Name: Análisis de la diferenciación celular, la morfogénesis y el patrón durante la embriogénesis del pollo utilizando el ensayo de cuentas empapadas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Aprende el ensayo de cuentas empapadas para estudiar diferenciación celular y morfogénesis en embriones de pollo. Este protocolo versátil permite entregar reactivos específicos y es aplicable a diversos modelos animales.

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Este trabajo fue apoyado por la Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [números de subvención IN211117 e IN213314] y el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [número de subvención 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] otorgado a JC-M. JC M-L recibió una beca postdoctoral del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887). Los autores agradecen la ayuda del Lic. Lucía Brito del Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM en la preparación de referencias de este manuscrito.

Esta investigación fue revisada y aprobada por la Junta de Revisión Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Ciudad de México, México).
1. Incubación de óvulos y estadificación embrionaria
NOTA: Los huevos de gallina fertilizados se pueden obtener de granjas locales. Los huevos de gallina fertilizados de White Leghorn son los más utilizados. Guarde los huevos de gallina recién fertilizados a 15 °C durante un máximo de 1 semana antes de la incubación.
<ol><li>Incubar los huevos de gallina fertilizados verticalmente con el lado puntiagudo hacia abajo en una incubadora humidificada a 38 °C y 70% de humedad relativa hasta que alcancen la etapa de 28 HH (aproximadamente 5,5 días según Hamilton y Hamburger, 1951)22. Gire los huevos durante la incubación para evitar que el embrión se adhiera a la membrana de la cáscara. NOTA: La elección de la etapa de desarrollo se basa en los objetivos experimentales. En este caso, la etapa de 28 HH es óptima para la implantación de perlas interdigit para inducir un dedo ectópico o promover la muerte celular.</li>
	<li>Retire los huevos de la incubadora, rocíelos con etanol al 70% y déjelos secar al aire. Desinfecte el área de trabajo, los microscopios y los instrumentos con etanol al 70%.</li>
	<li>Vela el huevo para identificar los vasos sanguíneos y localizar el embrión. Deseche los óvulos que no tengan un embrión.</li>
	<li>Usando el extremo de pinzas sin dientes, abra una ventana en alrededor de cinco huevos golpeando el extremo romo de un huevo y retire una sección de 1 cm2 de la cáscara con las pinzas.</li>
	<li>Transfiera el huevo a un cartón o soporte de plástico y colóquelo debajo del estereomicroscopio. Retire la membrana de aire perforándola y sacándola con fórceps quirúrgicos finos. Retire cualquier pequeño trozo de cáscara de huevo que pueda entrar en contacto con el embrión. NOTA: La membrana de aire es la membrana blanca y opaca observada inmediatamente después de la ventana del huevo.</li>
	<li>Observe bajo el microscopio mientras abre ligeramente el saco amniótico, rasgándolo con las finas pinzas quirúrgicas. Tenga cuidado de no dañar la vasculatura de la membrana corioalantoica. NOTA: El amnios es la membrana transparente que rodea estrechamente el embrión que lo encapsula en líquido amniótico.</li>
	<li>Estadifica los embriones in ovo para determinar si están en la etapa deseada. Los embriones en etapas anteriores se pueden devolver a la incubadora después de sellar la ventana de la cáscara del huevo con cinta adhesiva.</li>
</ol>2. Preparación de cuentas
NOTA: Dependiendo del objetivo experimental y el tratamiento en cuestión, los tipos alternativos de perlas (por ejemplo, Affi-Gel, AG1-X2, heparina) pueden ser más adecuados. Las perlas de Affi-Gel son óptimas para las proteínas (por ejemplo, TGF-ß1), mientras que las perlas de heparina son ideales para los factores de crecimiento (por ejemplo, FGF, WNT) y las perlas AG1-X2 para productos químicos solubilizados en disolventes orgánicos (por ejemplo, DMSO).
<ol><li>Preparación de perlas de Affi-Gel y heparina<ol>
<li>Corta un cuadrado de parafilm para que quepa una placa de Petri de 45 mm. Coloque la parapelícula en la parte inferior de la placa de Petri para cubrirla y fíjela al fondo de la placa de Petri empujando cada vértice usando el extremo de pinzas no dentadas. Reservar.</li>
		<li>Usando una pipeta o espátula, transfiera las perlas a un tubo de microcentrífuga y lávelas dos veces en 1x PBS sedimentando y pipeteando.</li>
		<li>Transfiera ~ 40-50 cuentas con una micropipeta al centro de la placa de Petri parafilmada desde el paso 1.</li>
		<li>Usando el microscopio, seleccione ~ 30 cuentas de Affi-Gel o heparina ~ 100 μm de diámetro para su uso. Use una retícula ocular de microscopio para dimensionar las cuentas o use el tercer interdigit de un embrión HH 28 como referencia; la cuenta debe ser más pequeña que el interdigit.</li>
		<li>Retire cuidadosamente la mayor cantidad posible del exceso de PBS que rodea las perlas y sumérjalas en 2-5 μL de la solución de tratamiento. Asegúrese de que la solución cubra completamente las cuentas.</li>
		<li>En paralelo, prepare las perlas de control remojando en una solución que contenga la misma cantidad de vehículo que se utiliza en la solución de tratamiento experimental. NOTA: Las concentraciones deben calcularse para cada tratamiento de acuerdo con el experimento. Utilice el equipo de protección personal adecuado cuando manipule reactivos potencialmente dañinos.</li>
		<li>Incubar las perlas en la solución durante 30 min a temperatura ambiente. Para evitar que las perlas se sequen durante la incubación, pipetee unas gotas de 1x PBS o agua alrededor de las perlas para humidificar la atmósfera local y cubra el plato con parafilm para retardar la evaporación.</li>
		<li>Coloque la placa de Petri sobre hielo e implante las cuentas dentro del mismo día.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de perlas AG 1-X2<ol>
<li>Corta un cuadrado de parafilm para que quepa una placa de Petri de 45 mm. Cubra la parte inferior de la placa de Petri con parafilm y fije empujando cada vértice usando el extremo de pinzas no dentadas. Reservar.</li>
		<li>Use una espátula para transferir las perlas AG 1-X2 a un tubo de microcentrífuga. Añadir 30-50 μL de la solución de tratamiento a la concentración final deseada.</li>
		<li>En paralelo, incubar las perlas de control en una solución con el vehículo solo, preparado sin el químico experimental o la proteína de interés.</li>
		<li>Incubar las perlas durante 20 minutos mientras se agitan lentamente a temperatura ambiente. Envolver los tubos de la microcentrífuga con papel de aluminio para protegerlos de la luz durante toda la incubación, dado que muchas de estas moléculas son sensibles a la luz.</li>
		<li>Retire la mayor cantidad posible de la solución con una pipeta y manche con rojo fenol al 2% disuelto en agua a temperatura ambiente durante 2 min con agitación suave en un vórtice. NOTA: Teñir las perlas transparentes AG 1-X2 facilita su implantación en el embrión.</li>
		<li>Retire el rojo fenol al 2% y lave las perlas dos veces en 1x PBS para eliminar cualquier exceso de tinte.</li>
		<li>Con una punta de micropipeta, transfiera ~ 40-50 cuentas AG 1-X2 al centro de la placa de Petri cubierta de parapelícula preparada en el paso 1 y sumérjalas en 5 μL de 1x PBS. Bajo el microscopio, seleccione alrededor de 30 cuentas que tengan un tamaño de ~ 100 μm de diámetro. Deseche las cuentas no utilizadas.</li>
		<li>Las cuentas están listas para implantarse. Asegúrese de que las perlas estén sumergidas en el PBS durante toda la implantación mediante el pipeteo de unas gotas de 1x PBS o agua alrededor de las perlas para humidificar la atmósfera local y / o cubrir el plato con parafilm para retardar la evaporación.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Manipulación embrionaria e implantación interdigit
<ol><li>Antes de manipular los embriones, coloque dos estereomicroscopios uno al lado del otro en una mesa de trabajo. Uno es para la manipulación de embriones y la implantación de perlas, y el otro es para mantener las cuentas tratadas listas para implantar en el embrión.</li>
	<li>Usando fórceps no dentados, cree una ventana en los huevos restantes como se describe en la sección de incubación de huevos y estadificación de embriones.</li>
	<li>Bajo el microscopio, abra el saco amniótico rasgando la membrana amniótica con fórceps quirúrgicos finos cerca de la extremidad posterior derecha solo por la cantidad necesaria para realizar el procedimiento (es decir, lo menos posible).</li>
	<li>Usando fórceps finos, sostenga el embrión por la membrana amniótica para exponer la extremidad posterior derecha. Usando una aguja de tungsteno fina, haga un agujero centrado en la parte distal del tercer interdigito de la extremidad posterior.</li>
	<li>Sin liberar el embrión y la extremidad posterior expuesta, tome una cuenta tratada del otro microscopio usando una de las puntas de las pinzas. Los fórceps deben estar en la posición abierta para que una cuenta se adhiera a la punta de los fórceps.</li>
	<li>Transfiera la cuenta al embrión de pollito cerca de la extremidad posterior y colóquela en la parte superior del orificio intermedio.</li>
	<li>Cierre las pinzas para aplicar presión a la cuenta hasta que entre en el orificio.</li>
	<li>Suelte el embrión y selle la ventana de la cáscara del huevo con cinta adhesiva.</li>
	<li>Devuelva los huevos a la incubadora hasta que hayan alcanzado la etapa requerida. Repita el procedimiento hasta que se alcance el número requerido de embriones manipulados. Es imperativo asegurarse de que las cuentas no se sequen en ningún momento. NOTA: Para observar un dedo ectópico completo, incube durante ~ 72 h después de la implantación de la perla. En contraste, los genes de diferenciación temprana (por ejemplo, Sox9) se expresan ~ 30 minutos después de la implantación de una cuenta empapada de TGF-ß1.</li>
</ol>

<ol><li>Stapornwongkul, K. S., Vincent, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+extracellular+morphogen+gradients%3A+the+case+for+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Generation of extracellular morphogen gradients: the case for diffusion.</a> Nature Reviews Genetics. 22 (6), 393-411 (2021).</li>
<li>Rogers, K. W., Schier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogen+gradients%3A+from+generation+to+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Morphogen gradients: from generation to interpretation.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 377-407 (2011).</li>
<li>Irizarry, J., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+patterning+by+morphogens+illuminated+by+cis-regulatory+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dynamic patterning by morphogens illuminated by cis-regulatory studies.</a> Development. 148 (2), 196113(2021).</li>
<li>Capek, D., Müller, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+information+and+tissue+scaling+during+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Positional information and tissue scaling during development and regeneration.</a> Development. 146 (24), (2019).</li>
<li>Marín-Llera, J. C., Garciadiego-Cázares, D., Chimal-Monroy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+cellular+and+molecular+mechanisms+that+control+early+cell+fate+decisions+during+appendicular+skeletogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Understanding the cellular and molecular mechanisms that control early cell fate decisions during appendicular skeletogenesis.</a> Frontiers in Genetics. 10, 977(2019).</li>
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<li>Abu-Elmagd, M., Goljanek Whysall, K., Wheeler, G., Münsterberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sprouty2+mediated+tuning+of+signalling+is+essential+for+somite+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Genomics%22%5BJournal%5D)">Sprouty2 mediated tuning of signalling is essential for somite myogenesis.</a> BMC Medical Genomics. 8, Suppl 1 8(2015).</li>
<li>Gañan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+TGF+beta+s+and+BMPs+as+signals+controlling+the+position+of+the+digits+and+the+areas+of+interdigital+cell+death+in+the+developing+chick+limb+autopod%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod.</a> Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).</li>
<li>Merino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+digits+in+the+avian+limb+is+controlled+by+FGFs%2C+TGFbetas%2C+and+noggin+through+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of digits in the avian limb is controlled by FGFs, TGFbetas, and noggin through BMP signaling.</a> Developmental Biology. 200 (1), 35-45 (1998).</li>
<li>Montero, J. A., Lorda-Diez, C. I., Gañan, Y., Macias, D., Hurle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin%2FTGFbeta+and+BMP+crosstalk+determines+digit+chondrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Activin/TGFbeta and BMP crosstalk determines digit chondrogenesis.</a> Developmental Biology. 321 (2), 343-356 (2008).</li>
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<li>Díaz-Hernández, M. E., Rios-Flores, A. J., Abarca-Buis, R. F., Bustamante, M., Chimal-Monroy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+interdigital+cell+death+and+cell+differentiation+by+retinoic+acid+during+digit+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular control of interdigital cell death and cell differentiation by retinoic acid during digit development.</a> Journal of Developmental Biology. 2 (2), 138-157 (2014).</li>
<li>Chimal-Monroy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+molecular+cascade+responsible+for+mesodermal+limb+chondrogenesis%3A+Sox+genes+and+BMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the molecular cascade responsible for mesodermal limb chondrogenesis: Sox genes and BMP signaling.</a> Developmental Biology. 257 (2), 292-301 (2003).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La principal ventaja de la herramienta experimental detallada en este protocolo es poder controlar el tiempo y la ubicación de la exposición a las perlas empapadas en una molécula experimental determinada. La combinación del posicionamiento correcto con un tiempo de desarrollo preciso proporciona enormes posibilidades para estudiar los procesos de diferenciación celular. La realización de estos experimentos en tejido indiferenciado permite investigar los primeros eventos cruciales en el linaje celular. Por ejemplo, la co...

Los avances en los mecanismos moleculares que controlan la expresión génica durante el desarrollo embrionario nos han permitido comprender cómo se determina el destino celular. El compromiso con diferentes linajes celulares ocurre una vez que las células comienzan la expresión molecular de los factores de transcripción1. Este patrón de expresión está altamente coordinado en el espacio y el tiempo y, por lo tanto, dirige la formación, el posicionamiento y el patrón de células, tejidos y órganos 1,2,3,4,5. La inducción embrionaria es el proceso por el cual las células se comprometen con linajes específicos estableciendo jerarquías que restringen la potencialidad de las células, que incluso incluyen la generación del plan corporal básico como ocurre con el organizador de Spemann 6,7. El labio dorsal blastoporo induce un segundo eje embrionario en un embrión huésped 8,9. Hoy en día, con la ayuda del injerto y otros experimentos clásicos combinados con enfoques moleculares, se sabe que diferentes factores de transcripción y factores de crecimiento funcionan para dirigir la inducción embrionaria en el organizador de Spemann10. Por lo tanto, la manipulación experimental es una herramienta importante para comprender la diferenciación celular, la morfogénesis y los procesos de modelado durante la embriogénesis.
Curiosamente, en los sistemas embrionarios donde el trasplante de tejidos es difícil o cuando los inductores ya son bien conocidos, los portadores se utilizan para entregar moléculas (por ejemplo, proteínas, productos químicos, toxinas, etc.) para regular la diferenciación celular, la morfogénesis e incluso los patrones. Uno de estos sistemas portadores consiste en implantar perlas empapadas en una molécula específica en cualquier organismo modelo experimental en cualquier punto de tiempo de desarrollo para determinar el efecto de dicho reactivo o dirigir la diferenciación de dicho modelo. Por ejemplo, al implantar perlas empapadas en ácido retinoico (AR) en el brote de la extremidad del ala de pollo, Cheryl Tickle et al. (1985) demostraron que la AR induce la expresión del erizo sónico en la zona de actividad polarizante (ZPA)11,12. La misma estrategia experimental se utilizó para descubrir que la AR controla la asimetría de los somitas y la muerte celular en el brote de la extremidad durante el desarrollo de los dedos y en otras regiones embrionarias de las extremidades 13,14,15. Otros factores, principalmente proteínas (por ejemplo, factores de crecimiento de fibroblastos [FGF], factor de crecimiento transformante beta [TGF-ß]) se han utilizado para inducir extremidades en los flancos de embriones tempranos y nuevos dígitos en la región interdigital, respectivamente 16,17,18,19,20,21 . Estos experimentos evidencian el poder y la utilidad de esta técnica para determinar la etapa de compromiso o competencia de tejidos o grupos de células expuestas a las moléculas.
En este protocolo, la extremidad del pollito en la etapa de formación de dedos sirvió como modelo experimental para presentar paso a paso cómo preparar e implantar las cuentas empapadas. Sin embargo, esta herramienta experimental no se limita a esta aplicación, sino que puede ser explotada en cualquier modelo animal experimental y cualquier punto de tiempo in vitro e in vivo para estudiar la inducción, la diferenciación, la muerte celular y el modelado.

<table><tbody><tr><td>Affi-Gel Cuentas de gel azul</td><td>Bio-Rad</td><td>153-7302</td><td></td></tr><tr><td>Cuentas AG1-X2</td><td>Bio-Rad</td><td>1400123</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de huevos</td><td>Incumatic de México</td><td>Incumatic 1000</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas quirúrgicas finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>9115-10</td><td></td></tr><tr><td>Heparina Perlas de Sepharose</td><td>Abcam</td><td>ab193268</td><td></td></tr><tr>Nido de<td>placa de Petri</td><td></td><td></td><td></td>705001</tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Zeiss</td><td>Stemi DV4</td><td></td></tr><tr><td>Cinta</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de tungsteno</td><td>GoodFellow</td><td>E74-15096/01</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de la diferenciación celular, la morfogénesis y el patrón durante la embriogénesis del pollo utilizando el ensayo de cuentas empapadas

Analysis of Cell Differentiation, Morphogenesis, and Patterning During Chicken Embryogenesis Using the Soaked-Bead Assay

Una multitud de programas genéticos se activan durante el desarrollo embrionario que orquesta la diferenciación celular para generar una asombrosa diversidad de células, tejidos y órganos somáticos. La activación precisa de estos programas genéticos está regulada por morfógenos, moléculas difusibles que dirigen el destino celular a diferentes umbrales. Comprender cómo la activación genética coordina la morfogénesis requiere el estudio de las interacciones locales desencadenadas por los morfógenos durante el desarrollo. El uso de perlas empapadas en proteínas o fármacos implantados en distintas regiones del embrión permite estudiar el papel de moléculas específicas en el establecimiento de dedos y otros procesos de desarrollo. Esta técnica experimental proporciona información sobre el control de la inducción celular, el destino celular y la formación de patrones. Por lo tanto, este ensayo de cuentas empapadas es una herramienta experimental extremadamente poderosa y valiosa aplicable a otros modelos embrionarios.

Uso de perlas empapadas para evaluar el comportamiento celular en la extremidad embrionaria del pollito Para asegurar la eficacia de este ensayo, la cuenta debe colocarse de manera consistente y precisa en la ubicación correcta; en este caso, la mayor parte distal del tercer interdigit debajo de la cresta ectodérmica apical AER (Figura 1A). Este posicionamiento permite que la molécula en cuestión se propague por igual por todo el tejido interdigital. Además, la zona debaj...

El ensayo de perla empapada implica la entrega dirigida de reactivo de prueba en cualquier punto de tiempo de desarrollo para estudiar la regulación de la diferenciación celular y la morfogénesis. Se presenta un protocolo detallado, aplicable a cualquier modelo animal experimental, para preparar tres tipos diferentes de perlas remojadas e implantarlas en el interdigito de un embrión de pollo.

Análisis de la diferenciación celular, la morfogénesis y el patrón durante la embriogénesis del pollo utilizando el ensayo de cuentas empapadas

A multitude of genetic programs is activated during embryonic development that orchestrates cell differentiation to generate an astounding diversity of ...

Este ensayo permite al estudiante buscar moléculas específicas en muchos procesos de desarrollo, como la diferenciación celular y la morfogénesis mediante la implantación de las perlas en distintas regiones embrionarias. Este protocolo se puede aplicar a cualquier modelo animal experimental, cultivo celular, modelo organotípico, incluidos los organoides. Además, es una herramienta educativa útil para enseñar biología básica del desarrollo a los estudiantes.Demostrando el procedimiento estará Alexandra Gonzales-Gonzales, una estudiante de pregrado del laboratorio. Para comenzar, incuba los huevos de gallina Leghorn blancos fertilizados verticalmente con el lado puntiagudo hacia abajo en una incubadora humidificada a 38 grados centígrados y 70% de humedad relativa. Una vez que lleguen a la etapa 28, según Hamburger y Hamilton, retire los huevos de la incubadora, cámbielos con etanol al 70% y déjelos secar al aire.Luego desinfecte el área de trabajo, microscopios e instrumentos con etanol al 70%. A continuación, incline los huevos para identificar los vasos sanguíneos y localizar el embrión. Deseche los óvulos que no tengan un embrión.Usando el extremo de pinzas no dentadas, abra una ventana tocando el extremo romo de un huevo y retire una sección de cáscara de un centímetro cuadrado. Luego, transfiera el huevo a un cartón o soporte de plástico y colóquelo debajo del microscopio estereoscópico. Usando fórceps quirúrgicos finos, retire cualquier pequeño trozo de cáscara de huevo que pueda entrar en contacto con el embrión y elimine la membrana de aire perforándola y sacándola.A continuación, utilizando pinzas quirúrgicas finas, rasgue ligeramente el saco amniótico, teniendo cuidado de no dañar la vasculatura de la membrana corioalantoica. Estadificar los embriones in-ovo para determinar si están en la etapa deseada. Para la preparación de cuentas de heparina Affi-gel, corte una sección de parafilm de forma cuadrada para que quepa en una placa de Petri de 45 milímetros.Después de colocar la parapelícula en la parte inferior de la placa de Petri, usando el extremo de las pinzas no dentadas, empuje cada vértice y fíjelo al fondo de la placa. A continuación, con una pipeta o espátula, transfiera las perlas a un tubo de micro centrífuga y lávelas dos veces con PBS permitiéndoles asentarse y pipetear el sobrenadante. Luego, usando una micro pipeta, transfiera de 40 a 50 cuentas al centro de la placa de Petri cubierta de parafilm.Bajo un microscopio, seleccione 30 perlas de Affi-gel o heparina que tengan un diámetro de 100 micrómetros. Dimensiona las cuentas usando un tercer interdigit de un embrión de 28 etapas como referencia. La cuenta debe ser más pequeña que el interdigit.Después de eliminar cuidadosamente el exceso de PBS que rodea las perlas seleccionadas, sumérjalas en dos a cinco microlitros de la solución de tratamiento. Incubar las perlas en la solución durante 30 minutos a temperatura ambiente. Durante la incubación, para evitar que las perlas se sequen, pipetee unas gotas de PBS o agua alrededor de las perlas para humidificar la atmósfera local y cubra el plato con parafilm para retardar la evaporación.Vierta la preparación de cuentas AG1X2. Use la espátula para transferir las perlas a un tubo de micro centrífuga y agregue 50 microlitros de la solución de tratamiento a la concentración final deseada. Después de envolver los tubos con papel de aluminio para protegerlos de la luz, incube las cuentas durante 20 minutos con agitación lenta.Después de la incubación, usando una pipeta, retire la mayor cantidad posible de la solución de tratamiento en la mancha con rojo fenol al 0,2% disuelto en agua durante dos minutos con agitación leve en un vórtice. Después de manchar, retire el tinte, luego lave las cuentas dos veces en PBS para eliminar cualquier tinte residual. A continuación, utilizando una punta de micro pipeta, transfiera de 40 a 50 cuentas AG1X2 al centro de la placa de Petri cubierta de paraforma y remoje las cuentas en cinco microlitros de PBS.Luego, bajo un microscopio, seleccione alrededor de 30 cuentas de 100 micrómetros de diámetro de tamaño. Sumerja las perlas seleccionadas en la solución experimental con unas gotas de PBS o agua alrededor de las perlas para humidificar la atmósfera local. Cubra el plato con parafilm para retardar la evaporación.Antes de manipular los embriones, coloque dos microscopios estereoscópicos uno al lado del otro en una mesa de trabajo. Luego, usando fórceps no dentados, cree una ventana en los huevos restantes. A continuación, bajo el microscopio, desgarre la membrana amniótica cerca de la extremidad posterior derecha con fórceps quirúrgicos finos.Usando fórceps finos, sostenga el embrión por la membrana amniótica para exponer la extremidad posterior derecha. Luego, usando una aguja fina de tungsteno, haga un agujero centrado en el distal más alejado del tercer interdigit de la extremidad posterior. Sin liberar el embrión y la extremidad posterior expuesta, tome una cuenta tratada del otro microscopio usando una de las puntas de los fórceps.Las pinzas deben estar abiertas para que una cuenta se adhiera a su punta. Transfiera la cuenta al embrión de pollito cerca de la extremidad posterior, colocándola en la parte superior del orificio intermedio. aplicar presión sobre la cuenta cerrando las pinzas hasta que entre en el orificio.Luego suelte el embrión, selle la ventana de la cáscara del huevo con cinta adhesiva y devuelva los huevos a la incubadora hasta que hayan alcanzado la etapa requerida. Para garantizar la eficacia del ensayo, la cuenta debe colocarse de manera consistente y precisa en la ubicación correcta. En este estudio, la cuenta empapada se colocó en el distal más alejado del tercer interdigit debajo de la cresta ectodérmica apical.Los embriones se pueden teñir con azul océano y rojo alizarina para evidenciar la formación de elementos esqueléticos y evaluar los efectos sobre la diferenciación celular. Este ensayo también es adecuado para evaluar la muerte celular con rojo neutro y la regulación génica, comprando hibridación C2. La principal ventaja de esta herramienta experimental es controlar el tiempo y la ubicación de las cuentas empapadas.La combinación del posicionamiento central con el tiempo preciso del desarrollo proporciona enormes posibilidades para estudiar los procesos de diferenciación celular.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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Un filtro de papel sumergido Sandwich para el largo plazo Ex Ovo Time-lapse de pollo temprano embriones

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Aprende el ensayo de cuentas empapadas para estudiar diferenciación celular y morfogénesis en embriones de pollo. Este protocolo versátil permite entregar reactivos específicos y es aplicable a diversos modelos animales.

Análisis de la diferenciación celular, la morfogénesis y el patrón durante la embriogénesis del pollo utilizando el ensayo de cuentas empapadas (Video) | JoVE Journal

Análisis de la diferenciación celular, la morfogénesis y el patrón durante la embriogénesis del pollo utilizando el ensayo de cuentas empapadas

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