Name: Investigación del metabolismo cardíaco en el corazón de ratón perfundido aislado con piruvato hiperpolarizado 1-13C y espectroscopia de RMN 13C / 31P (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Aprende a evaluar el metabolismo cardíaco en tiempo real usando corazón de ratón perfundido con piruvato hiperpolarizado [1-13C] y espectroscopía de RMN 13C/31P. Este protocolo permite cuantificar la actividad de LDH y PDH.

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Este proyecto recibió financiación de la Fundación Científica de Israel en virtud del acuerdo de subvención Nº 1379/18; la Beca Jabotinsky del Ministerio de Ciencia y Tecnología de Israel para Ciencias Aplicadas y de Ingeniería para estudiantes de doctorado directos No. 3-15892 para D.S.; y el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención No. 858149 (AlternativesToGd).

El comité conjunto de ética (IACUC) de la Universidad Hebrea y el Centro Médico Hadassah aprobaron el protocolo de estudio para el bienestar animal (MD-19-15827-1).
1. Preparación del tampón Krebs-Henseleit
<ol><li>Un día antes del experimento, prepare una versión modificada del tampón de Krebs-Henseleit (KHB)26. Inicialmente, disolver 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,5 mM piruvato, 1,2 mMMgSO4, 25 mM NaHCO3 y 1,2 mM KH 2 PO4 en H2O de doble destilación.</li>
	<li>Burbujear esta mezcla con 95%/5%O2/CO 2 durante 20 min, y luego añadir 1,2 mM CaCl2.</li>
	<li>Ajuste el pH del tampón a 7,4 con HCl o NaOH.</li>
	<li>El día del experimento, añadir 10 mM de glucosa y 72 U/L de insulina al KHB preparado en el paso 1.2. NOTA: La insulina se añade al tampón de perfusión como se describe en el trabajo de Kolwicz et al.26 y de acuerdo con estudios previos que informan que la insulina aumenta la función contráctil27 y la intensidad de la señal hiperpolarizada [13C]bicarbonato28.</li>
</ol>2. Preparación del sistema de perfusión
<ol><li>Mantener un depósito de 200 ml de KHB en un baño maría a 40 °C, y burbujear con 95%/5% deO2/CO2 a un caudal de 4 L/min durante 1 h antes de la perfusión cardíaca. Mantenga el tampón burbujeando continuamente con esta mezcla de gases durante todo el experimento.<ol><li>Primero, ajuste el baño maría a 40 ° C. Inserte el depósito KHB. Utilice una bomba peristáltica (consulte la Tabla de materiales) y tubos de extensión de grado médico para recircular el KHB entre el depósito intermedio y el tubo de RMN de 10 mm a un caudal constante de 7,5 ml/min.</li>
		<li>Conecte tres tubos de silicona curados con platino (3 mm i.d.) a la bomba (un tubo de entrada y dos tubos de salida para el tampón KH). Inserte las líneas de salida y entrada en el tampón KH calentado. Luego, inserte la línea de oxígeno en el tampón KH calentado.</li>
		<li>Use líneas delgadas de cetona de éter de poliéter (PEEK, consulte la Tabla de materiales) para que el tampón y el agente hiperpolarizado fluyan hacia y desde el tubo de RMN dentro del orificio del espectrómetro.</li>
	</ol></li>
	<li>Asegúrese de que la temperatura se mantiene a 37-37.5 ° C. Siga los pasos a continuación.</li>
	<li>Envuelva la línea de entrada (desde el depósito intermedio hasta el tubo de RMN) con una cinta calefactora ajustada a 42 °C.</li>
	<li>Caliente el tubo de RMN dentro del espectrómetro con un flujo de aire caliente regulado por el espectrómetro.</li>
	<li>Utilice un sensor de temperatura compatible con RMN (consulte la Tabla de materiales) para medir la temperatura dentro del tubo de RMN. La temperatura se ajusta a 37-37.5 °C.</li>
</ol>3. Calibración y preparación del espectrómetro de RMN para su adquisición
<ol><li>El día del experimento, inserte una muestra estándar de 13 C que contenga 1,4-dioxano (Tabla de materiales) en el espectrómetro, y ajuste y haga coincidir la sonda de RMN para 13C. Luego, obtenga un espectro que muestre la señal de equilibrio térmico de 1,4-dioxano con un ángulo de nutación de 90 °.</li>
	<li>Ahora intercambie la muestra estándar de 13C con una muestra estándar de 31 P (Tabla de materiales), que contiene 105 mM de ATP en D2O. Sintoniza y combina la sonda de RMN para 31P. NOTA: Se obtiene un espectro que muestra las señales de fosfato de equilibrio térmico con un ángulo de nutación de 50°.</li>
	<li>Inserte la línea de entrada, la línea de salida y la sonda de temperatura en un tubo de RMN de 10 mm y, a continuación, inserte el tubo en el orificio magnético. Ajuste la cinta calefactora a 42 °C.</li>
	<li>Adquirir un espectro de RMN 31Pdel tampón KH circulante para ser utilizado en ese experimento durante 30 min, con un ángulo de nutación de 50° y un TR de 1,1 s (1.640 adquisiciones).</li>
</ol>4. Preparación animal, procedimiento quirúrgico y perfusión del corazón en el tubo de RMN
<ol><li>Anestesiar a un ratón macho HSD:ICR (CD-1) con isoflurano al 3,3% en el aire ambiente (Tabla de materiales) a 340 mL/min durante 5 min utilizando un sistema de anestesia con gas (Tabla de materiales) en una cámara de inducción.</li>
	<li>Utilizar anestesia nasal para el mantenimiento de la anestesia general con isoflurano al 2,9%. NOTA: Se tiene cuidado para minimizar el dolor y la incomodidad del animal.</li>
	<li>Asegure las extremidades del animal con cinta adhesiva, asegure un reflejo negativo del dolor del pedal y luego inyecte 300 UI de heparina de sodio por vía intraperitoneal.</li>
	<li>Moje bien la pared torácica y el abdomen del ratón con alcohol al 70% para garantizar la limpieza y evitar la contaminación u obstrucción del cabello durante el procedimiento quirúrgico.</li>
	<li>A 1 minuto después de la inyección de heparina, corte la piel y el músculo de la cavidad abdominal con tijeras pequeñas.</li>
	<li>Coloque la pequeña pinza antimosquitos con bloqueo hemostático de mandíbula curva entre el proceso xifoide y la piel del pecho para levantar el pecho y exponer el diafragma. Pinchar y cortar el lóbulo derecho del diafragma.</li>
	<li>Corte el pecho a través de la línea media, retraiga hacia los lados y luego retírelo.</li>
	<li>Inyecte el ventrículo izquierdo del corazón con 200 UI de heparina sódica para prevenir la coagulación de la sangre. Luego, inyecte 0.1 mL de 0.5 mol / L KCl helado para lograr un paro cardíaco, como se describió anteriormente25. El paro cardíaco es esencial para poder canular el corazón.</li>
	<li>Identifique el timo y retírelo con tijeras para exponer la aorta. Retire el tejido residual de la caja torácica.</li>
	<li>Identifique el arco aórtico y use pinzas curvas para colocar un nudo suelto con una sutura de seda 3-0 (Tabla de materiales) alrededor de la aorta ascendente. Inyecte 3 ml de KHB en el ventrículo izquierdo para eliminar los coágulos de sangre de la aorta.</li>
	<li>Use fórceps curvos para retraer el corazón hacia abajo para una mejor visualización de la aorta ascendente.</li>
	<li>Realizar la canulación in situ con un catéter intravenoso de 22 G (Tabla de Materiales). Aplique adhesivo de cianoacrilato en la región canulada y luego realice el atado de doble sutura. Inyecte tampón KH adicional en el corazón y verifique que fluya a través del tubo de canulación .</li>
	<li>Retire las pinzas curvas. Desconecte el corazón de las vísceras circundantes y perfundirlo retrógradamente con KHB helada (4 °C) a través del catéter intravenoso.</li>
	<li>Conecte el corazón a la línea de entrada del sistema de perfusión a través del catéter intravenoso. Al iniciar la perfusión con tampón caliente (37-37,5 °C) a 7,5 ml/min, el corazón comienza a latir espontáneamente.</li>
	<li>Fije el tubo de RMN con el corazón latiendo, las líneas de salida y la sonda de temperatura, e insértelo en el orificio del espectrómetro, asegurándose de que el corazón esté en el centro de la sonda de RMN.</li>
</ol>5. Adquisición de datos para la energética cardíaca y el pH
<ol><li>Adquirir espectros de 31P durante aproximadamente 1 h con un ángulo de giro de 50° y un TR de 1.1 s.</li>
</ol>6. Polarización y disolución del espín DNP
<ol><li>Preparar una formulación de 28,5 mg de [1-13C]piruvato. Esta formulación consiste en 11.1 mM a 14.0 mM OX063 radical en el ácido puro.</li>
	<li>Preparar 4 mL de medio de disolución. El medio de disolución consiste en tampón TRIS-fosfato, que contiene 11,2 mM NaH 2 PO 4, 38,8 mMNa2HPO4, 33 mM TRIS y2mM HCl. Esta composición del medio se ajusta de tal manera que tras la adición de 28,5 mg de [1-13C]formulación de ácido pirúvico a 4 ml de este tampón (en la fase de disolución), el pH de la solución resultante será 7,4.</li>
	<li>Realice la polarización de espín y la disolución rápida en un dispositivo de polarización de espín de disolución-DNP (dDNP) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Tabla de materiales). Aplicar irradiación de microondas a una frecuencia de 94,110 GHz para la polarización de la formulación de ácido pirúvico [1-13C]a 1,45 K a 1,55 K durante aproximadamente 1,5 h.</li>
	<li>Mezcle rápidamente los 4 ml de medio hiperpolarizado del dispositivo dDNP con una solución bien oxigenada que complemente el medio de disolución hiperpolarizado para obtener una composición que coincida estrechamente con el medio de perfusión. NOTA: El volumen final del medio que perfunde el corazón durante las inyecciones hiperpolarizadas con piruvato hiperpolarizado de 14 mM es de 26 ml. La composición final del medio inyectado (después de la mezcla) contiene 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 70 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 1,2 mM KH 2 PO4, 10 mM glucosa, 1,2 mM CaCl2y 72 U/L insulina.</li>
	<li>Administrar el medio hiperpolarizado que contiene piruvato [1-13C] al corazón aislado utilizando una configuración de flujo continuo29. NOTA: Esto se hace para asegurar que la perfusión del corazón no se altere en ningún momento durante el experimento y que el medio hiperpolarizado se administre a una velocidad conocida y durante un período conocido.</li>
</ol>7. Espectroscopía hiperpolarizada de 13C
<ol><li>Adquirir datos hiperpolarizados de 13 C utilizando pulsos de excitación de saturación selectiva del producto 15 aplicando pulsos de seno cardinal (Sinc) de 2,5 ms, como se describió anteriormente15,16. Excitar selectivamente [1-13 C]lactato y [13C]bicarbonato consecutivamente a intervalos de 6 s para obtener un intervalo de 12s para cada metabolito.</li>
	<li>Para la detección de [1-13 C]lactato, centre el pulso selectivo de Sinc en la frecuencia de hidrato de piruvato [1-13 C](179.4 ppm), lo que da como resultado una relación de intensidad de señal (lac) de 0.113 para las señales C 1 de [1-13 C]piruvato a [1-13C]lactato.</li>
	<li>Para la detección de [13 C]bicarbonato, centre el pulso selectivo Sinc a 157,7 ppm, que es 214 Hz de campo inferior de la señal de [13C]bicarbonato (161,1 ppm); esto da como resultado una relación de intensidad de señal (bic) de 0,139 para la señal C 1 de [1-13C]piruvato a [13C]bicarbonato.</li>
</ol>8. Determinación del peso y volumen húmedo del tejido
<ol><li>Al final del experimento, separe el corazón del sistema de perfusión y séquelo suavemente con papel de seda. Posteriormente, pesar el corazón para obtener el peso húmedo del tejido.</li>
	<li>Determinar el volumen del corazón utilizando un factor de densidad de 1,05 g/cm3, como se determinó previamente para el corazón del ratón30.</li>
</ol>9. Cuantificación del contenido de ATP
<ol><li>Integrar la señal γ-ATP de una sola adquisición de la muestra estándar de ATP y una adquisición de 30 min (TR de 1,1 s y 1.640 adquisiciones) del corazón aislado.</li>
	<li>Cuantificar el contenido de ATP del corazón comparando la integral de la señal de γ-ATP del corazón con la del estándar (Tabla de materiales), donde este último tiene una concentración conocida (105 mM), y corregir el número de adquisiciones y efectos de relajación.</li>
</ol>10. Resolver la señal Pi del corazón
NOTA: Para evaluar el pH del tejido, primero es necesario desconconvertir la señal Pi del corazón de la señal Pi total (Pit). Esto se hace omitiendo la señal del KHB Pi (PiKH) de la del Pit.
<ol><li>En un espectro de 31P de KHB que muestra una sola señal Pi (PiKH, Figura 1A), ajuste la señal PiKH a una función lorentziana usando Excel (Tabla de materiales).</li>
	<li>El volumen visible para la sonda de RMN (Vp, 1.375 mL), contiene más KHB cuando el tubo de muestra no contiene el corazón. Para corregir este efecto de relleno, calcule la señal de búfer atenuada (Pib) utilizando la Ec. 1A. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq01.jpg" style="margin: auto;">Ec. 1A donde Vh es el volumen del corazón, como se determinó en el paso 8.</li>
	<li>Resta esta señal del Pit de acuerdo con la Ec. 1B para obtener la señal Pi que surge únicamente del corazón perfundido (Pih, Figura 1B). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq02.jpg" style="margin: auto;">Ec. 1B</li>
</ol>11. Análisis de pH multiparamétrico
<ol><li>Realizar la conversión de la distribución del desplazamiento químico de la señal Pih al pH con referencia al desplazamiento químico de PCr utilizando la Ec. 231. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq03.jpg" style="margin: auto;">Ec. 2 donde Δδ es la diferencia de desplazamiento químico, pKa es 6.72, δ base libre es 5.69 y δ ácido libre es 3.27, como se describió anteriormente31.</li>
	<li>Corregir la curva de distribución de pH resultante para la no linealidad entre la escala de desplazamiento químico Pih y la escala de pH según Lutz et al.32. Una distribución típica de pH resultante de este cálculo se presenta en la Figura 1C.</li>
	<li>Analizar la distribución del pH tisular con un enfoque multiparamétrico utilizando siete parámetros estadísticos siguiendo el trabajo de Lutz et al. 32. Cuatro de estos parámetros se presentan aquí, ya que parecen ser los más descriptivos del pH tisular: 1) pH máximo global; 2) pH medio ponderado; 3) pH mediano ponderado; y 4) asimetría de la gráfica de pH (Figura 1C).</li>
</ol>12. Cálculo de las actividades de LDH y PDH
NOTA: Las tasas de producción de los metabolitos hiperpolarizados [1-13 C]lactato y [13C]bicarbonato se utilizan para calcular las actividades de LDH y PDH, respectivamente. En el enfoque de excitación saturante-selectivadel producto 15, sólo los metabolitos hiperpolarizados recién sintetizados son detectados por cada excitación selectiva.
<ol><li>Utilice la señal hiperpolarizada [1-13C]piruvato como referencia para determinar el nivel de producción de metabolitos correspondiente.<ol><li>Durante la perfusión con el medio hiperpolarizado, la concentración de piruvato [1-13 C] en el tubo de RMN aumenta (lavado), luego se estabiliza (a una concentración máxima de 14mM) y luego disminuye (lavado).</li>
		<li>Para identificar los puntos de tiempo en los que la concentración de piruvato alcanzó un nivel constante (meseta), corrija la señal de piruvato [1-13C] para la disminución de la señal resultante de la relajación de T1 y la pulsación de RF utilizando la constante de relajación efectiva, Teff.</li>
		<li>Para cada inyección, defina elT eff en función de su capacidad para corregir la curva de desintegración del piruvato [1-13 C] para mostrar esta dinámica de flujo (Ec.3). <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq04.jpg" style="margin: auto;">Ec. 3 donde <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq05.jpg" style="margin: auto;"> es la señal de [1-13 C]piruvato que se adquirió durante la adquisición de [13C]bicarbonato. Se encontró que el Teff promedio en los experimentos descritos en este documento era de 35.8 s ± 2.3 s (n = 5 corazones).</li>
		<li>Seleccione los puntos de datos en los que la concentración está dentro del 10% de la señal máxima corregida de piruvato [1-13C] para su posterior análisis.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizar los datos correspondientes de la producción de [1-13C]lactato y [13 C]bicarbonato para los puntos temporales seleccionados en la etapa 12.1para el cálculo de las tasas de producción de metabolitos utilizando la Ec. 4A y la Ec. 4B, siempre que la SNR de la señal del metabolito sea mayor que 2 (umbral para el análisis). Un ejemplo típico de tal selección de puntos de tiempo se muestra en la Figura 2B (ventana temporal resaltada).</li>
	<li>Calcule las tasas de producción de cada uno de los puntos de datos seleccionados utilizando la Ec. 4A y la Ec. 4B: <img alt="Equation 17" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq17.jpg" style="margin: auto;">Ec. 4A <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq06.jpg" style="margin: auto;">Ec. 4B donde <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq07.jpg" style="margin: auto;"> y son las tasas de producción de [1-13 C]lactato o [13 C]bicarbonato en cada punto temporal, respectivamente. y son factores que representan la excitación relativa de [1-13 C]piruvato y <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq08.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq10.jpg" style="margin: auto;"> los productos [1-13 C]lactato o [13C]bicarbonato, respectivamente. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq09.jpg" style="margin: auto;"> Estos factores fueron determinados previamente en 0,113 y 0,139, respectivamente29. Vp es el volumen detectado por la sonda de RMN (1.375 mL), TR denota el intervalo de tiempo entre dos excitaciones saturantes selectivas consecutivas del producto (12 s para cada producto), <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq11.jpg" style="margin: auto;"> y son las señales de [1-13 C]lactato y [13 C]bicarbonato, respectivamente, y y <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq14.jpg" style="margin: auto;"> son las señales de [1-13 C]piruvato que se adquirieron durante el [1-13 C]lactato y <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq12.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq13.jpg" style="margin: auto;"> [13 C]excitaciones de bicarbonato, respectivamente. [Pyr] es la concentración de piruvato [1-13 C], que fue de 14mM durante la fase de meseta.<ol><li>Determine la tasa para cada punto y luego el promedio por inyección hiperpolarizada.</li>
	</ol></li>
</ol>

No hay divulgaciones.

Demostramos una configuración experimental que está diseñada para investigar el metabolismo hiperpolarizado del piruvato [1-13C], la energética de los tejidos y el pH en un modelo de corazón de ratón aislado.
Los pasos críticos dentro del protocolo son los siguientes: 1) asegurar que el pH del tampón sea 7.4; 2) garantizar que se incluyan todos los componentes del búfer; 3) evitar la coagulación de la sangre en los vasos cardíacos mediante inyecciones de heparina; 4) evitar el daño ...

Las alteraciones en el metabolismo cardíaco están asociadas con una variedad de miocardiopatías y a menudo forman la base de los mecanismos fisiopatológicos subyacentes1. Sin embargo, existen numerosos obstáculos para estudiar el metabolismo en tejidos vivos, ya que la mayoría de los ensayos bioquímicos requieren la homogeneización de la lisis tisular y celular y / o el trazado radiactivo. Por lo tanto, existe una necesidad apremiante de nuevas herramientas para investigar el metabolismo miocárdico en tejidos vivos. La resonancia magnética (RM) de sustratos hiperpolarizados marcados con 13C permite mediciones en tiempo real del metabolismo en tejidos vivos2, sin el uso de radiación ionizante, al aumentar la relación señal-ruido (SNR) de MR del sitio (s) marcado en varios órdenes de magnitud3. Aquí, describimos una configuración experimental, un enfoque de adquisición y un enfoque analítico para estudiar el metabolismo rápido en el corazón de ratón aislado y, en paralelo, presentamos indicadores de energía y acidez tisular general. El pH cardíaco es un indicador valioso, ya que el equilibrio ácido-base se interrumpe en las primeras etapas de enfermedades cardíacas y afecciones como isquemia miocárdica, hipertrofia desadaptativa e insuficiencia cardíaca6.
La producción hiperpolarizada de [1-13 C]lactato y [13 C]bicarbonato a partir de piruvato hiperpolarizado [1-13C]ayuda a determinar las tasas de producción de lactato deshidrogenasa (LDH) y piruvato deshidrogenasa (PDH). La mayoría de los estudios previos realizados utilizando sustratos hiperpolarizados en el corazón de roedor aislado utilizaron modelos cinéticos complejos para derivar la actividad enzimática de LDH y PDH, o informaron las relaciones de intensidad de señal del producto hiperpolarizado a un sustrato sin calcular las tasas reales de actividad enzimática 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Aquí, utilizamos el enfoque de saturación-excitaciones selectivas del producto 15, que permite el monitoreo de la actividad enzimática de manera libre de modelo15,16. De esta manera, se determinaron las tasas enzimáticas absolutas (es decir, el número de moles de producto producido por unidad de tiempo). 31 La espectroscopia P se utilizó para observar las señales de fosfato inorgánico (Pi), fosfocreatina (PCr) y trifosfato de adenosina (ATP). Se utilizó un análisis multiparamétrico para caracterizar la distribución del pH del corazón, como lo demuestra el cambio químico heterogéneo en la señal Pi del tejido.
El corazón de ratón retrógrado perfundido (corazón de Langendorff)17,18,19 es un modelo ex vivo para el corazón latente intacto. En este modelo, la viabilidad cardíaca y el pH se conservan durante al menos 80 min20, y ha mostrado potencial de recuperación después de una lesión isquémica prolongada21,22. Sin embargo, la variabilidad inadvertida durante la microcirugía puede conducir a la variabilidad en la viabilidad del tejido a través de los corazones. Estudios previos han reportado sobre el deterioro de este corazón a lo largo del tiempo19; Por ejemplo, se ha observado una reducción de la función contráctil del 5%-10% por hora18. La señal de trifosfato de adenosina (ATP) ha demostrado previamente que informa sobre el estado energético miocárdico y la viabilidad23. Aquí, notamos que el corazón perfundido ocasionalmente puede mostrar una variabilidad involuntaria en los niveles de viabilidad, como lo demuestra el contenido de ATP, a pesar del hecho de que tuvimos un suministro ininterrumpido de perfusión y oxígeno. Demostramos aquí que normalizar las tasas de LDH y PDH al contenido de ATP del corazón reduce la variabilidad intercardíaca en estas tasas.
En el siguiente protocolo, describimos el procedimiento quirúrgico utilizado para la canulación cardíaca, el aislamiento y la consiguiente perfusión en el espectrómetro de RMN. Cabe destacar que otros enfoques quirúrgicos dirigidos a aislar y perfundir el corazón del ratón se han descrito antes de24,25.
También se describen las metodologías utilizadas para adquirir datos relacionados con las tasas enzimáticas en el corazón latiendo (utilizando espectroscopia 13 C y piruvato hiperpolarizado [1-13C]) y la viabilidad y acidez del corazón (utilizando espectroscopia de RMN 31P). Finalmente, se explican las metodologías analíticas para determinar las actividades enzimáticas metabólicas y la viabilidad y acidez de los tejidos.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyperSense DNP Polariser</td><td>Oxford Instruments</td><td>52-ZNP91000</td><td>HyperSense, 3.35 T, disolución preclínica-espectrómetro de RMN con hiperpolarizador</td></tr><tr><td>DNP&nbsp;</td><td>Cubo de RMN RS2D</td><td></td><td>, 5,8 T, equipado con una sonda de banda ancha de 10 mm</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica&nbsp;</td><td>Cole-Parmer</td><td>07554-95</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de temperatura</td><td>Osensa</td><td>FTX-100-LUX+</td><td>Sonda de temperatura compatible con RMN</td></tr><tr><td>Sistema de anestesia de bajo flujo Somnosuite</td> Kent <td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lines, tubos, tubos < sutura/strong>Tubos de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>silicona curados con platino</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-96119-16</td><td>L/S 16 D.I. 3,1 mm& nbsp;</td></tr><tr><td>Líneas delgadas de poliéter éter cetona (PEEK)</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>id. 0.040"</td></tr><tr><td>Catéter intravenoso&nbsp;</td><td>BD Medical</td><td>381323</td><td>22 G</td></tr><tr><td>Sutura de seda</td><td>Ethicon</td><td>W577H</td><td>Diámetro del alambre de 3-0</td></tr><tr><td><fuerte>Químicos y farmacéuticos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[1-13C]ácido pirúvico</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-8077-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21074</td><td>CAS: 10043-52-4</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>CAS: 50-99-77</td></tr><tr><td>Heparina sódica</td><td>Rotexmedica</td><td>HEP5A0130C0160</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>CAS: 7647-01-0</td></tr><tr><td>Insulina aspart (NovoLog)</td><td>Novo Nordisk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Terrel Sulfato</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>de MagnesioSigma-Aldrich</td><td>793612</td><td>CAS: 7487-88-9</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td>CAS: 7447-40-7</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>CAS: 7778-77-0</td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Grupo</td><td></td> Gadot <td>CAS: 144-55-8</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td>CAS: 7647-14-5</td></tr><tr><td>Sodio hidróxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>655104</td><td>CAS: 1310-73-2</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>CAS: 7558-79-4</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico dihidratado</td><td>Merck</td><td>6345</td><td>CAS: 13472-35-0</td></tr><tr><td>TRIS (grado biotecnológico)</td><td>Amresco</td><td>0826</td><td>CAS: 77-86-1</td></tr><tr><td>Tritilo radical OX063</td><td>GE Healthcare AS</td><td>NC100136</td><td>OX063</td></tr><tr><td>Muestra estándar > < RMN</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13C</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-72A</td><td>40% p-dioxano en benceno-D6</td></tr><tr><td>31P Muestra estándar</td><td>Made in house</td><td></td><td>105 mM de ATP y 120 mM de ácido fenilfosfónico en D2O</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel 2016</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MNova</td><td>Mestrelab Research</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

investigación del metabolismo cardíaco en el corazón de ratón perfundido aislado con piruvato hiperpolarizado [1-13c] y espectroscopia de rmn 13c / 31p

Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy

El metabolismo es la base de procesos importantes en la vida celular. La caracterización de cómo funcionan las redes metabólicas en los tejidos vivos proporciona información crucial para comprender el mecanismo de las enfermedades y diseñar tratamientos. En este trabajo, describimos procedimientos y metodologías para estudiar la actividad metabólica en la célula en un corazón de ratón retrógradamente perfundido en tiempo real. El corazón se aisló in situ, junto con un paro cardíaco para minimizar la isquemia miocárdica y se perfundió dentro de un espectrómetro de resonancia magnética nuclear (RMN). Mientras estaba en el espectrómetro y bajo perfusión continua, se administró piruvato hiperpolarizado [1-13 C] al corazón, y las posteriores tasas de producción hiperpolarizadas de [1-13 C] lactato y [13C] bicarbonato sirvieron para determinar, en tiempo real, las tasas de producción de lactato deshidrogenasa y piruvato deshidrogenasa. Esta actividad metabólica del piruvato hiperpolarizado [1-13C] se cuantificó con espectroscopia de RMN en un modelo de manera libre utilizando el enfoque de adquisición de excitaciones de saturación selectivas del producto. 31 La espectroscopia P se aplicó entre las adquisiciones hiperpolarizadas para monitorear la energética cardíaca y el pH. Este sistema es excepcionalmente útil para estudiar la actividad metabólica en el corazón sano y enfermo del ratón.

Los espectros 31P registrados desde un corazón de ratón perfundido con KHB y solo desde el tampón se muestran en la Figura 1A. Las señales de α, β y γ-ATP, PCr y Pi se observaron en el corazón. La señal Pi estaba compuesta de dos componentes principales: en el campo más alto (lado izquierdo de la señal), la señal Pi se debía principalmente al KHB a un pH de 7,4; en el campo inferior (lado derecho de la señal), la señal Pi era más amplia y menos homogénea debido al ambiente más áci...

Describimos una configuración experimental para administrar metabolitos hiperpolarizados marcados con 13C en modo de perfusión continua a un corazón de ratón perfundido aislado. Un enfoque dedicado de adquisición de 13C-RMN permitió la cuantificación de la actividad enzimática metabólica en tiempo real, y un análisis multiparamétrico de 31R-P permitió la determinación del contenido de ATP tisular y el pH.

Investigación del metabolismo cardíaco en el corazón de ratón perfundido aislado con piruvato hiperpolarizado [1-13C] y espectroscopia de RMN 13C / 31P

Metabolism is the basis of important processes in cellular life. Characterizing how metabolic networks function in living tissues provides crucial ...

Hi.In este video aprenderá cómo realizar estudios de RM hiperpolarizada del corazón de ratón perfundido. David Shaul, un estudiante de MD / PhD en el laboratorio, lo guiará a través de las diversas técnicas y procedimientos. Hoy aprendemos un protocolo para estudiar el metabolismo hiperpolarizado del piruvato de carbono-13, combinado con la espectroscopia de RMN 31P.El metabolismo del piruvato se encuentra en la encrucijada del metabolismo aeróbico y anaeróbico. Y como tal, es de gran valor para estudiar diversas condiciones del corazón. Entonces, comencemos.El corazón del ratón se aísla y se perfunde con tampón Krebs-Hensleit, dentro de un tubo de RMN de 10 milímetros. Luego se inserta el corazón en el espectrómetro de RMN. Allí, se registra un espectro 31P para observar la energética cardíaca y el pH, mediante la observación de las resonancias de trifosfato de adenosina, fosfocreatina y fosfato inorgánico.Mientras tanto, una muestra de piruvato que está marcada con carbono-13 en la primera posición está hiperpolarizada. Y después de que se produce la disolución, se inyecta en el corazón para permitir la medición de lactato, inorgánicos y piruvato de las actividades organizadas en

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Biología

Langendorff modo de perfusión cardiaca aislada, en conjunto...

Evaluación de la función cardiaca y Energética en los corazones de ratón aislado utilizando 31 P espectroscopía de RMN

Un maniquí dinámico multicompartimiento se utiliza para simular alguna biología de interés para estudios metabólicos utilizando agentes de resonancia magnética hiperpolarizados.

El uso de un de varios compartimentos dinámico sola enzima fantasma de Estudios de hiperpolarizados Agentes de Resonancia Magnética

El siguiente protocolo describe la preparación y utilización de tampones para la medición cuantitativa de las tasas de oxidación de glucosa y ácidos grasos en el corazón de rata en funcionamiento aislado. También se discuten los métodos utilizados para el análisis de muestras y la interpretación de datos.

Los métodos para la determinación de las tasas de glucosa y la oxidación de ácidos grasos en el corazón de rata aislado de Trabajo

La polarización nuclear dinámica con la posterior disolución de la muestra ha permitido estudios en tiempo real del metabolismo en sistemas biológicos. Se utilizó piruvato hiperpolarizado [1-13C] para estudiar la actividad de la lactato deshidrogenasa en una línea celular de carcinoma de próstata in vitro.

hiperpolarizado 13 C metabólico espectroscopía de resonancia magnética e Imagen

Aquí introducimos un método para utilizar un catéter óptico intra-ventrículo en corazones perfundidos para realizar espectroscopia de absorbancia a través de la pared del corazón. Los datos obtenidos proporcionan información sólida sobre la tensión de oxígeno tisular, así como la utilización del sustrato y el potencial de la membrana simultáneamente con medidas de rendimiento cardíaco en esta preparación omnipresente.

Catéter de luz intracardiaca para monitorear el metabolismo celular utilizando espectroscopia de absorbancia transmural de corazones de mamíferos perfundidos

Presentamos un protocolo para medir la dependencia del campo magnético del tiempo de relajación de la celosía de espín de 13compuestos enriquecidos con C, hiperpolarizados mediante polarización nuclear dinámica, utilizando relaxometría rápida de ciclo de campo. Específicamente, lo hemos demostrado con [1-13C]pyruvate, pero el protocolo podría extenderse a otros sustratos hiperpolarizados.

Medición de la dependencia del campo magnético de relajación Spin-Lattice de hiperpolarizado [1-13C]pyruvate

Este protocolo integra un sistema de biorreactor hecho a medida con espectroscopia de RMN de ¹³C hiperpolarizada para medir el metabolismo del piruvato en tiempo real en células vivas, lo que mejora la reproducibilidad y la precisión cinética para estudios metabólicos y aplicaciones de detección de fármacos.

Detección metabólica en tiempo real en células vivas mediante RMN hiperpolarizada de 13C

En este artículo se describe una técnica de alta resolución temporal y espacial de la imagen ópticamente movimiento de acción potencial en la superficie de los corazones de rata Langendorff perfundidos con un tinte potenciométrica (di-8-ANEPPS).

Mapeo óptico de corazones de ratas Langendorff perfundidos

El protocolo siguiente se describe el proceso de aislamiento, ventilación e instrumentación de los pulmones del ratón para medir constante o pulsátil vascular pulmonar de presión-flujo relaciones con el fin de cuantificar los efectos del flujo sanguíneo, el flujo de aire, los cambios en las vías respiratorias y los cambios vasculares en la poscarga del ventrículo derecho.

Caracterización de los aislados y ventilados, y pulmón de ratón instrumentado perfundidos con flujo pulsátil

Resonancia de electrones paramagnético (EPR), espectroscopía fue empleado para detectar óxido nítrico a partir de células endoteliales aórticas bovinas y aniones radicales superóxido de los neutrófilos humanos utilizando hierro (II)-N-metil-D-glucamina ditiocarbamato, Fe...

La detección de óxido nítrico y el radical anión superóxido por espectroscopía de resonancia paramagnética de electrones de las células utilizando atrapadores

Aprende a evaluar el metabolismo cardíaco en tiempo real usando corazón de ratón perfundido con piruvato hiperpolarizado [1-13C] y espectroscopía de RMN 13C/31P. Este protocolo permite cuantificar la actividad de LDH y PDH.

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Investigación del metabolismo cardíaco en el corazón de ratón perfundido aislado con piruvato hiperpolarizado [^1-13C] y espectroscopia de RMN ¹³C / ³¹P

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