, y el contenido fenólico total de plasma aumentó7. Sin embargo, la determinación de los compuestos fenólicos totales en plasma se llevó a cabo por un método espectrofotométrico, por lo que no fue posible la identificación de los compuestos fenólicos reales que se absorbieron; además, este método no es completamente específico para los compuestos fenólicos, por lo que puede producirse cierta sobreestimación8.
La identificación y cuantificación de los compuestos fenólicos que se absorben después del consumo de alimentos ricos en estos antioxidantes es una tarea difícil pero es necesaria para demostrar la actividad biológica de estos fitoquímicos. La biodisponibilidad de la mayoría de los compuestos fenólicos es baja; menos del 5% de ellos se pueden encontrar sin transformación estructural en plasma. Los compuestos fenólicos sufren varias biotransformaciones, como la metilación, la sulfonación o la glucuronidación, que son llevadas a cabo por enterocitos y hepatocitos9. Los compuestos fenólicos también son biotransformados por la microbiota en catabolitos bacterianos que pueden ejercer sus efectos beneficiosos en el cuerpo después de ser absorbidos por el plasma10. Por ejemplo, el ácido fenilacético es un producto de la transformación bacteriana de flavonoides y proantocianidinas oligoméricas, que pueden inhibir hasta el 40% de la adhesión de bacterias (Escherichia coli) en el tracto urinario después del consumo de arándano11.
La diversidad estructural de los compuestos fenólicos naturales, sumada a la diversidad de sus metabolitos y su baja biodisponibilidad, hace que su identificación en plasma sea aún más difícil. El perfil metabolómico, utilizando plataformas de análisis espectroscópico como la resonancia magnética nuclear (RMN) y la espectroscopia de masas en tándem (MS / MS), es probablemente el mejor enfoque para lograr este objetivo; desafortunadamente, el equipo no es de fácil acceso, y el desarrollo de protocolos de análisis aún es limitado12. Varios estudios han reportado EM / EM junto con un sistema de separación (como la cromatografía líquida) como una estrategia para reducir la complejidad de los espectros de masas en estudios metabolómicos. La reciente introducción de métodos de separación por cromatografía líquida (UPLC) de ultra alto rendimiento ha reducido el tiempo de análisis y ha aumentado la resolución y la sensibilidad en comparación con los protocolos líquidos convencionales de alto rendimiento, por lo que los sistemas UPLC-MS/MS han sido rápidamente ampliamente aceptados por la comunidad de metabolómica analítica13. De esta manera, algunos estudios han investigado metabolitos fenólicos y detectado derivados glucuronidados del ácido cafeico, quercetina y ácido ferúlico, así como derivados sulfonados del ácido siríngrico y vanílico en el plasma de individuos después de la ingesta de arándano14. Los protocolos anteriores han destinado a encontrar compuestos fenólicos y metabolitos fenólicos en biofluidos como el plasma. Estos protocolos se basaron en la identificación y cuantificación mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) acoplada a un detector UV-vis15. Sin embargo, tales protocolos requieren el uso de estándares auténticos para evaluar la identificación absoluta y la cuantificación precisa. Una amplia gama de estudios han identificado los metabolitos más comunes en los biofluidos (formas sulfonadas, glucuronidas y metiladas) por UPLC-MS y UPLC-MS/MS; sin embargo, gran parte de los metabolitos bacterianos no ha sido reportado debido a la falta de bases de datos que contengan su información completa16. La identificación de metabolitos se complica por el costo y la disponibilidad comercial de los estándares de metabolitos. Por lo tanto, la mejor estrategia puede ser el análisis de metabolitos MS/MS no dirigido o semidirigido, que se basa en el uso de información de características moleculares (m/z, masa exacta monoisotópica, distribución isotópica y patrón de fragmentación) para determinar la identidad química y compararla con bases de datos en línea disponibles gratuitamente que contienen metabolitos de polifenoles identificados en biofluidos después del consumo de ricos en polipolifenoles12 . Las bases de datos más importantes utilizadas en los estudios UPLC-MS/MS para la identificación de compuestos fenólicos y sus metabolitos son la Human Metabolome Database (HMDB), LipidBlast Library, METLIN Library y otras bases de datos complementarias, como PubChem, ChemSpider y Phenol Explorer17.
En el presente estudio, se desarrolló un método semi-dirigido UPLC-MS/MS para analizar las muestras plasmáticas del grupo de ancianos involucrados en el estudio de consumo de magdalenas y bebidas que contenía RSF7. Los datos de diferentes bases de datos gratuitas en línea de metabolitos plasmáticos se recopilaron e integraron en una base de datos especializada. El software del equipo puede acceder automáticamente a esta base de datos para identificar los metabolitos polifenólicos en las cinco muestras de plasma antes y después de la intervención nutricional de 30 días. Esto se hace para identificar los principales compuestos fenólicos, o sus metabolitos, que se absorben de los alimentos funcionales especialmente formulados diseñados para la prevención de la sarcopenia.

<table><tbody><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Tedia</td><td>Al1129-001</td><td>LC Espectrometría de masas</td></tr><tr><td>Automuestreador</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4226A</td><td>1290 Serie Infinity</td></tr><tr><td>C18 columna de fase inversa</td><td>Agilent Technologies</td><td>959757-902</td><td>Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 &mu; m; Centrífuga HD de resolución rápida</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5452000018</td><td>Mini Spin; Rotor F-45-12-11</td></tr><tr><td>Compartimento de columna con termostato</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1316C</td><td>1290</td></tr><tr><td>Detector de matriz de diodos de la serie Infinity (UV-Vis)</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4212B</td><td>1260 Infinity series</td></tr><tr><td>Fuente de ionización por electrospray</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3251B</td><td>Pulverizador doble Fuente ESI</td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>J.T. Baker</td><td>0128-02</td><td>Reactivo Baker, ACS</td></tr><tr><td>Mass Hunter Data Acquisition</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3338AA</td><td></td></tr><tr><td>Mass Hunter Personal Compound Datbase y Gerente de Biblioteca</td><td>Agilent Technologies</td><td>G3338AA</td><td></td></tr><tr><td>Análisis cualitativo de Mass Hunter</td><td>Agilent Technologies G3338AA</td><td></td> Tubo de microcentrífuga Marca BR780546 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Tubo de microcentrífuga, 2 mL con tapa</td></tr><tr><td>Pure etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-1L</td><td>200 proof, para biología molecular</td></tr><tr><td>Q-TOF LC/MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>G6530B</td><td>6530</td></tr><tr><td>Bomba cuaternaria</td> de masa precisa <td>Agilent Technologies</td><td>G4204A</td><td>1290 Infinity series</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa</td><td>Thermo Scientific</td><td>44514-NN</td><td>17 mm, 0,45 &mu; m, membrana de nailon</td></tr><tr><td>Termostato</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1330B</td><td>1290 Infinity series</td></tr><tr><td>Vial</td><td>Agilent Technologies</td><td>8010-0199</td><td>Ámbar, silicona roja PFTE 2 mL con tapa de rosca y tapones azules</td></tr><tr><td>Inserto de vial</td><td>Agilent Technologies</td><td>5183-2089</td><td>Inserto de vial 200 &mu; L para apertura estándar de 2 ml, cónica</td></tr><tr><td>Water</td><td>Tedia</td><td>WL2212-001</td><td>LC Espectrometría de masas</td></tr></tbody></table>

cromatografía semidirigida de ultra alto rendimiento acoplada al análisis de espectrometría de masas de metabolitos fenólicos en plasma de adultos mayores

Semi-Targeted Ultra-High-Performance Chromatography Coupled to Mass Spectrometry Analysis of Phenolic Metabolites in Plasma of Elderly Adults

Un grupo de 23 ancianos recibió comidas funcionales (una bebida y un muffin) especialmente formuladas para la prevención de la sarcopenia (pérdida de masa muscular relacionada con la edad). Se tomaron muestras de plasma al inicio de la intervención y después de 30 días de consumir las comidas funcionales. Se llevó a cabo una cromatografía semi-dirigida de ultra alto rendimiento junto con un análisis de masa en tándem (UPLC-MS/MS) para identificar compuestos fenólicos y sus metabolitos. Las proteínas plasmáticas se precipitaron con etanol y las muestras se concentraron y resuspendieron en la fase móvil (acetonitrilo 1:1: agua) antes de la inyección en el instrumento UPLC-MS/MS. La separación se llevó a cabo con una columna de fase inversa C18 , y los compuestos se identificaron utilizando su masa experimental, distribución isotópica y patrón de fragmentos. Los compuestos de interés se compararon con los de los bancos de datos y la biblioteca interna semi-dirigida. Los resultados preliminares mostraron que los principales metabolitos identificados después de la intervención fueron ácido fenilacético, glicitina, ácido 3-hidroxifenilvalérico y gomisina M2.

El proceso paso a paso para la identificación de metabolitos fenólicos a través del análisis semi-dirigido UPLC-MS/MS, en modo negativo, de muestras de plasma se representa en la Figura 2. En primer lugar, el cromatograma iónico total (TIC) del extracto fenólico plasmático (obtenido después de la precipitación proteica de la muestra plasmática total) se obtuvo a través del software cualitativo del instrumento. Luego, se utilizó el cromatograma iónico extraído, y se comp...

El objetivo de este protocolo es detectar metabolitos fenólicos en plasma utilizando un método de cromatografía semi-dirigida-espectrometría de masas.

Cromatografía semidirigida de ultra alto rendimiento acoplada al análisis de espectrometría de masas de metabolitos fenólicos en plasma de adultos mayores

A group of 23 elderly persons was given functional meals (a beverage and a muffin) specially formulated for the prevention of sarcopenia (age-related loss ...

El objetivo de este protocolo es detectar metabolitos fenólicos en plasma mediante un método semi-dirigido UPLC-MS/MS. Las proteínas plasmáticas se precipitaron con etanol y se concentraron muestras, y se volvieron a suspender en la fase móvil, antes de la inyección en el equipo UPLC. Los compuestos se identificaron utilizando una biblioteca semi dirigida ensamblada en el laboratorio, utilizando el administrador PCDL para metabolómica, software y diferentes bases de datos en línea gratuitas.Implementamos una intervención nutricional con un muffin y una bebida formulada con harina de semilla de brosimum alicastrum. Al final de la intervención, se mejoró el estado nutricional y sarcopénico de los participantes, y se aumentó el contenido fenólico total de plasma. Pero necesitamos identificar qué compuestos fenólicos habían sido absorbidos y aportado el efecto positivo.La identificación y cuantificación de los compuestos fenólicos que se absorben después del consumo de alimentos ricos en estos antioxidantes es una tarea difícil pero necesaria, si se quiere demostrar la actividad biológica de estos fitoquímicos. La biodisponibilidad de la mayoría de los componentes fenólicos es baja, además menos del 5% de ellos entran sin transformación estructural en plasma. La mayoría pasan por varias biotransformaciones, como la metilación, la sulfonación o la glucuronidación.Una amplia gama de estudios identificó los metabolitos más comunes en biofluidos por UPLC-MS y UPLC-MS/MS. Sin embargo, una gran parte del metabolito de la bacteria no se reporta a la falta de bases de datos que contengan su información completa. La identificación de metabolitos se complica por el costo y la disponibilidad comercial de los estándares de metabolitos.Por lo tanto, la mejor estrategia puede ser el análisis de metabolitos de EM/EM no dirigido o semidirigido. Este análisis se basa en el uso de información de características moleculares, masa a relación de carga monoisotópica masa exacta, distribución isotópica y patrón de fragmentación. Determinar la identidad química y compararla con bases de datos en línea disponibles gratuitamente que contienen metabolitos de polifenoles identificados en biofluidos después del consumo de dietas ricas en polifenoles.En el presente estudio, hemos desarrollado un método SEMI-dirigido UPLC-MS/MS para analizar las muestras plasmáticas de un grupo de personas mayores involucradas en una intervención nutricional. Almacene las muestras de plasma a menos 80 grados centígrados hasta el análisis. Descongele las muestras de plasma a temperatura ambiente durante 15 minutos o a 37 grados centígrados durante cinco minutos.Coloque 200 microlitros de muestra de plasma en un microtubo de dos milímetros y mezcle con 1000 microlitros de etanol puro. Muestra de plasma de vórtice durante 30 segundos. Muestra de centrífuga a 6, 580 fuerza centrífuga durante cinco minutos.Después de la centrifugación, recoja el sobrenadante con una micropipeta o pipeta Pasteur y colóquelo en un nuevo microtubo. Reserva el sobrenadante. Mezcle un pellet con 1000 microlitros de etanol puro, vértice durante 30 segundos y luego centrífuga en las mismas condiciones.Recoge el sobrenadante y mézclalo con el primer sobrenadante. Retire el etanol de la muestra usando nitrógeno puro a 135 psi. Mantenga la aguja a un centímetro de distancia de la parte superior del microtubo para evitar la pérdida de muestra y enjuague hasta que la muestra esté seca.Resuspend muestras secas en 100 microlitros de uno es a una mezcla de acetonitrilo con agua. Filtre a través de una membrana de jeringa de 45 micro nylon directamente en un micro inserto de vial de HPLC Inyecte tres microlitros de muestra en UPLC equipado con una columna de fase inversa C 18. Ajuste la temperatura del muestreador automático a 20 grados centígrados y el termostato de columna a 25 grados centígrados.Inyecte cada muestra por triplicado. Use ácido fórmico 0.1% en agua como solvente A, y 100% acetonitrilo como solvente B.Establezca el caudal en 0.4 milímetros por minuto y un programa de gradiente de la siguiente manera, cero a un minuto 10%B, uno a cuatro minutos 30%B, cuatro a seis minutos 38%B, seis a ocho minutos 60%B, ocho a 8.5 minutos 60%B, 8.5 a nueve minutos 10%B. Ajuste el espectrómetro de masas en modo de ionización negativa.Use nitrógeno como gas de secado a 300 grados Celsius y caudal a 13 litros por minuto. Ajuste la presión del nebulizador a 30 psi. Establezca un voltaje capilar a 4, 000 voltios, un voltaje de fragmentor a 175 voltios y un voltaje skimmer a 65 voltios.Escanee las masas entre 100 y 1100 m/z y para la espectrometría de masas, escanee masas entre 50 y 1000 m/z. Establezca la adquisición de datos en modo Auto MS/MS. Utilice la siguiente masa de referencia, 119.036 y 966.0007.Búsqueda de compuestos fenólicos, metabolitos fenólicos y otros compuestos de interés en la literatura científica. Abra el software de gestión de bases de datos incluido en el sistema UPLC. Seleccione archivo y, a continuación, seleccione nueva biblioteca compuesta de base de datos personal, PCDL.A continuación, seleccione, cree un nuevo PCDL. Seleccione el tipo de metabolómica PCDL LC/MS. Establezca el nombre de PCDL.A continuación, seleccione crear. En la barra de herramientas, seleccione PCDL y, a continuación, la opción Permitir edición. A continuación, haga clic en el botón Buscar compuestos.Los compuestos se pueden agregar a la biblioteca personal de dos maneras, primero copiándolos de la biblioteca general del instrumento. Para ello, abra los instrumentos existentes en la base de datos incluida en la gestión de datos hasta el momento. Haga clic en el botón buscar compuestos.En la opción de búsqueda única, introduzca los criterios de búsqueda de compuestos para encontrar el compuesto de interés. En la tabla de resultados compuestos, seleccione el compuesto de interés. Para seleccionar más de un compuesto, haga clic en el primer compuesto, mantenga presionada la tecla CTRL y, a continuación, haga clic en cada compuesto de interés.Luego, haga clic derecho en todos los compuestos resaltados y seleccione Anexar a PCDL. En la nueva ventana, busque y seleccione el archivo de base de datos personal especializado. Marque la casilla incluir espectros para compuesto si está presente.Haga clic en el botón Anexar. En el nuevo cuadro de diálogo, seleccione Sí para comprobar los nuevos compuestos agregados. Seleccione No para seguir buscando más compuestos de interés.En segundo lugar, se pueden agregar nuevos compuestos manualmente si no están disponibles en la biblioteca general del instrumento. Para ello abierto, la base de datos personal especializada. Una vez abierto, seleccione PCDL y, a continuación, la opción Permitir edición.Seleccione la opción editar compuestos. Haga clic en el botón Agregar nuevo. En la sección superior de la ventana, complete la información del nuevo compuesto.Rellene la fórmula, el nombre, el nombre de la IUPAC, el número CAS, el ID de Chemspider y otros identificadores. Utilizando la información disponible en las bibliotecas en línea gratuitas, Chemspider, PubChem y Phenol Explorer para completar la información del nuevo compuesto de interés. Una vez terminado, haga clic en el botón guardar como nuevo para guardar la nueva información compuesta en la base de datos personal especializada.Repite el proceso con todos los compuestos de interés para completar la base de datos personal especializada. Utilice el software de gestión cualitativa del instrumento para identificar compuestos fenólicos y metabolitos fenólicos. Abra el archivo de ejemplo.En el panel Cromatograma, seleccione definir Cromatogramas y extraer el cromatograma iónico total TIC, cromatograma iónico extraído de MS EIC y EIC de MS/MS. Seleccione la opción Integrar cromatograma. En el panel Buscar compuestos, seleccione buscar por opciones de fórmula.En la nueva ventana, seleccione origen de la fórmula y, a continuación, la opción biblioteca de barras diagonales de la base de datos. Encuentre la base de datos personal creada anteriormente y haga clic en abrir. Seleccione la opción de coincidencia de fórmula y establezca una tolerancia de coincidencia de masa de cinco partes por millón, ppm.Seleccione la opción de iones negativos y seleccione sólo el cuadro de diálogo menos H. En la opción de resultados, marque el EIC de extracción, extraiga el espectro limpio, extraiga el espectro sin procesar e incluya cuadros de diálogo estructurados. Seleccione la opción de filtros de resultados.Y luego marque advertir si el puntaje es, luego establezca el puntaje coincidente en 80%Luego marque no coincida si el puntaje es y establezca el puntaje en 75%Luego haga clic en buscar compuestos por fórmula para identificar compuestos de interés en la muestra. El proceso paso a paso para la identificación de metabolitos fenólicos a través del análisis semi-dirigido UPLC MS/MS de muestras plasmáticas se muestra en la siguiente figura. En primer lugar, el cromatograma iónico total se obtuvo utilizando una base de datos PCDL autocreada que contenía 645 compuestos fenólicos y sus metabolitos, obtenidos de bases de datos en línea gratuitas.A continuación, se obtuvo la tolerancia de coincidencia extraída del cromatograma iónico y la fragmentación, o los iones con menos de cinco ppm de masa. Finalmente, se comparó la distribución isotópica de los picos detectados con la de los compuestos teóricos. A partir de este análisis, se identificaron un total de 25 compuestos fenólicos y metabolitos en las muestras de plasma.Para evaluar la efectividad del método de diseño en la identificación de los compuestos fenólicos absorbentes o sus metabolitos, se analizaron cinco muestras de los participantes del estudio obtenidas antes y después de la intervención de 30 días. La abundancia relativa de cada compuesto se calculó dividiendo el área bajo la curva después del tratamiento por AUC antes del tratamiento. La Tabla cuatro muestra la lista de 12 compuestos fenólicos que mostraron un aumento en el plasma después del consumo de 30 días de los alimentos que contienen harina de brosimum alicastrum.El ácido fenilacético fue solo un metabolito encontrado consistentemente en mayor concentración después del tratamiento. La glicitina, una isoflavona glicosilada, y tres ácidos hidroxifenilvaléricos aumentaron en tres de las cinco muestras, pero disminuyeron en las otras dos. Gomisin M2, un lignano, se detectó en tres de las cinco muestras solo después de la intervención nutricional.Los otros compuestos fenólicos y metabolitos se encontraron solo en una muestra y solo después del tratamiento. El método desarrollado en el presente trabajo, muestra que en la mayoría de las partes era muy adecuado para el objetivo para el que fue creado. La muestra por tratamiento fue simple y efectiva.Se logró la separación de UPLC y la identificación semi-dirigida de MS/MS de metabolitos fenólicos.

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Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Cromatografía semidirigida de ultra alto rendimiento acoplada al análisis de espectrometría de masas de metabolitos fenólicos en plasma de adultos mayores (Video) | JoVE Journal

Cromatografía semidirigida de ultra alto rendimiento acoplada al análisis de espectrometría de masas de metabolitos fenólicos en plasma de adultos mayores

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