Name: Producción eficiente y escalable de variantes completas de huntingtina humana en células de mamíferos utilizando un sistema de expresión transitoria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Aprenda a producir variantes de huntingtina humana de longitud completa en células HEK293 mediante transfección con polietilenimina y cromatografía de afinidad anti-FLAG. Este protocolo escalable garantiza proteínas de alta pureza para investigar la enfermedad de Huntington.

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Agradecemos al Departamento de Ciencias Farmacéuticas de la Universidad Estatal de Nueva York en Buffalo por realizar el análisis de EM de HTT. Este trabajo fue un esfuerzo de colaboración con la Fundación CHDI. Agradecemos específicamente a Elizabeth M. Doherty; Ignacio Muñoz-Sanjuan; Douglas Macdonald, Fundación CHDI; y Rory Curtis, Curia, por su inestimable aporte durante la preparación de este manuscrito. También agradecemos a Michele Luche, Mithra Mahmoudi y Stephanie Fox por su apoyo a este esfuerzo de investigación.

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<li>Nasir, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+Huntington%27s+disease+gene+results+in+embryonic+lethality+and+behavioral+and+morphological+changes+in+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the Huntington's disease gene results in embryonic lethality and behavioral and morphological changes in heterozygotes.</a> Cell. 81 (5), 811-823 (1995).</li>
<li>Dragatsis, I., Levine, M. S., Zeitlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Hdh+in+the+brain+and+testis+results+in+progressive+neurodegeneration+and+sterility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Hdh in the brain and testis results in progressive neurodegeneration and sterility in mice.</a> Nature Genetics. 26 (3), 300-306 (2000).</li>
<li>Anne, S. L., Saudou, F., Humbert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+huntingtin+by+cyclin-dependent+kinase+5+is+induced+by+DNA+damage+and+regulates+wild-type+and+mutant+huntingtin+toxicity+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of huntingtin by cyclin-dependent kinase 5 is induced by DNA damage and regulates wild-type and mutant huntingtin toxicity in neurons.</a> Journal of Neuroscience. 27 (27), 7318-7328 (2007).</li>
<li>Dietrich, P., Johnson, I. M., Alli, S., Dragatsis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+huntingtin+in+the+adult+mouse+leads+to+progressive+behavioral+deficits%2C+bilateral+thalamic+calcification%2C+and+altered+brain+iron+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Elimination of huntingtin in the adult mouse leads to progressive behavioral deficits, bilateral thalamic calcification, and altered brain iron homeostasis.</a> PLoS Genetics. 13 (7), 1006846(2017).</li>
<li>Dragatsis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+early+embryonic+deletion+of+huntingtin+from+pyramidal+neurons+on+the+development+and+long-term+survival+of+neurons+in+cerebral+cortex+and+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Effect of early embryonic deletion of huntingtin from pyramidal neurons on the development and long-term survival of neurons in cerebral cortex and striatum.</a> Neurobiology of Disease. 111, 102-117 (2018).</li>
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<li>Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+conformation+of+polyglutamine+track+revealed+by+a+crystal+structure+of+huntingtin+N-terminal+region+with+insertion+of+three+histidine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Beta conformation of polyglutamine track revealed by a crystal structure of huntingtin N-terminal region with insertion of three histidine residues.</a> Prion. 7 (3), 221-228 (2013).</li>
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<li>Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intein-based+strategy+for+the+production+of+tag-free+huntingtin+exon+1+proteins+enables+new+insights+into+the+polyglutamine+dependence+of+Httex1+aggregation+and+fibril+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An intein-based strategy for the production of tag-free huntingtin exon 1 proteins enables new insights into the polyglutamine dependence of Httex1 aggregation and fibril formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).</li>
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<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+polyQ+expansion+does+not+alter+the+conformation+of+the+Huntingtin-HAP40+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Pathological polyQ expansion does not alter the conformation of the Huntingtin-HAP40 complex.</a> Structure. 29 (8), 804-809 (2021).</li>
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<li>McMeekin, T. L., Wilensky, M., Groves, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractive+indices+of+proteins+in+relation+to+amino+acid+composition+and+specific+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Refractive indices of proteins in relation to amino acid composition and specific volume.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7 (2), 151-156 (1962).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses con el contenido de este artículo.

Describimos aquí un método transitorio de transfección, expresión y purificación para generar múltiples construcciones de proteína FL HTT con pureza y homogeneidad adecuadas para su uso como estándares para el desarrollo de inmunoensayo y ensayo de EM, controles para análisis de Western blot y para estudios de estructura-función. Este método de expresión transitoria es escalable y versátil y permite al usuario generar cantidades bajas de miligramos de variantes de FL HTT de manera más eficiente que el uso de líneas celulares estables o métodos basados en virus descritos anteriormente21,22,23,24. Rutinariamente, se pueden generar 2-5 mg de FL HTT altamente purificado a partir de una producción de proteína a escala de 2 L en menos de una semana utilizando el método de expresión transitoria una vez que se construye el plásmido, con un rendimiento típico de 1-2.5 mg de FL HTT por litro de cultivo celular.
El método de expresión transitoria descrito aquí supera muchos obstáculos en la expresión de líneas celulares estables, como el largo tiempo necesario para establecer líneas celulares y las dificultades para almacenar y mantener líneas celulares estables. PEI también es relativamente barato en comparación con otros reactivos de transfección en el mercado, lo que hace que la transfección a gran escala sea económicamente viable. También hay limitaciones en el protocolo: la eficiencia de la transfección depende en gran medida de la calidad de los plásmidos, el crecimiento celular óptimo y qué tan bien se almacena y prepara la PEI. Los operadores deben tener especial cuidado y realizar controles de calidad en esos pasos críticos para evitar una caída drástica en los rendimientos de proteínas. La resina anti-FLAG utilizada en el protocolo también es relativamente costosa y muestra una captura reducida de FL HTT después de varias purificaciones y regeneraciones. Algunos investigadores pueden encontrar más práctico cambiar a una etiqueta diferente para permitir una regeneración más robusta de la resina de afinidad.
Se probaron varias líneas celulares y condiciones de expresión para optimizar los niveles de expresión de FL HTT. Las células HEK293 fueron elegidas para la expresión de FL HTT debido a la alta expresión de proteínas y la facilidad de manejo en un formato de cultivo en suspensión, lo que hace que el método sea adecuado para la expresión a gran escala en agitadores o biorreactores. Se puede lograr un nivel más alto de expresión de proteína FL HTT a temperaturas de cultivo más bajas, como 32 ° C, en lugar de usar la temperatura habitual de 37 ° C. Es posible que la temperatura más baja pueda ralentizar la síntesis de proteínas y promover el plegamiento correcto de FL HTT40. Sin embargo, este fenómeno no es específico de FL HTT o de las líneas celulares probadas. La temperatura reducida posterior a la transfección se ha utilizado ampliamente en la expresión de proteínas farmacéuticas en células CHO. Aunque el mecanismo no se comprende completamente, se cree que las bajas temperaturas detienen el ciclo celular en la fase G1 y desvían la energía celular a la producción de proteínas41.
La HTT de longitud completa purificada a partir de células de mamíferos co-eluye con la chaperona Hsp7024, y los pasos de lavado de Mg-ATP pueden eliminar la proteína Hsp70. Curiosamente, el Hsp70 co-eluyente no se observa en FL HTT purificado de un sistema de expresión celular de insectos21,22,23. Esto puede reflejar una diferencia en los PTM de FL HTT o respuestas de proteínas de choque térmico a la sobreexpresión de FL HTT en células de mamíferos e insectos. Una vez que la proteína recombinante ha sido despojada de Hsp70, se requieren detergentes no iónicos como CHAPS o DDM para estabilizar la forma monomérica de FL HTT.
Los estados de oligomerización de las variantes FL HTT se analizaron utilizando Blue Native PAGE y SEC-MALS. Una pequeña fracción de HTT dimérico y oligomérico de orden superior estaba presente cuando fue analizado por Blue Native PAGE o SEC-MALS. Cabe destacar que los oligómeros de orden superior formados por FL HTT no parecen correlacionarse con la longitud del poliQ, e incluso el mutante de deleción Exon1 muestra una relación oligómero-dímero-monómero similar. Las variaciones reales en el contenido de oligómeros entre estas construcciones probablemente se deban a pequeñas diferencias en la producción y manejo de cada lote. En contraste con los agregados y fibrillas formados por HTT Exon140,41, los oligómeros de orden superior de FL HTT permanecieron solubles y pudieron ser analizados por SEC y Native PAGE.
El FL HTT monomérico purificado es solo relativamente estable. El almacenamiento prolongado a 4 °C, las incubaciones cortas a temperatura ambiente o concentraciones > 1 mg/ml convertirán la FL HTT monomérica en formas diméricas y oligoméricas de orden superior aunque no se observe precipitación visible en esas condiciones. La FL HTT monomérica purificada mantenida a ≤1 mg/mL se mantuvo relativamente estable a -80 °C en tampón de almacenamiento (50 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 5% v/v glicerol, 0,5% p/v CHAPS y 5 mM DTT) como se describió anteriormente24. Hasta 6 ciclos de congelación-descongelación de FL HTT preparados y almacenados de esta manera no causaron precipitación visible de la proteína, aunque SEC-MALS observó un ligero cambio a un estado oligomérico más alto (Figura Suplementaria S2). Las muestras también fueron analizadas por SDS PAGE después de repetidos ciclos de congelación-descongelación. No se observaron precipitados visibles; no se observaron agregados ni productos de degradación adicionales en SDS-PAGE (Figura Suplementaria S3). La estabilidad a largo plazo de FL HTT purificado todavía está bajo investigación. En ausencia de datos concluyentes a largo plazo, recomendamos almacenar FL HTT purificado a -80 °C durante no más de 6 meses.
Las variantes de proteína FL HTT recombinante de alta calidad y los métodos para producirlas tienen una gran demanda por parte de la comunidad de investigación de la EH. Estas proteínas se utilizan como inmunoensayo y estándares analíticos de EM, en estudios estructurales y para el desarrollo de nuevos ensayos específicos de FL HTT. Los métodos de expresión transitoria a gran escala descritos aquí han producido consistentemente cantidades de miligramos de variantes de FL HTT con una pureza del >95%, proporcionando herramientas esenciales para los estudios de HTT. La producción de decenas de miligramos de variantes poliQ FL HTT altamente purificadas y otros mutantes en apoyo de la investigación de la EH se ha convertido en rutina.

La enfermedad de Huntington (EH) es una enfermedad neurodegenerativa rara caracterizada principalmente por movimientos motores inestables e involuntarios, así como alteraciones cognitivas y psiquiátricas, como cambios de personalidad y apatía 1,2. La EH se asocia con una expansión del tracto de repetición CAG localizado en el exón 1 del gen huntingtina (HTT) a más de 35 repeticiones, con un mayor número de repeticiones CAG que se correlacionan con un inicio más temprano de la enfermedad 3,4. El producto traslacional de HTT, la proteína huntingtina (HTT), está implicado en la viabilidad neuronal y el desarrollo cerebral 5,6,7,8,9.
HTT es una proteína de andamiaje que participa en una amplia gama de procesos celulares, transporte de vesículas, división celular, ciliogénesis y autofagia10,11. Sin embargo, la patogénesis molecular de la EH no está del todo clara, y falta la identificación de interactores proteicos clave que medien el impacto patológico de la mHTT expandida por poliQ. Algunas investigaciones sugieren una ganancia de la función tóxica de mHTT impulsada por la propensión a la oligomerización de la proteína HTT expandida, ya que se han identificado agregados de HTT en neuronas y glía en pacientes con EH y modelos animales de la enfermedad 12,13,14,15,16,17 . Para impulsar la investigación de la función y estructura de las variantes FL HTT y mHTT y suministrar a los investigadores estándares de proteínas de alta calidad para el desarrollo de ensayos, se necesita un suministro robusto y escalable de proteína recombinante homogénea.
Debido a su tamaño (aa 1-3,144, numeración basada en la longitud de polyQ Q23), inestabilidad proteolítica y propensión a agregarse, FL HTT ha demostrado ser difícil de expresar y aislar como proteína soluble. Anteriormente, la región del exón 1 (aa 2-90) de HTT se ha expresado y purificado a gran escala utilizando varias etiquetas que pueden aumentar la solubilidad de la proteína en Escherichia coli18,19,20. FL HTT se expresó y purificó por primera vez en un sistema de expresión de células de insectos utilizando baculovirus 21,22, y se informaron estructuras de microscopía electrónica (EM) de 30 Å de baja resolución de FL Q23-HTT y Q78-HTT químicamente reticuladas23. La investigación de la estructura de HTT avanzó aún más cuando la producción de FL Q17, Q46 y Q128-HTT con modificaciones postraduccionales nativas (PTM) se logró en células humanas utilizando líneas celulares estables o sistemas de expresión de adenovirus24. Estos estudios sugieren que aunque el HTT purificado existe principalmente en estado monomérico, también tiende a formar oligómeros y agregados de alto orden.
La ultracentrifugación analítica de FL Q128-HTT, con una región poliQ altamente expandida, proporcionó más fracciones oligoméricas y agregadas que la proteína con la región poliQ no expandida24. Utilizando una línea celular estable, se ha adaptado con éxito una estrategia para estabilizar FL HTT mediante la coexpresión con el socio de interacción HAP40. Una estructura crio-EM del complejo FL HTT y HAP40 ha sido resuelta a una resolución promedio de 4 Å utilizando el complejo proteico purificado (PDB:6EZ8)25. Esta estrategia de coexpresión ha sido adaptada con éxito a un sistema de baculovirus, y una serie de variantes de HTT de alta calidad con diferentes longitudes de poliQ han sido expresadas y purificadas a partir de células de insectos26. Desde entonces, más estructuras crio-EM del complejo de HTT con longitudes variables de polyQ y estructuras HAP40 y de mayor resolución fueron resueltas y depositadas en la Base de Datos de Proteínas27,28 (PDB: 7DXK, 7DXH, 6X9O).
Optimizamos un método de transfección y expresión en células HEK293, utilizando polietilenimina (PEI), para la expresión transitoria rápida de FL HTT. Como prueba de principio, las variantes de FL HTT que contienen 23 glutaminas (FL Q23-HTT) se purificaron y caracterizaron por primera vez utilizando una modificación de un método de purificación descrito anteriormente24. Este método de transfección transitoria es conveniente, altamente eficiente y escalable; puede producir HTT purificada con rendimientos de 1-2 mg/L, comparable al método de línea celular estable reportado24. Debido a que la proteína se produce en una línea celular humana, es más probable que la HTT producida tenga PTM humanos nativos cuando se somete a un análisis proteómico de espectrometría de masas 11,29,30,31. Se produjeron cantidades de miligramos de las variantes FL Q48-HTT, FL Q73-HTT y exon1-deleted (ΔExon1-HTT) de FL HTT, lo que demuestra que el método de expresión transitoria es especialmente útil para producir rápidamente variantes alternativas de HTT sin depender del esfuerzo requerido para establecer líneas celulares estables para la producción.
El siguiente protocolo ejemplifica el método estándar utilizado en el laboratorio de estos autores para el cultivo celular, la transfección, la purificación de proteínas y la caracterización de proteínas posteriores a la purificación para producir FL Q23-HTT a partir de un cultivo celular de 2 L. El protocolo puede ampliarse a cultivos más grandes o adaptarse para purificar otras variantes de HTT. Hasta 10 L de cultivos celulares de FL HTT y varias mutaciones de sitio o truncamiento de homólogos de HTT y HTT se han realizado con éxito en el laboratorio utilizando el mismo protocolo. Purified FL HTT contiene un alto porcentaje de monómeros junto con dímeros y oligómeros de orden superior. El mismo perfil agregado se observa entre las variantes producidas (Q23, Q48, Q73 y Exon1 eliminado). Como la agregación puede ocurrir cuando no se toma el cuidado adecuado, se realizó un estudio de estabilidad de formulación y congelación-descongelación para identificar las mejores condiciones para el manejo de proteínas. También se describen métodos, como Blue Native PAGE y SEC/MALS-RI, para analizar el contenido de oligómeros HTT como parte del proceso de control de calidad. Para beneficiar a la comunidad de investigación de la EH, los plásmidos y las proteínas HTT descritas en este estudio también se depositan en el Repositorio de la Comunidad de la EH en el Instituto Coriell (www.coriell.org/1/CHDI).

<table><tbody><tr><td>Concentrador de 100 kDa-Amicon</td><td>Millipore Número</td><td>de sección de protocolo UFC910096-6.2.4</td><td></td></tr><tr><td>20x búfer de ejecución PAGE nativo azul</td> Número de sección de protocolo <td>Invitrogen</td><td>BN2001-8.1</td><td></td></tr><tr><td>20x TBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>PI28358</td><td>Protocol Número de sección-5.1</td></tr><tr><td>4x tampón de muestra PAGE nativo azul</td> Número de sección de protocolo <td>Invitrogen</td><td>BN2003-8.3</td><td></td></tr><tr><td>4x Tampón de carga LDS</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td>Número de sección de protocolo-5.3</td></tr><tr><td>Matraces Erlenmeyer de 5 L</td><td>Número de sección de Corning</td><td>431685</td><td>Protocolo-4.2</td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel de agarosa</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Número de sección de protocolo-2.2</td></tr><tr><td>Agente antiaglomerante</td><td>Thermo Fisher</td><td>0010057AE</td><td>Número de sección de protocolo-4.8</td></tr><tr><td>afinidad anti-FLAG M2 gel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td>Protocolo Número de sección-6.1.1</td></tr><tr><td>anti-FLAG M2</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td>Protocolo Número de sección-5.7</td></tr><tr><td>Antiespumante-Excell anti espuma</td><td>Sigma</td><td>59920C-1B Número de</td><td>sección del protocolo-4.8</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A6419</td><td>Número de sección del protocolo-6.1.4.4</td></tr><tr><td>BEH 450 SEC</td><td>Aguas</td><td>186006851</td><td>2.5 y micro; m x 4,6 mm x 150 mm Número de sección del protocolo-7.3</td></tr><tr><td>azul nativo PÁGINA 5% Aditivo de muestra G-250</td><td>Invitrogen</td><td>BN2004</td><td>Número de sección del protocolo-8.3</td></tr><tr><td>carbenicillina</td> Número <td>de sección del protocolo</td><td>Thermo Fisher</td><td>10177012</td></tr><tr><td>centrífuga - Sorvall Lynx 6000</td> Número de sección <td>del protocolo 75006590</td><td>Thermo Fisher-6.1.3</td><td></td></tr><tr><td>Contador de celdas - ViCELL</td><td>BECKMAN COULTER</td><td></td><td>Número de sección de protocolo-4.3</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Anatrace</td><td>C316S</td><td>Número de sección del protocolo-6.1.4.6</td></tr><tr><td>Células de E. coli competentes-TOP10</td><td>Invitrogen</td><td>Número</td><td>de sección del protocolo C404010-2.4</td></tr><tr><td>digitonina</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>Número de sección del protocolo-5.1</td></tr><tr><td>Detector de índice de refracción diferencial</td> Número de sección del protocolo <td>Wyatt-7.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pítido DYKDDDDK</td><td>Genscript</td><td></td><td>Servicio de síntesis de péptidos Número de sección del protocolo-6.1.4.6</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>Número de sección del protocolo EDS-5.1</td><td></td></tr><tr><td>Kit Giga de plásmido EndoFree</td> Número de sección del protocolo <td>Qiagen</td><td>12391-3.3</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de endotoxinas</td><td>Cytiva</td><td>SH30529.03</td><td>Número de sección del protocolo-4.1</td></tr><tr><td>kit de cuantificación de endotoxinas-CRL Sistema de detección Endosafe Nexgen-PTS</td><td>Charles River</td><td></td><td>PTS150K Protocolo Número de sección-3.4</td></tr><tr><td>Rotor de ángulo fijo Rotor A23-6x100</td><td>Protocolo Thermo Fisher</td><td></td><td>75003006 Número de sección-6.1.3</td></tr><tr><td>Software FPLC- Unicornio 6.2</td><td>Número de sección del protocolo Cytiva-6.1.4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Síntesis de genes</td><td>Genscript</td><td></td><td>Servicio de síntesis de genes Número de sección del protocolo-1.2</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific Glycerol (Certified ACS)</td><td>G33-4 Número de</td><td>sección del protocolo-5.6</td></tr><tr><td>Medio de crecimiento-Expi293 medio de expresión</td><td>Protocolo Thermo Fisher</td><td></td><td>A1435102 Número de sección-4.2</td></tr><tr><td>Células HEK293</td> Número <td>de sección de protocolo</td><td>Thermo Fisher</td><td>R79007-4</td></tr><tr><td>alto cizallamiento homogeneizador-microfluidizador</td><td>MicroFluidics</td><td>LM10</td><td>Número de sección del protocolo-6.1.3</td></tr><tr><td>HPLC - 1260 infinity II Bio-Insert HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td>Protocol Número de sección-7.1</td></tr><tr><td>Estudio de imágenes</td><td>LiCor</td><td></td><td>Software de análisis de imágenes Número de sección del protocolo-5.1</td></tr><tr><td>MAB2166</td><td>Sigma</td><td></td><td>MAB2166 Número de sección del protocolo-5.7</td></tr><tr><td>MAB2168</td><td>Número</td><td>de sección 5.7 del protocolo</td><td>MAB2168</td> EMD</tr><tr><td>MAB3E10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47757</td><td>Número de sección de protocolo 5.7</td></tr><tr><td>MAB4E10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-7757</td><td>Número de sección de protocolo-5.7</td></tr><tr><td>MAB5490</td><td>Sigma</td><td></td><td>MAB5490 Protocolo Número de sección-5.7</td></tr><tr><td>MAB5492</td><td>Sigma</td><td></td><td>MAB5492 Número de sección de protocolo-5.7</td></tr><tr><td>MAB8A4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47759 Número de</td><td>sección de protocolo-5.7</td></tr><tr><td>Detector de dispersión de luz multiángulo</td> Número <td>de sección del protocolo Wyatt-7.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estándar de proteína no teñida NativeMark</td><td>Invitrogen</td><td>LC0725</td><td>Número de sección del protocolo-8.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>Número de sección del protocolo-5.6</td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolab</td><td>R0131S</td><td>Versión Hi-Fi disponible Número de sección de protocolo-2.2</td></tr><tr><td>NuPAGE 3&ndash; 8% Geles de acetato de Tris Número de sección del</td> protocolo <td>Invitrogen</td><td>EA0375PK2-5.4</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de ejecución NuPAGE Tris-Acetato SDS</td><td>Invitrogen</td><td>LA0041</td><td>Número de sección del protocolo-5.4</td></tr><tr><td>PEI 25K</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td>Número de sección del protocolo-4.1</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td> Número de sección del protocolo <td>Thermo Fisher</td><td></td><td>15070063-4.2</td></tr><tr><td>Fosfato solución salina tamponada (PBS)</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.02</td><td>Número de sección de protocolo-4.5</td></tr><tr><td>Miniprep de plásmido Kit de minipreparación de plásmido</td><td>Qiagen</td><td>27104</td> Número <td>de sección de protocolo-2.6</td></tr><tr><td>PmeI</td><td>New England Biolab</td><td>R0560S</td><td>Número de sección de protocolo-2.2</td></tr><tr><td>prefabricado Gel Bis-tris- 3-12% NativePAGE Novex Bis-Tris Gel</td><td>Invitrogen</td><td>Número</td><td>de sección de protocolo BN1003BOX-8.4</td></tr><tr><td>proteasa cóctel inhibidor</td><td>GoldBio</td><td>GB-331-1 Número de</td><td>sección de protocolo-5.1</td></tr><tr><td>Software de análisis SEC-MALS - Astra 7</td><td>Wyatt Technology</td><td></td><td>Número de sección de protocolo-7.6</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario -IRdye 800 CW cabra anti-ratón IgG</td><td>LiCor</td><td>926-32210 Número de</td><td>sección de protocolo-5.9</td></tr><tr><td>Superose 6 pg XK 16/70</td><td>Cytiva</td><td>90100042</td><td>Número de sección de protocolo-6.2</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td>Número de sección del protocolo-5.6</td></tr><tr><td>Tween-20 Número de sección del</td> protocolo <td>Thermo Fisher</td><td></td><td>AAJ20605AP-6.1.1</td></tr><tr><td>Espectrómetro UV - Nanodrop 8000</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-8000-GL Número de</td><td>sección del protocolo-2.2</td></tr><tr><td>XK26/100</td><td>Cytiva</td><td>28988951</td><td>Número de sección del protocolo-6.1.1</td></tr></tbody></table>

producción eficiente y escalable de variantes completas de huntingtina humana en células de mamíferos utilizando un sistema de expresión transitoria

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

La huntingtina de longitud completa (FL HTT) es una proteína grande (aa 1-3,144), expresada ubicuamente, que contiene poliglutamina (polyQ) con una masa de aproximadamente 350 kDa. Si bien la función celular de FL HTT no se comprende completamente, una expansión mutante del tracto polyQ por encima de ~ 36 repeticiones se asocia con la enfermedad de Huntington (HD), y la longitud de polyQ se correlaciona aproximadamente con la edad de inicio. Para comprender mejor el efecto de la estructura en la función del HTT mutante (mHTT), se requieren grandes cantidades de la proteína. La producción de submiligramos de FL HTT en células de mamíferos se logró utilizando la expresión de líneas celulares estables inducibles por doxiciclina. Sin embargo, la producción de proteínas a partir de líneas celulares estables tiene limitaciones que pueden superarse con métodos de transfección transitoria. 
Este documento presenta un método robusto para la producción en cantidades de bajos miligramos de FL HTT y sus variantes a partir de plásmidos optimizados para codones por transfección transitoria utilizando polietilenimina (PEI). El método es escalable (>10 mg) y produce consistentemente 1-2 mg/L de cultivo celular de FL HTT altamente purificado. De acuerdo con informes anteriores, se encontró que el estado de la solución purificada de FL HTT era altamente dinámico; La proteína tiene una propensión a formar dímeros y oligómeros de alto orden. Una clave para ralentizar la formación de oligómeros es trabajar rápidamente para aislar las fracciones monoméricas de las fracciones diméricas y oligoméricas de alto orden durante la cromatografía de exclusión de tamaño. 
Se utilizó cromatografía de exclusión de tamaño con dispersión de luz multiángulo (SEC-MALS) para analizar el dímero y el contenido oligomérico de orden superior de HTT purificado. No se observó correlación entre la longitud de FL HTT polyQ (Q23, Q48 y Q73) y el contenido de oligómeros. La construcción exon1-deleted (aa 91-3,144) mostró una propensión a oligomerización comparable a FL HTT (aa 1-3,144). Aquí se describen los métodos de producción, purificación y caracterización por índice de refracción (RI) SEC/MALS, electroforesis en gel de dodecilsulfato-poliacrilamida de sodio (SDS-PAGE), western blot, PAGE nativo y Blue Native PAGE.

Proporcionamos protocolos escalables que cubren el diseño de constructo, la transfección transitoria y la expresión y purificación de variantes de proteína huntingtina humana de longitud completa en células HEK293.

Producción eficiente y escalable de variantes completas de huntingtina humana en células de mamíferos utilizando un sistema de expresión transitoria

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

El protocolo ha sido desarrollado para la producción de variantes de huntingin de longitud completa a una escala de miligramos bajos. Permite una proteína consistente de alta calidad esencial para los investigadores de la EH. Demostrando el procedimiento estará Michael Harris, un científico investigador del Laboratorio de la Curia.Comience agregando un gramo de polietileneimina 25 K a un litro de agua libre de endotoxinas y revuelva bien. Ajuste el pH a 2.0 usando ácido clorhídrico 100 milimolar y revuelva hasta que toda la polietilenimina se disuelva. Luego ajuste el pH a 7.0 usando una solución de hidróxido de sodio de 100 milimolares y pase la solución a través de un filtro de 0.2 micrómetros.Haga alícuotas de la solución filtrada y guárdelas a menos 20 grados centígrados. Propague células HEK293 en el medio de crecimiento suplementado con estreptomicina penicilina en una incubadora agitadora humidificada a 37 grados centígrados, 90 RPM, 5% de dióxido de carbono durante 18 a 24 horas. Un día antes de la transfección, diluir las células a una densidad de aproximadamente 1,2 x 10 a la sexta células de potencia por mililitro en dos litros de medio de crecimiento en un erlenmeyer de cinco litros e incubar durante 18 a 24 horas.Al final de la incubación, mida la densidad y viabilidad de la celda utilizando un contador automático de células siguiendo las instrucciones del fabricante. Después de calcular la cantidad de polietilenoimina y plásmido requerida para la transfección, diluya la polietileneimina y el plásmido individualmente en 100 mililitros de PBS e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. Luego, mezcle el plásmido diluido y la polietileneimina girando suavemente e incube la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos.Agregue la mezcla al cultivo celular y mezcle girando suavemente. Ahora, permita que las células crezcan durante 24 horas. Al día siguiente, agregue la solución de butirato de sodio a una concentración final de agente antiaglutinante y antiespumante de dos milimolares en una proporción de volumen de 1: 1, 000 al cultivo e incube las células en la incubadora del agitador humidificado durante 48 horas.Después de medir la viabilidad y densidad celular, recolecte las células por centrifugación a 2, 000 G durante 30 minutos y almacene el pellet de celda a menos 80 grados centígrados antes de la purificación. Para la purificación anti-FLAG usando FPLC, empaque de 12 a 25 mililitros de resina anti-FLAG en una columna vacía a una velocidad de flujo de cuatro mililitros por minuto usando el tampón A y ajuste la altura del émbolo para eliminar el espacio entre el extremo del émbolo y el lecho de resina. A continuación, suspenda el gránulo de celda descongelado en tampón de lisis en frío y pase la suspensión celular una vez a través de un homogeneizador de alto cizallamiento a una presión de 1, 000 libras por pulgada cuadrada.Usando una centrífuga equipada con un rotor de ángulo fijo compatible, aclare el lisado a 20, 000 G durante una hora. Programe FPLC en la ventana Método, cargue el lisado clarificado a través de la bomba de muestra y lave la columna con los volúmenes de columna deseados de tampón A, B, C, D y tampón de elución como se describe en el manuscrito de texto. Una vez finalizada la carrera, analice 10 microlitros de las fracciones pico utilizando SDS-PAGE.Combine las fracciones máximas con la pureza deseada y ahorre aproximadamente 50 microlitros de los eluidos combinados para un análisis SDS-PAGE adicional. Comience a equilibrar la columna SEC usando el FPLC y cargue el eluido anti-FLAG a través de un superloop de 50 mililitros. Después de ejecutar el búfer SEC, permita que la separación SEC ocurra durante la noche a cuatro grados centígrados.Compare el perfil de elución con el perfil de elución HTT estándar para distinguir los picos de monómero, dímero y oligomérico de orden superior. Agrupe las fracciones monoméricas de HTT en función del perfil de elución de la columna SEC y, si lo desea, agrupe las fracciones HTT oligoméricas y diméricas de orden superior por separado. Concentrar la proteína HTT combinada utilizando un concentrador centrífugo de 100 kilodalton a cuatro grados centígrados.Después de calcular la concentración de proteína, alícuota menos de 100 microlitros de la proteína HTT purificada en un tubo de microcentrífuga crioseguro. Congele rápidamente las alícuotas con nitrógeno líquido y guárdelas a menos 80 grados centígrados. Realice todos los análisis SEC-MALS a cuatro grados centígrados en el sistema HPLC, junto con un detector UV, un detector de dispersión de luz multiángulo, un detector de índice de refracción diferencial y use 0.185 como incremento del índice de refracción para HTT.Purgue la bomba y los detectores con agua filtrada de grado HPLC y conecte la columna UHPLC al sistema. Equilibre la columna con agua filtrada y luego amortigue SEC-MALS hasta que todas las señales del detector alcancen la línea de base. Inyecte dos microlitros de solución de BSA a un caudal de 0,3 mililitros por minuto durante 15 minutos por inyección.Inspeccione la calidad de los datos, realice la normalización, la alineación de picos y la corrección de ampliación de banda en función del perfil BSA y cree una plantilla para las siguientes ejecuciones de muestra de HTT. Descongele rápidamente un vial de la muestra FL Q23-HTT en un baño de agua a temperatura ambiente utilizando un flotador. Filtre el HTT a través de un filtro de centrifugado de 0,1 micrómetros.Inyecte de dos a cuatro microlitros de la muestra HTT y funcione durante 15 minutos a cuatro grados centígrados a un caudal de 0,3 mililitros por minuto. Analice los datos cromatográficos y de dispersión de luz utilizando el software que lo acompaña y genere un diagrama Zimm para determinar la masa molecular promediada en peso para cada pico. En el presente estudio, utilizando un proceso de columna de dos pasos, se obtuvo más del 95% de pureza para HTT y el principal contaminante fue la chaperona Hsp70, que se eliminó mediante un lavado extensivo con cloruro de magnesio y ATP durante el paso de purificación de afinidad anti-FLAG. La sobreexpresión de FL HTT puede resultar en la fragmentación de la proteína, pero FL Q23-HTT producida por el método resuelto como una sola banda con el peso molecular correcto de 350 kilodaltons indica que no fragmentación.El análisis de Western blot después de la reacción de anticuerpos con FL Q23-HTT demostró que la proteína se aisló sin truncamientos detectables significativos, ya que no se observaron bandas adicionales relacionadas con fragmentos. La varianza de longitud de FL HTT poly-Q, Q23, Q48 y Q73 reaccionaron como se esperaba en Western blot, mostrando una señal progresivamente más fuerte para el anticuerpo monoclonal dirigido a poli-Q MW1, correlacionándose con el aumento de la longitud Q. Entre las columnas de HPLC probadas, la columna SEC mostró una resolución suficiente entre el monómero HTT y el dímero, de modo que se pudieran distinguir masas molares.El FL HTT purificado de SEC mostró múltiples bandas correspondientes a los estados de oligomerización, lo que podría deberse a la presencia de varios parches hidrófobos que contribuyen a la formación de oligómeros de orden superior durante la migración dentro del gel. El HTT purificado mostró tres bandas principales en PAGE nativa azul con un peso molecular estimado de 643, 927 y 1.070 kilodaltons que probablemente representan las especies monoméricas, diméricas y triméricas de HTT, respectivamente. El manejo adecuado de la huntingtina purificada es esencial para evitar la generación de oligómeros de alto orden en agregados solubles.Es imperativo que el usuario final trabaje rápidamente para dispensar la muestra en tubos preenfriados antes de la congelación rápida. Las pruebas de estabilidad a largo plazo se pueden realizar en muestras almacenadas en períodos prolongados a menos 80 grados centígrados. Los análisis HPLC SEC-MALS confirmarán si ha habido algún cambio en el contenido monomérico de la muestra.

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Investigación

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Bioquímica

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Expresión Ion Channel controlable a través de la transfección transitoria inducible

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A ADN epigenoma edición representa un potente enfoque terapéutico. Este protocolo describe la producción, purificación y concentración de vectores lentivirales all-in-one que el transgén CRISPR-dCas9-DNMT3A para aplicaciones de edición de epigenoma en células pluripotentes inducidas humanas (hiPSC)-derivado de las neuronas.

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Un protocolo mejorado para purificar y directamente monobiocalinato recombinante BDNF en un tubo para estudios de tráfico celular en neuronas

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Producción de lotes de vectores adenoasociados de alto rendimiento utilizando celdas de suspensión HEK293

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Producción eficiente y escalable de variantes completas de huntingtina humana en células de mamíferos utilizando un sistema de expresión transitoria (Video) | JoVE Journal

Producción eficiente y escalable de variantes completas de huntingtina humana en células de mamíferos utilizando un sistema de expresión transitoria

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