Name: Una plataforma de descubrimiento robusta para la identificación de nuevos mediadores de la metástasis del melanoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Aprenda a evaluar reguladores candidatos de metástasis de melanoma mediante modelos in vivo estandarizados. Este flujo de trabajo robusto mejora la reproducibilidad y facilita el descubrimiento de dianas terapéuticas en oncología.

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Agradecemos a la División de Tecnologías de Investigación Avanzada (DART) de NYU Langone Health, y en particular, al Laboratorio de Investigación de Patología Experimental, el Centro de Tecnología del Genoma, el Laboratorio de Citometría y Clasificación Celular, el Núcleo de Imágenes Preclínicas, que cuentan con el apoyo parcial de la Subvención de Apoyo del Centro de Cáncer Perlmutter NIH / NCI 5P30CA016087. Agradecemos al NYU Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group (PI: Dr. Iman Osman) por proporcionar acceso a cultivos a corto plazo de melanoma derivado de pacientes + (10-230BM y 12-273BM), que se obtuvieron a través de protocolos aprobados por IRB (estudio de consentimiento universal #s16-00122 y estudio del Grupo Cooperativo interdisciplinario de melanoma # 10362). Agradecemos al Dr. Robert Kerbel (Universidad de Toronto) por proporcionar líneas celulares de melanoma 113/6-4L y 131/4-5B1* y al Dr. Meenhard Herlyn (Instituto Wistar) por proporcionar cultivos a corto plazo de melanoma WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2*. E.H. cuenta con el apoyo de NIH/NCI R01CA243446, P01CA206980, un Premio científico del equipo de la American Cancer Society-Melanoma Research Alliance y una ESPORA de melanoma de los NIH (NCI P50 CA225450; PI: I.O.). La figura 1 se creó con Biorender.com.

<ol><li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Cancer+Statistics+2020%3A+GLOBOCAN+Estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li>
<li>Adler, N. R., Haydon, A., McLean, C. A., Kelly, J. W., Mar, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+pathways+in+patients+with+cutaneous+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">Metastatic pathways in patients with cutaneous melanoma.</a> Pigment Cell Melanoma Research. 30 (1), 13-27 (2017).</li>
<li>Platz, A., Egyhazi, S., Ringborg, U., Hansson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cutaneous+melanoma%3B+a+review+of+NRAS+and+BRAF+mutation+frequencies+in+relation+to+histogenetic+subclass+and+body+site%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oncology%22%5BJournal%5D)">Human cutaneous melanoma; a review of NRAS and BRAF mutation frequencies in relation to histogenetic subclass and body site.</a> Molecular Oncology. 1 (4), 395-405 (2008).</li>
<li>Alonso, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+study+in+melanoma+identifies+epithelial-mesenchymal+transition+as+a+major+determinant+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A high-throughput study in melanoma identifies epithelial-mesenchymal transition as a major determinant of metastasis.</a> Cancer Research. 67 (7), 3450-3460 (2007).</li>
<li>Rowe, C. J., Khosrotehrani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+biological+determinants+of+melanoma+progression%3A+Should+all+be+considered+for+clinical+management%5BTitle%5D)+AND+%22Australasian+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Clinical and biological determinants of melanoma progression: Should all be considered for clinical management.</a> Australasian Journal of Dermatology. 57 (3), 175-181 (2016).</li>
<li>Plebanek, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-metastatic+cancer+exosomes+induce+immune+surveillance+by+patrolling+monocytes+at+the+metastatic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pre-metastatic cancer exosomes induce immune surveillance by patrolling monocytes at the metastatic niche.</a> Nature Communications. 8 (1), 1319(2017).</li>
<li>Orgaz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+pigment+epithelium-derived+factor+enables+migration%2C+invasion+and+metastatic+spread+of+human+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Loss of pigment epithelium-derived factor enables migration, invasion and metastatic spread of human melanoma.</a> Oncogene. 28 (47), 4147-4161 (2009).</li>
<li>Ladhani, O., Sanchez-Martinez, C., Orgaz, J. L., Jimenez, B., Volpert, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pigment+epithelium-derived+factor+blocks+tumor+extravasation+by+suppressing+amoeboid+morphology+and+mesenchymal+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Pigment epithelium-derived factor blocks tumor extravasation by suppressing amoeboid morphology and mesenchymal proteolysis.</a> Neoplasia. 13 (7), 633-642 (2011).</li>
<li>Ju, R. J., Stehbens, S. J., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+melanoma+cell-stroma+interaction+in+cell+motility%2C+invasion%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine+-+Dermatology%22%5BJournal%5D)">The role of melanoma cell-stroma interaction in cell motility, invasion, and metastasis.</a> Frontiers in Medicine - Dermatology. 5, 307(2018).</li>
<li>Wiley, H. E., Gonzalez, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+CC+chemokine+receptor-7+and+regional+lymph+node+metastasis+of+B16+murine+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma.</a> Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).</li>
<li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+pathways+and+time+courses+in+the+orderly+progression+of+cutaneous+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Metastatic pathways and time courses in the orderly progression of cutaneous melanoma.</a> British Journal of Dermatology. 147 (1), 62-70 (2002).</li>
<li>Turner, N., Ware, O., Bosenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+metastasis%3A+melanoma+and+other+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Genetics of metastasis: melanoma and other cancers.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 35 (5-6), 379-391 (2018).</li>
<li>Ubellacker, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+protects+metastasizing+melanoma+cells+from+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lymph protects metastasizing melanoma cells from ferroptosis.</a> Nature. 585 (7823), 113-118 (2020).</li>
<li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li>
<li>Cunningham, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-binding+protein+requirement+for+cortical+stability+and+efficient+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Actin-binding protein requirement for cortical stability and efficient locomotion.</a> Science. 255 (5042), 325-327 (1992).</li>
<li>Unger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+carcinomas%3A+physiologically+relevant+3D+models+to+improve+anti-cancer+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Modeling human carcinomas: physiologically relevant 3D models to improve anti-cancer drug development.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 50-67 (2014).</li>
<li>Fong, E. L., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heralding+a+new+paradigm+in+3D+tumor+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling.</a> Biomaterials. 108, 197-213 (2016).</li>
<li>Nakamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mouse+melanoma+cell+lines+by+their+mortal+malignancy+using+an+experimental+metastatic+model%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of mouse melanoma cell lines by their mortal malignancy using an experimental metastatic model.</a> Life Science. 70 (7), 791-798 (2002).</li>
<li>Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+YUMM+lines%3A+a+series+of+congenic+mouse+melanoma+cell+lines+with+defined+genetic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations.</a> Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).</li>
<li>Koya, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+inhibitor+vemurafenib+improves+the+antitumor+activity+of+adoptive+cell+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">BRAF inhibitor vemurafenib improves the antitumor activity of adoptive cell immunotherapy.</a> Cancer Research. 72 (16), 3928-3937 (2012).</li>
<li>Jenkins, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+murine+BRaf%28V600E%29+melanoma+cell+lines+with+sensitivity+to+PLX4032%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">Multiple murine BRaf(V600E) melanoma cell lines with sensitivity to PLX4032.</a> Pigment Cell Melanoma Research. 27 (3), 495-501 (2014).</li>
<li>Tuncer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMAD+signaling+promotes+melanoma+metastasis+independently+of+phenotype+switching%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">SMAD signaling promotes melanoma metastasis independently of phenotype switching.</a> The Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2702-2716 (2019).</li>
<li>Schwartz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incipient+Melanoma+Brain+Metastases+Instigate+Astrogliosis+and+Neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Incipient Melanoma Brain Metastases Instigate Astrogliosis and Neuroinflammation.</a> Cancer Research. 76 (15), 4359-4371 (2016).</li>
<li>Perez-Guijarro, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodel+preclinical+platform+predicts+clinical+response+of+melanoma+to+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multimodel preclinical platform predicts clinical response of melanoma to immunotherapy.</a> Nature Medicine. 26 (5), 781-791 (2020).</li>
<li>Krepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Patient-Derived+Xenograft+Collection+Representing+the+Heterogeneity+of+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma.</a> Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).</li>
<li>Agrawal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systems+biology+approach+identifies+FUT8+as+a+driver+of+melanoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A systems biology approach identifies FUT8 as a driver of melanoma metastasis.</a> Cell. 31 (6), 804-819 (2017).</li>
<li>Hanniford, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+CDR1as+drives+IGF2BP3-mediated+melanoma+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of CDR1as drives IGF2BP3-mediated melanoma invasion and metastasis.</a> Cancer Cell. 37 (1), 55-70 (2020).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT5+control+of+cGAS%2FSTING+and+NLRC5+pathways+defines+melanoma+response+to+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">PRMT5 control of cGAS/STING and NLRC5 pathways defines melanoma response to antitumor immunity.</a> Science Translational Medicine. 12 (551), (2020).</li>
<li>de Miera, E. V., Friedman, E. B., Greenwald, H. S., Perle, M. A., Osman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+five+new+melanoma+low+passage+cell+lines+representing+the+clinical+and+genetic+profile+of+their+tumors+of+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">Development of five new melanoma low passage cell lines representing the clinical and genetic profile of their tumors of origin.</a> Pigment Cell Melanoma Research. 25 (3), 395-397 (2012).</li>
<li>Morsi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+clinically+relevant+mouse+model+of+melanoma+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a clinically relevant mouse model of melanoma brain metastasis.</a> Pigment Cell Melanoma Research. 26 (5), 743-745 (2013).</li>
<li>Huynh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+microRNA+targeting+of+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo microRNA targeting of liver metastasis.</a> Oncogene. 30 (12), 1481-1488 (2011).</li>
<li>Zou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+variables+that+affect+human+hepatocyte+AAV+transduction+in+liver+chimeric+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Experimental variables that affect human hepatocyte AAV transduction in liver chimeric mice.</a> Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 18, 189-198 (2020).</li>
<li>Kleffman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma-secreted+Amyloid+Beta+Suppresses+Neuroinflammation+and+Promotes+Brain+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Melanoma-secreted Amyloid Beta Suppresses Neuroinflammation and Promotes Brain Metastasis.</a> bioRxiv. , 854885(2019).</li>
<li>Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+variations+of+skin+pigmentation+in+C57BL%2F6+mice+affect+optical+bioluminescence+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation.</a> Molecular Imaging and Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).</li>
<li>Sil, P., Wong, S. W., Martinez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+skin+deep%3A+autophagy+is+vital+for+skin+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">More than skin deep: autophagy is vital for skin barrier function.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1376(2018).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+CRISPR+screen+in+a+mouse+model+of+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis.</a> Cell. 160 (6), 1246-1260 (2015).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+CRISPR+screens+reveal+fitness+genes+and+genotype-specific+cancer+liabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities.</a> Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li>
<li>Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+Omnibus%3A+NCBI+gene+expression+and+hybridization+array+data+repository%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository.</a> Nucleic Acids Research. 30 (1), 207-210 (2002).</li>
<li>Lappalainen, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+European+Genome-phenome+Archive+of+human+data+consented+for+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The European Genome-phenome Archive of human data consented for biomedical research.</a> Nature Genetics. 47 (7), 692-695 (2015).</li>
<li>Cerami, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cBio+cancer+genomics+portal%3A+an+open+platform+for+exploring+multidimensional+cancer+genomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">The cBio cancer genomics portal: an open platform for exploring multidimensional cancer genomics data.</a> Cancer Discovery. 2 (5), 401-404 (2012).</li>
<li>Grossman, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+shared+vision+for+cancer+genomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Toward a shared vision for cancer genomic data.</a> New England Journal of Medicine. 375 (12), 1109-1112 (2016).</li>
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Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

El objetivo de este informe técnico es ofrecer un flujo de trabajo estandarizado de arriba a abajo para la investigación de actores potenciales en la metástasis del melanoma. Como los experimentos in vivo pueden ser costosos y llevar mucho tiempo, las estrategias para maximizar la eficiencia y aumentar el valor de la información obtenida son primordiales.
Es imperativo utilizar enfoques complementarios para validar los hallazgos dentro del mismo experimento. Por ejemplo, tanto la tinc...

La alta mortalidad asociada con el melanoma metastásico combinada con una incidencia creciente de melanoma en todo el mundo1 (un aumento estimado del 7,86% para 2025) requiere nuevos enfoques de tratamiento. Los avances en el descubrimiento de objetivos dependen de modelos reproducibles de metástasis, un proceso altamente complejo. A lo largo de los pasos de la cascada metastásica, las células de melanoma deben superar innumerables barreras para lograr la evasión del sistema inmune y la colonización de tejidos distantes2. La resiliencia y adaptabilidad de las células de melanoma surgen de multitud de factores, entre ellos su elevada carga mutacional genética3 y su origen en la cresta neural, que confieren una plasticidad fenotípica crucial 3,4,5. En cada paso, los programas transcripcionales permiten que las células de melanoma en metástasis cambien de un estado a otro en función de las señales de la diafonía con el microambiente, que comprende el sistema inmune6, el medio extracelular 7,8 y la arquitectura celular de las barreras físicas9 con las que entran en contacto. Por ejemplo, las células de melanoma escapan a la vigilancia inmune al regular a la baja la expresión de importantes factores secretos por tumores inmunocebadores6.
Los estudios describen un "nicho premetastático", en el que las células de melanoma secretan quimiocinas y citoquinas para preparar el órgano "objetivo" distante para la metástasis10. Estos hallazgos plantean preguntas importantes sobre el tropismo de los órganos de las células de melanoma metastásico y la ruta anatómica que toman para acceder a tejidos distantes. Después de la intravasación, se sabe que las células de melanoma hacen metástasis a través de los linfáticos (diseminación linfática) y los vasos sanguíneos (diseminación hematógena)2,11. Si bien la mayoría de los pacientes presentan enfermedad localizada, un pequeño subconjunto de casos se presenta con enfermedad metastásica a distancia y sin diseminación linfática (afectación negativa de los ganglios linfáticos)11, lo que sugiere la existencia de vías metastásicas alternativas para el melanoma.
Cuando colonizan un sitio metastásico, las células de melanoma experimentan adaptaciones epigenéticas y metabólicas12,13. Para acceder e invadir nuevos compartimentos, las células de melanoma emplean proteasas14 y modificaciones citoesqueléticas 11,15, que les permiten atravesar y crecer en su nueva ubicación. La dificultad para atacar las células de melanoma reside en la complejidad y el número de tales adaptaciones; por lo tanto, el campo debe hacer esfuerzos para recrear experimentalmente tantos pasos y adaptaciones como sea posible. A pesar de los numerosos avances en ensayos in vitro como organoides y cultivos 3D16,17, estos modelos solo recapitulan incompletamente la cascada metastásica in vivo.
Los modelos murinos han demostrado valor al lograr un equilibrio entre la reproducibilidad, la viabilidad técnica y la simulación de enfermedades humanas. Las células de melanoma implantadas intravascular, ortotópica y heterotópicamente a partir de xenoinjertos derivados del paciente o cultivos a corto plazo en ratones inmunocomprometidos o humanizados representan la columna vertebral del descubrimiento de dianas en el melanoma metastásico. Sin embargo, estos sistemas a menudo carecen de una restricción biológica crucial en la metástasis: el sistema inmunológico. Los modelos de metástasis de melanoma singénico que poseen esta restricción son relativamente escasos en el campo. Estos sistemas, desarrollados en ratones inmunocompetentes, incluyendo B16-F1018, la familia YUMM de líneascelulares 19, SM120, D4M321, RIM322 o más recientemente, las líneas celulares de melanoma RMS23 y M1 (Mel114433), M3 (HCmel1274), M4 (B2905)24 , facilitan la investigación del complejo papel de la respuesta inmune del huésped en la progresión del melanoma.
Aquí, se presenta una tubería para la identificación del objetivo de metástasis de melanoma. Con el aumento y la generación de conjuntos de datos ómicos a partir de cohortes de pacientes con melanoma, postulamos que los estudios que tienen la promesa más clínica son los que se derivan de la integración de big data, lo que lleva a un meticuloso interrogatorio funcional y mecanicista 25,26,27,28. Mediante el uso de modelos de ratón para estudiar objetivos potenciales en el proceso metastásico, se pueden tener en cuenta los eventos específicos in vivo y las interacciones tisulares, lo que aumenta la probabilidad de traducción clínica. Se describen múltiples métodos para cuantificar la carga metastásica, proporcionando datos complementarios sobre los resultados de cualquier experimento dado. Se describe un protocolo para el aislamiento unicelular de tumores en varios órganos para ayudar a la caracterización imparcial de la expresión génica en células metastásicas, que puede preceder a la secuenciación de ARN unicelular o a granel.

<table><tbody><tr><td>#15 Hoja de Scapel &nbsp;</td><td>WPI</td><td>500242</td><td>Para procedimientos quirúrgicos</td></tr><tr><td>#3 Mango Scapel WPI 500236</td><td></td><td></td><td>Para procedimientos quirúrgicos</td></tr><tr><td>Jeringa de tuberculina de 1 mL, punta deslizante&nbsp;</td><td>BD</td><td>309626</td><td>Injections jeringa de</td></tr><tr><td>10 mL, punta deslizante&nbsp;</td><td>BD</td><td>301029</td><td>Perfusión</td></tr><tr><td>10% Formalina Sódica Tamponada EK Industries</td><td></td><td>4499-20L</td><td>Para perfusión/fijador tisular</td></tr><tr><td>15 mL</td><td>Corning cónico &nbsp;</td><td>430052</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>15 mL Tubos de centrífuga de polipropileno cónico</td><td>Falcon</td><td></td><td>352196 Cultivo celular</td></tr><tr><td>Etanol de 200 pruebas</td><td>Deacon Labs</td><td>04-355-223</td><td>Histología</td></tr><tr><td>22G &ndash; Aguja de 22 mm</td><td>BD</td><td>305156</td><td>Perfusión</td></tr><tr><td>4-0 Sutura de Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>J464G</td><td>Sutura</td></tr><tr><td>4% de fosfato de Carson tamponado paraformaldehído&nbsp;</td><td>EMS</td><td>15733-10</td><td>Para perfusión/fijador tisular</td></tr><tr><td>40&micro; m</td><td>Corning</td><td>431750</td><td>Procesamiento de tejidos</td></tr><tr><td>5-0 Sutura absorbible&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>6542000</td><td>Tapón</td></tr><tr><td>50 mL Cónico&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430828</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>50mL Tubos de centrífuga de polipropileno cónico</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>7-0 Sutura de seda&nbsp;</td><td>FST</td><td>18020-70</td><td>Ligadura</td></tr><tr><td>70&micro; m</td><td>Corning</td><td>431751</td><td>Procesamiento</td></tr><tr><td>de tejidos Medios de montaje antidecoloración&nbsp; &nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000-10</td><td>Aproximador de inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>que aplica fórceps, 10 cm&nbsp;</td><td>WPI</td><td>14189</td><td>Para procedimientos microquirúrgicos</td></tr><tr><td>Avance</td><td>Bruker</td><td>3 HD</td><td>Consola de RMN&nbsp;</td></tr><tr><td>Biospec 7030&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>7030</td><td>Micro MRI</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Bioreg</td><td>A941</td><td>NuMA Tinción</td></tr><tr><td>Pinzas de sutura Castroviejo, puntas rectas Plataforma de atado de 5,5 mm, 11 cm&nbsp;</td><td>WPI</td><td>WP5025501</td><td>Para procedimientos microquirúrgicos</td></tr><tr><td>Coplin Staining Jar</td><td>Bel-Art&nbsp;</td><td>F44208-1000</td><td>Histología</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>Inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>dCas9-KRAB</td><td>Addgene</td><td>110820</td><td>Manipulación genética</td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>NEB</td><td>M0303L</td><td>Procesamiento de tejidos</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Corning</td><td>21-030-CM Procesamiento de</td><td>tejidos</td></tr><tr><td>Cuchilla de un solo filo extra afilada sin recubrimiento GEM</td><td></td><td>62-0167</td><td>Procesamiento de tejidos</td></tr><tr><td>Sustrato de matriz extracelular&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>considerar el factor de crecimiento reducido ( como alternativa&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Cytiva</td><td>SH30910.03</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Fiji Image J</td><td>Fiji Image J</td><td>Software</td><td>Immunofluorescence</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit HRP conjugado multimer&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>A16104</td><td>NuMA Tinción Suero</td></tr> de <tr><td>cabra</td><td>Gibco</td><td>PCN5000</td><td>Inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-020-CV</td><td>Procesamiento de tejidos</td></tr><tr><td>Hematoxilina&nbsp;</td><td>Richard-Allan Scientific&nbsp;</td><td>7231</td><td>Histología</td></tr><tr><td>Illumina III&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136334</td><td>BLI Instrument</td></tr><tr><td>Jeringa de insulina 28G - aguja de 8 mm</td><td>BD</td><td>329424</td><td>Inyecciones</td></tr><tr><td>Jeringa de insulina 31G - aguja de 6 mm&nbsp;</td><td>BD</td><td>326730</td><td>Inyecciones Pinzas de</td></tr><tr><td>iris, 10,2 cm, curva completa,</td><td>dentadas</td><td>WPI 504478</td><td>Para perfusión y procedimientos quirúrgicos</td></tr><tr><td>Isoflurano USP</td><td>Covetrus</td><td>11695067772</td><td>Anesthesia</td></tr><tr><td>Jewelers #7 Pinzas de titanio 11 cm 0,07 x 0,01 mm Punta</td><td>WPI</td><td>WP6570</td><td>Para procedimientos microquirúrgicos</td></tr><tr><td>Ketamina HCl 100 mg / mL</td><td>Mylan Ind.</td><td>1049007</td><td>Anestesia</td></tr><tr><td>lentiCRISPRv2</td><td>Addgene</td><td>98290</td><td>Manipulación genética</td></tr><tr><td>Lycopersicon Esculentum (Tomate) Lectina, DyLight 649</td><td>Invitrogen</td><td>L32472</td><td>Marcador de células endoteliales</td></tr><tr><td>vasculares MEM aminoácidos no esenciales X 100</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Metzenbaum</td><td>WPI</td><td>503269</td><td>Para cirugía procedimientos</td></tr><tr><td>Unidad de microinyección</td><td>KOPF</td><td>5000</td><td>Inyecciones intracardíacas NaCl</td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>S25877&nbsp;</td><td>Tinción NuMA</td></tr><tr><td>Aguja 30G x 25mm</td><td>BD</td><td>305128</td><td>Aguja de Inyección Intracardíaca</td></tr><tr><td>33G x 15mm</td><td>Hamilton</td><td>7747-01</td><td>Inyección Intracarotídea</td></tr><tr><td>Soporte de Aguja, Castroviejo, 14cm, con cerradura, 1.2mm Mordazas dentadas</td><td>WPI</td><td>14137-G</td><td>Para procedimientos microquirúrgicos</td></tr><tr><td>NOD. Ratones Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td><td>El Laboratorio Jackson 005557</td><td></td><td>Ratones NU</td></tr><tr><td>/J modelo murino</td><td>El Laboratorio Jackson</td><td>002019</td><td>modelo murino</td></tr><tr><td>Aparato mitótico nuclear Proteína policlonal conejo anti-humano&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>97585</td><td>NuMA Tinción</td></tr><tr><td>de penicilina-estreptomicina 10000U/mL</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE</td><td>0891-01</td><td>solución de separación por densidad&nbsp;</td></tr><tr><td>PI Guantes Quirúrgicos Clásicos</td><td>Cardinal Health</td><td>2D72PT75X</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>pLKO Tet-On</td><td>Addgene</td><td>21915</td><td>Manipulación genética</td></tr><tr><td>Povidona-Yodo 10% Solución Medline</td><td></td><td>MDS093943</td><td>Cirugía</td></tr><tr><td>Proparacaína Gotas 0.5%</td><td>Akorn Pharma</td><td>AX0501</td><td>Anestésico local oftálmico</td></tr><tr><td>Puralube Petrolatum Pomada Oftálmica</td><td>Dechra</td><td>83592</td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla de afeitar de anestesia Cuchillas de doble filo&nbsp;</td><td>EMS</td><td>72000</td><td>Afeitado y corte de cerebro con vibrótomo&nbsp;</td></tr><tr><td>Reflex 9mm EZ Clip&nbsp;</td><td>Braintree</td><td>EZC-&nbsp; KIT</td><td>Cierre de herida</td></tr><tr><td>RPMI 1640&nbsp;</td><td>Corning</td><td>10-040-CM</td><td>Tijeras para cultivo celular</td></tr><tr><td>, resorte 10,5 cm Str, 8 mm Cuchillas</td><td>WPI</td><td>501235</td><td>Para procedimientos microquirúrgicos</td></tr><tr><td>Cuchilla vibratoria semiautomática Microtomo</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>Brain Slice Inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Anestesia de un solo canal Sistema de vaporizador</td><td>Kent Scientific</td><td>VetFlo-1210S&nbsp;</td><td>anestesia</td></tr><tr><td>Smartbox Sistema de cámara de sobremesa y soplador de escape</td><td>EZ Systems</td><td>TT4000</td><td>CO2 Eutanasia</td></tr><tr><td>Estéril Fenestrado Paño Desechable</td><td>Medline</td><td>NON21002</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Batas quirúrgicas Aurora estériles no reforzadas con fundas de ajuste</td><td>Medline</td><td>DYNJP2715</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>T25 Flask</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430639</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Corning</td><td>46-031-CM</td><td>Tinción NuMA Triton</td></tr><tr><td>X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de atado Troutman de inmunofluorescencia, 10 cm, patrón G curvado, punta de 0,52 mm con plataforma de atado</td><td>WPI</td><td>WP505210</td><td>Para procedimientos microquirúrgicos</td></tr><tr><td>Clips de vasos 10G Presión 5x 0,8 mm Mandíbulas, 5/paquete</td><td>WPI</td><td>15911</td><td>Para procedimientos microquirúrgicos</td></tr><tr><td>Visiopharm</td><td>Visiopharm</td><td>Visiopharm</td><td>NuMA Software de cuantificación de tinciones</td></tr><tr><td>Xilasina 100mg/mL</td><td>Akorn Pharma</td><td>59399-111-50</td><td>Anestesia</td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Fisher</td><td>X3P-1GAL</td><td>Histología</td></tr></tbody></table>

una plataforma de descubrimiento robusta para la identificación de nuevos mediadores de la metástasis del melanoma

A Robust Discovery Platform for the Identification of Novel Mediators of Melanoma Metastasis

La metástasis es un proceso complejo que requiere que las células superen barreras que solo se modelan de manera incompleta mediante ensayos in vitro . Se estableció un flujo de trabajo sistemático utilizando modelos in vivo robustos y reproducibles y métodos estandarizados para identificar nuevos actores en la metástasis del melanoma. Este enfoque permite la inferencia de datos en etapas experimentales específicas para caracterizar con precisión el papel de un gen en la metástasis. Los modelos se establecen mediante la introducción de células de melanoma modificadas genéticamente a través de inyecciones intracardíacas, intradérmicas o subcutáneas en ratones, seguidas de monitoreo con imágenes seriales in vivo . Una vez que se alcanzan los criterios de valoración preestablecidos, los tumores primarios y / o los órganos portadores de metástasis se extraen y procesan para diversos análisis. Las células tumorales se pueden clasificar y someter a cualquiera de varias plataformas "ómicas", incluida la secuenciación de ARN unicelular. Los órganos se someten a análisis de imagen e inmunohistopatológicos para cuantificar la carga general de metástasis y mapear su ubicación anatómica específica. Esta tubería optimizada, que incluye protocolos estandarizados para el injerto, monitoreo, recolección de tejidos, procesamiento y análisis, se puede adoptar para cultivos a corto plazo derivados de pacientes y líneas celulares humanas y murinas establecidas de varios tipos de cáncer sólido.

Las siguientes figuras ilustran cómo se ha aplicado el flujo de trabajo descrito para la identificación de nuevos impulsores de la metástasis del melanoma. La Figura 2 resume los resultados de un estudio publicado en el que se estudiaron los efectos del silenciamiento de la fucosiltransferasa FUT8 en metástasis de melanoma in vivo 26. Brevemente, el análisis de los datos glucómicos del paciente humano (obtenidos por matrices de lectinas) y el perfil transcrip...

Este artículo describe un flujo de trabajo de técnicas empleadas para probar nuevos mediadores candidatos de metástasis de melanoma y sus mecanismos de acción.

Una plataforma de descubrimiento robusta para la identificación de nuevos mediadores de la metástasis del melanoma

Metastasis is a complex process, requiring cells to overcome barriers that are only incompletely modeled by in vitro assays. A systematic workflow was ...

Este protocolo describe una serie de técnicas dentro de un flujo de trabajo continuo que pueden utilizarse para evaluar los efectos in vivo de los candidatos reguladores de la metástasis del melanoma, pero también de la metástasis de otras neoplasias malignas sólidas. La principal ventaja de nuestro flujo de trabajo sistemático es una mayor reproducibilidad de los datos debido a modelos y técnicas in vivo robustos y estandarizados. Esta tubería ofrece una vía para el descubrimiento de objetivos y el desarrollo de terapias mediante la prueba de candidatos inferidos a partir de datos ómicos o ensayos in vitro en un entorno in vivo.La curva de aprendizaje asociada a las técnicas presentadas en este protocolo se acorta utilizando los materiales proporcionados y siguiendo la descripción detallada al practicar los pasos. Ayudando a demostrar el procedimiento estará Orlando Aristizabal, un científico investigador en The Preclinical Imaging Core y Ran Moubarak, un instructor en mi laboratorio. Para inyecciones intradérmicas, anestesia y afeita a un ratón de ocho a 10 semanas de edad dentro de un gabinete de bioseguridad mientras mantiene condiciones asépticas.Luego agarre y retraiga la pie

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

En este artículo se describen los procedimientos de ensayo de metástasis experimental que se utiliza para determinar el potencial metastásico de líneas celulares de cáncer humano.

Ensayo experimental de metástasis

Este video describe el protocolo para establecer un modelo de ratón de metástasis espontánea de xenoinjertos derivados de pacientes con cáncer colorrectal o PDX. Estos modelos de xenoinjertos imitan parcialmente las características de los carcinomas humanos y comprenden los aspectos críticos de las neoplasias malignas humanas, incluidas la invasión y la metástasis.

Modelos de ratón con metástasis espontánea: una plataforma para estudiar el potencial metastásico de las células de cáncer colorrectal inyectadas ortotópicamente

En este video, las células de melanoma se inyectan por vía intravenosa a través de la vena de la cola en el modelo de ratón. Las células del melanoma viajan a través del sistema circulatorio, adaptándose al microambiente distante y causando metástasis en órganos como los pulmones.

Modelo experimental de ratón de melanoma metastásico: una plataforma para estudiar el potencial metastásico de las células de melanoma en los pulmones

Este protocolo describe una técnica para la preparación de muestras mediante el cocultivo de explantes de ovario con las células cancerosas de las trompas de Falopio. Estas muestras se visualizan mediante espectroscopia de masas por imágenes, o IMS, para detectar el intercambio de moléculas pequeñas entre las células y los tejidos que conduce al desarrollo de tumores.

Modelado de la comunicación del cáncer de ovario para el análisis de espectrometría de masas por imágenes: un método para identificar comunicadores químicos de moléculas pequeñas en el desarrollo de tumores de ovario metastásicos

La metástasis desempeña un papel profundo en la virulencia del cáncer, representando aproximadamente el 90% de las muertes.  Presentamos un protocolo para un modelo de melanoma metastásico en ratones que es útil para determinar la eficacia de agentes terapéuticos frente a este fenómeno clínico.

La inyección de células de melanoma murino singénico para determinar su potencial metastásico en los pulmones

Aquí, presentamos un protocolo para generar un modelo 3D organotypic melanoma esferoide piel que recapitula la arquitectura y complejidad multicelular de un órgano, tumor en vivo pero al mismo tiempo acomoda sistemático experimental intervención.

Un modelo de piel Organotypic Melanoma 3D esferoide

Presentamos un protocolo para evaluar los niveles de expresión de microRNAs (miRNAs) que circulan en las muestras de plasma de pacientes con cáncer. En particular, se utilizó un kit disponible comercialmente para la extracción de miRNA y transcripción reversa de la circulación. Por último, hemos analizado un panel de 24 miRNAs seleccionados usando las placas personalizadas de sonda previamente manchado en tiempo real.

Detección de un Panel personalizado de microARN circulantes en pacientes con cáncer colorrectal metastásico

En la era de la inmunoterapia y el perfil genómico unicelular, la biología del cáncer requiere nuevas herramientas in vitro y computacionales para investigar la interfaz tumor-inmune en un contexto espaciotemporal adecuado. Describimos protocolos para explotar cocultivos microfluídicos inmunes al tumor en entornos 2D y 3D, compatibles con el monitoreo dinámico y multiparamétrico de las funciones celulares.

Modelos de cocultivo microfluídico para diseccionar la respuesta inmune en microambientes tumorales in vitro

Este es un método eficaz para detectar supresores o impulsores de metástasis del cáncer. Las células, transducidas con una biblioteca de expresión, se inyectan en la vasculatura de la membrana corioalantoica del pollo para formar colonias metastásicas. Las colonias que han disminuido o aumentado la invasividad se extirpan, se expanden, se reinyectan para confirmar su fenotipo y, finalmente, se analizan mediante secuenciación de alto rendimiento.

Descubrimiento de reguladores metastásicos utilizando un modelo de membrana corioalantoica intravital de pollitos rápido y cuantitativo

El melanoma es una enfermedad muy agresiva que se propaga rápidamente a otros órganos. Este protocolo describe la aplicación de imágenes de ultrasonido de frecuencia ultra alta, junto con la representación 3D, para monitorear el volumen de los ganglios linfáticos inguinales en el modelo de ratón Braf / Pten de melanoma metastásico.

Análisis del volumen de los ganglios linfáticos mediante imágenes de ultrasonido de frecuencia ultra alta en el modelo de melanoma de ratón genéticamente modificado braf/pten

Aquí, presentamos un protocolo para generar organoides derivados de pacientes con melanoma mediante el cultivo de suspensiones celulares disociadas de tejidos frescos de melanoma. Estos organoides recapitulan fielmente los tumores específicos del paciente in vitro, lo que ofrece un enfoque innovador para explorar los mecanismos inmunosupresores de tumores, la detección de fármacos, los mecanismos de resistencia a los medicamentos y los enfoques de vigilancia del cáncer.

Presentación de oportunidades terapéuticas con modelos de organoides derivados de pacientes con melanoma

Aprenda a evaluar reguladores candidatos de metástasis de melanoma mediante modelos in vivo estandarizados. Este flujo de trabajo robusto mejora la reproducibilidad y facilita el descubrimiento de dianas terapéuticas en oncología.

Una plataforma de descubrimiento robusta para la identificación de nuevos mediadores de la metástasis del melanoma

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