Name: Síntesis de masarimicina, un inhibidor de molécula pequeña del crecimiento bacteriano grampositivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Aprende la síntesis de masarimycin, un inhibidor de autolisinas bacterianas, para estudiar la fisiología microbiana con Bacillus subtilis y Streptococcus pneumoniae. Este protocolo reproducible facilita ensayos de sinergia y estudios morfológicos.

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La investigación fue apoyada por la Fundación Nacional de Ciencias bajo la subvención número 2009522. El análisis de RMN de masaromicina fue apoyado por el premio del programa de instrumentación de investigación principal de la Fundación Nacional de Ciencias bajo el número de subvención 1919644. Cualquier opinión, hallazgo y conclusión, o recomendación expresada en este material son las de los autores y no reflejan necesariamente los puntos de vista de la National Science Foundation.

1. Métodos generales
NOTA: Todos los compuestos se compraron a proveedores estándar y se utilizaron sin purificación adicional.
<ol><li>Realizar cromatografía de capa fina (TLC) sobre una placa de aluminio precubierta con gel de sílice XG F254. Detectar manchas debajo de una lámpara UV, por inmersión en tinción de p-anisaldehído, o por exposición al vapor I2 .</li>
	<li>Registre todos los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) en un espectrómetro de 400 MHz. NOTA: 1espectro de RMN H y 13de RMN C se hicieron referencia a picos de disolventes residuales. Las constantes de acoplamiento se dan en [Hz] y los cambios químicos en [ppm].</li>
	<li>Registre los espectros de espectrometría de masas de ionización química a presión atmosférica (APCI) de masarimicina en un espectrómetro de masas compacto equipado con una sonda de análisis de sólidos atmosféricos.</li>
</ol>2. Procedimiento general para la preparación de masarimicina
NOTA: Realice los pasos a continuación en una campana extractora de humos.
<ol><li>Prepare una solución de 0,1 M en metanol de cada reactivo: ciclohexilamina, ciclohexil carboxaldehído, ácido o-yodobenzoico y ciclohexilo isocianuro35. PRECAUCIÓN: La ciclohexilamina, el ciclohexil isocianuro y el ciclohexil carboxaldehído son inflamables. Pueden causar corrosión en la piel e inducir toxicidad oral, dérmica, respiratoria o reproductiva. Mantenga los compuestos alejados de llamas abiertas, superficies calientes y fuentes de ignición. Use protección adecuada para la piel y los ojos, trabaje en un área bien ventilada y evite la inhalación de vapores o niebla. Para el almacenamiento, mantenga las botellas bien cerradas y guárdelas en un lugar fresco y seco. Almacene el ciclohexil carboxaldehído en un desecador bajo una atmósfera N2 .</li>
	<li>Mezcle 5 ml de ciclohexilamina (solución de 0,1 M en metanol) y 5 ml de carboxaldehído de ciclohexilo (0,1 M en metanol) en un matraz de fondo redondo tapado y revuelva la solución con una barra de agitación magnética en una placa agitada / caliente durante 30 min a 40 ° C en un baño de arena. Controle la temperatura con un termómetro colocado aproximadamente 1 cm por debajo de la superficie de arena.</li>
	<li>Después de 30 min, agregue 5 ml de ciclohexil isocianuro (solución de 0,1 M en metanol) a la solución del paso 2.2 y revuelva durante 20 minutos adicionales a 50 °C. Por último, agregue 5 ml de ácido o-yodobenzoico (solución de 0,1 M en metanol) a la mezcla de reacción y continúe agitando a 55 ° C durante 3-5 h.</li>
	<li>Monitoree el progreso de la reacción periódicamente por TLC aproximadamente cada hora después de que la mezcla de reacción anterior se haya agitado durante 3 h.</li>
	<li>Corte una tira de 3 cm x 6 cm de placa TLC con respaldo de aluminio. Usando un lápiz #2, dibuja una línea aproximadamente a 1 cm de la parte inferior. Usando un microcapilar de vidrio, coloque aproximadamente 5 μL de la mezcla de reacción en la placa TLC y deje que se seque.</li>
	<li>A un vaso de precipitados de 150 ml, agregue suficiente fase móvil (hexano 90:10: isopropanol) para cubrir el fondo del vaso de precipitados. Usando un par de pinzas, coloque cuidadosamente la placa TLC anterior en el vaso de precipitados asegurándose de que la placa TLC entre en la fase móvil de manera uniforme. Cubra la parte superior del vaso de precipitados con un trozo de papel de aluminio. NOTA: Asegúrese de que la fase móvil no cubra la línea y la muestra manchada.</li>
	<li>Permita que la fase móvil viaje por la placa TLC hasta que esté aproximadamente 1 cm por debajo de la parte superior de la placa. Retire la placa TLC y, con un lápiz, dibuje una línea que indique la distancia recorrida por la fase móvil. Deje que la placa TLC se seque en una campana extractora de humos.</li>
	<li>Una vez seco, coloque la placa TLC en un vaso de precipitados que contenga una pequeña cantidad de sólido I2 y cubra el vaso de precipitados con un trozo de papel de aluminio. Monitoree el TLC para el desarrollo de manchas amarillas / marrones. Una vez desarrollado, retire la placa TLC y marque la ubicación de las manchas con un lápiz (Figura suplementaria 1). NOTA: Si no se marcan2 puntos, la mancha se disipará con el tiempo. Las manchas también se pueden visualizar en la placa TLC mediante luz UV, tinción de p-anisaldehído o tinción de permanganato de potasio (consulte Información complementaria).</li>
	<li>Calcule los valoresde R f para todos los puntos visualizados utilizando la siguiente fórmula: Rf = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63191/63191eq01.jpg"></li>
	<li>Considere la reacción completa cuando solo un punto con Rf = 0.3 es visible en la placa TLC. Retire el disolvente en un evaporador rotatorio a presión reducida y seque el producto crudo (obtenido como un aceite de color marrón amarillento) a alto vacío hasta que todo el metanol se evapore.</li>
	<li>Disuelva el producto crudo seco en 30 ml de acetato de etilo y transfiéralo a un embudo separador. Extraiga acetato de etilo secuencialmente con 1 M HCl (2 x 30 mL), H2O (30 mL), solución saturada de NaHCO3 (2 x 30 mL), H2O (30 mL) y solución saturada de NaCl (2 x 30 mL). Deseche las capas acuosas. NOTA: La capa de acetato de etilo es la capa superior en cada una de las extracciones. Para cada extracción, agite vigorosamente el embudo separador que contiene el acetato de etilo y la solución acuosa (HCl, H2O, NaHCO3 o NaCl) y permita que las capas se separen por completo.</li>
	<li>Retire la capa de acetato de etilo del embudo separador y recójala en un matraz Erlenmeyer. Agregue una espátula llena de Na2SO4 (anhidra) para eliminar el agua residual del acetato de etilo. NOTA: La solución de acetato de etilo se considera seca cuando Na2SO4 en el matraz corre libremente y no se agrupa. Si Na2SO4 se aglutina, se puede agregar una espátula adicional de Na2SO4 .</li>
	<li>Filtre la solución seca de acetato de etilo a través del papel de filtro # 1 para eliminar Na2SO4. Lave el papel de filtro con una pequeña cantidad de acetato de etilo. Coloque la solución de acetato de etilo filtrada en un matraz de fondo redondo y retire el disolvente en un evaporador rotatorio a presión reducida para obtener masarimicina como aceite una vez que se elimine todo el acetato de etilo.</li>
	<li>Disuelva el aceite de masarimicina obtenido anteriormente en una cantidad mínima (1-2 ml) de hexano 9: 1: isopropanol y revuelva en una placa de agitación magnética hasta que todo el compuesto se disuelva.</li>
	<li>Purificar la masarimicina disuelta mediante cromatografía flash utilizando una columna flash de sílice de fase normal de 12 g.<ol>
<li>Equilibre la columna flash con 10 volúmenes de columna de fase móvil (hexano 99:1: isopropanol) con el instrumento ajustado a un caudal de 15 mL/min. NOTA: Una vez completado el equilibrio, detenga el flujo y desconecte la parte superior de la columna del sistema.</li>
		<li>Extraiga la masarimicina disuelta con una jeringa de 5 ml. Conecte la jeringa directamente a la parte superior de la columna de flash equilibrado e inyecte la solución en la columna. Vuelva a conectar la columna cargada al sistema de cromatografía flash e inicie la elución del gradiente.</li>
		<li>Elute masarimycin de la columna utilizando elución de gradiente a una concentración final de fase móvil de 10:90 hexano: isopropanol sobre 12 volúmenes de columna. Controlar la elución de masarimicina vía absorción a 230 y 254 nm.</li>
		<li>Recoger los compuestos eluidos de la columna por un colector de fracción que recoge 20 ml de disolvente por fracción. NOTA: Si no se dispone de un sistema de cromatografía flash, la purificación de masarimicina se puede realizar a través de una columna de sílice por gravedad con una fase móvil 3:1 (hexano: acetato de etilo). Las fracciones que contienen masarimicina pueden ser identificadas por TLC utilizando la misma fase móvil. La visualización de las manchas de TLC se realizó con luz UV, vapor I2 o tinción de permanganato de potasio.</li>
		<li>Identifique las fracciones que contienen masarimicina mediante TLC (pasos 2.5-2.9) o espectrometría de masas en un espectrómetro de masas compacto equipado con una sonda de análisis de sólidos atmosféricos. Secar el producto final al vacío (~0,3 mbar). NOTA: La masarimicina se obtiene rutinariamente como un aceite incoloro o sólido con un rendimiento del 55% -70% con respecto a los mmol de ciclohexil carboxaldehído agregado a la reacción. Calcular el rendimiento final de masarimicina obteniendo la masa de la masaromicina purificada y calculando el rendimiento teórico de la reacción utilizando la siguiente fórmula: % de rendimiento = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63191/63191eq02.jpg"> x 100%</li>
	</ol></li>
	<li>Confirmar la estructura de la masarimicina mediante RMN.<ol>
<li>Disolver ~10 mg de muestra de masarimicina en 0,5 ml de CDCl3. Usando una pipeta Pasteur, transfiera la solución a un tubo de RMN de 5 mm y tapone el tubo. Coloque el tubo de RMN en el espectrómetro.</li>
		<li>Adquiera espectros de RMN de 1H y 13C utilizando experimentos preestablecidos por el fabricante. Las asignaciones de turnos químicos y los espectros representativos se proporcionan en las Figuras Suplementarias 3-4.</li>
	</ol></li>
	<li>Almacene la masaromicina seca o disuelta en DMSO (concentración final de 25 mM) a -20 °C hasta su uso.</li>
</ol>3. Procedimiento de microondas para la preparación de masarimicina
<ol><li>Preparar 0,6 M de soluciones de ciclohexilamina, ciclohexil carboxaldehído, ciclohexil isocianuro y ácido o-yodobenzoico en acetonitrilo.</li>
	<li>Agregue una barra de agitación y 10 ml de acetonitrilo a un vial de reacción de microondas de vidrio.</li>
	<li>Añadir 2 ml de ciclohexilamina (0,6 M en acetonitrilo), 2 ml de ciclohexilo carboxaldehído (0,6 M en acetonitrilo) y 7 ml de acetonitrilo al vial.</li>
	<li>Coloque el vial de reacción de microondas en el carrusel de microondas. Revuelva la mezcla, caliéntela durante 30 minutos a 50 ° C a una potencia de 400 W y deje que se enfríe a temperatura ambiente.</li>
	<li>Añadir 2 ml de ácido o-yodobenzoico (0,6 M en metanol) y 2 ml de ciclohexil isocianuro (0,6 M en acetonitrilo) al vial. Revuelva la mezcla, caliéntela a 100 °C en el microondas durante 40 minutos a una potencia de 400 W y deje que se enfríe a temperatura ambiente.</li>
	<li>Monitorear el progreso de la reacción por TLC (hexano 90:10: isopropanol) usando vapor I2 después de la finalización del paso 3.5. NOTA: Si TLC muestra que la reacción es incompleta (es decir, múltiples puntos en TLC), coloque el vial de reacción de nuevo en el microondas y establezca las condiciones de microondas descritas en el paso 3.5.</li>
	<li>Una vez que se complete la reacción, vierta la solución en un matraz de fondo redondo de 100 ml y evapore hasta que se seque con un evaporador rotatorio.</li>
	<li>Siga los pasos 2.6-2.16 anteriores para completar el análisis acuoso, la purificación y la caracterización de la masarimicina.</li>
</ol>4. Ensayo de sinergia y antagonismo
<ol><li>Cultivar Streptococcus pneumoniae R6 en placas de agar Mueller-Hinton (MH) que contengan 5% (v/v) de sangre de oveja a 37 °C en condiciones anaeróbicas. En todos los experimentos, use células de segundo paso cultivadas en 5 ml de caldo MH a 37 ° C en condiciones anaeróbicas hasta que OD600 sea ~ 0.4.</li>
	<li>Someter los inhibidores masarimicina y optoquina a diluciones seriales 1:2 en disolventes respectivos, con las concentraciones resultantes flanqueando los valores mínimos de concentración inhibitoria (CMI) de cada inhibidor.<ol>
<li>Realizar la dilución inicial de masarimicina en dimetilsulfóxido (DMSO) hasta alcanzar una concentración de 100 μM. A partir de este punto, haga diluciones de masarimicina en caldo MH. Preparar la solución madre de optoquina (3,5 mM) disolviendo optoquina disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales) en caldo MH estéril. NOTA: Las soluciones de masarimicina se fabricaron a 25 mM en DMSO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A una placa estéril de microtitulación de 96 pocillos, agregue 2 alícuotas μL de cada dilución de optoquina a cada fila de la placa. A la misma placa, agregue 2 alícuotas μL de cada dilución de masarimicina a cada columna para crear una matriz de concentraciones de optoquina y masarimicina en la placa (Figura 2).</li>
	<li>Agregue caldo MH estéril (93 μL) a cada pocillo que contenga los inhibidores anteriores. Inocular las placas de microtitulación con 5 μL de cultivo (OD600 ~ 0.4) a partir del paso 4.1. NOTA: La inoculación de la placa de 96 pocillos se realiza típicamente en condiciones anaeróbicas en una estación de trabajo anaeróbica. El volumen final en el pozo es de 100 μL.</li>
	<li>Cultivar cultivos durante 18 h a 37 °C en condiciones anaeróbicas, seguido de la adición de 30 μL de solución al 0,01% (m/v) de sal sódica de resazurina sódica. Incubar la placa a temperatura ambiente durante 15 min para permitir la formación y estabilización del color. NOTA: La solución de resazurina se prepara disolviendo el compuesto en agua destilada y se puede almacenar a 4 °C durante un máximo de dos semanas.</li>
	<li>Lea directamente los valores de concentración de la placa y asigne la concentración de inhibidor más baja para la cual no se observa crecimiento bacteriano (color azul) como [X] (ver paso 4.7.1), es decir, la concentración inhibitoria más baja del fármaco en presencia del co-fármaco. NOTA: El crecimiento bacteriano positivo se identifica en los pozos por el tinte de resazurin que se vuelve rosa. Los valores de MIC para cada fármaco solo (es decir, en ausencia de co-fármaco) se determinan de manera similar utilizando el ensayo de resazurin MIC35 con cada fármaco por separado (Figura suplementaria 5). Los CMI en S. pneumoniae son de 7,8 μM y 15,85 μM para masarimicina y optoquina, respectivamente.</li>
	<li>Determinar la concentración inhibitoria fraccional (FIC) y el índice FIC (FICI) utilizando las siguientes ecuaciones.<ol>
<li>FIC= [X]/MICx, donde [X] (a partir del paso 4.6) es la concentración inhibitoria más baja del fármaco en presencia del co-fármaco, y MICx es la concentración inhibitoria más baja del fármaco en ausencia del co-fármaco.</li>
		<li>FICI= FICmasarimicina +antibiótico FIC NOTA: FICI &lt; 0.5 = sinérgico, 0.5 &lt; FICI &lt; 1 = aditivo, 1 &lt; FICI &lt; 4 = indiferente, FICI &gt; 4 = antagónico.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Estudio morfológico
<ol><li>Cultive Bacillus subtilis 11774 en placas de agar Luria-Bertani (LB) (10 g/L de triptona, 5 g/L de extracto de levadura y 5 g/L de NaCl) que contengan 1,5% de agar Bacto a 37 °C. En todos los experimentos, use células de segundo paso cultivadas en 5 ml de caldo LB a 37 ° C hasta OD600 = 1. Cultive S.pneumoniae de la misma manera que en el paso 4.1.</li>
	<li>Después de obtener una densidad de cultivo celular con OD600nm = 1 para B. subtilis, o OD600nm = 0.4 para S. pneumoniae, agregue masarimicina usando una pipeta al tubo de cultivo etiquetado como "tratado" a una concentración final de 3.8 μM (0.75x MIC para B.subtilis), o 5.85 μM (0.75x MIC para S.pneumoniae). Al segundo tubo de cultivo etiquetado como "control", agregue un volumen equivalente de DMSO.</li>
	<li>Para B.subtilis, coloque las muestras en una incubadora a 37 °C durante 90 min con agitación a 150 rpm. Para S. pneumoniae, incubar las células sin temblar en condiciones anaeróbicas.</li>
	<li>Después de 90 min, fije químicamente los cultivos en una mezcla 1:10 (v/v) de medios de cultivo y tampón de fijación (20 mM HEPES, 1% de formaldehído (pH 6.8)) a 4 °C durante la noche. Una vez completada la fijación, aplique 10-20 μL de muestras a los portaobjetos de microscopio de vidrio con una pipeta y deje que se sequen al aire. Fije las muestras secas al aire calentando los portaobjetos de vidrio con un quemador Bunsen.</li>
	<li>Después de la fijación térmica, tiñe las muestras con la adición de 100 μL de azul de metileno al 0,1% (m/v) (solución en etanol al 20% (v/v)). Incubar los portaobjetos manchados durante 10 min y lavar el exceso de tinte con dH2O. Luego, caliente suavemente los toboganes teñidos a 60 ° C en un horno durante 15-20 minutos para llevar las células a un plano focal común.</li>
	<li>Selle las muestras teñidas colocando una cubierta de microscopio sobre las células teñidas. Luego, selle los bordes con cemento de portaobjetos de microscopio. Coloque el portaobjetos sellado del microscopio en el escenario del microscopio y enfoque la imagen con un aumento de 100x mediante microscopía de campo brillante.</li>
	<li>Coloque una gota de aceite de inmersión en el portaobjetos del microscopio y enfoque el campo de visión con un aumento de 1000x. Adquirir micrografías utilizando una cámara conectada al microscopio y su software asociado. Adquiera imágenes utilizando el balance de blancos automático y la configuración de apertura en el software. NOTA: Alternativamente, las imágenes se pueden procesar utilizando el software de código abierto ImageJ.</li>
</ol>

Reid, C. W. tiene propiedad intelectual que involucra aplicaciones específicas de masarimicina.

La masarimicina es un único inhibidor bacteriostático micromolar del crecimiento de B. subtilis35 y S. pneumoniae37 . En B. subtilis, se ha demostrado que la masarimicina inhibe la GlcNAcase LytG35, mientras que no se ha identificado la diana molecular precisa en la pared celular de S. pneumoniae 37. La síntesis de masarimicina utilizando la síntesis orgánica clásica o el procedimiento de microondas ...

Peptidoglicano (PG) es un polímero similar a una malla que delinea la forma y estructura celular en bacterias Gram-positivas y Gram-negativas 1,2. Este heteropolímero es una matriz de aminoazúcares reticulados por péptidos cortos 3,4,5,6 con una columna vertebral compuesta por residuos de ácido N-acetilglucosamina (GlcNAc) y ácido N-acetilmurámico (MurNAc) alternados β-(1,4) (Figura 1)1. Unido a la fracción C-3 lactyl de MurNAc está el péptido del tallo. El metabolismo de pg implica un sistema estrechamente coordinado de enzimas biosintéticas y degradativas para incorporar nuevo material en la pared celular 7,8. La degradación de PG se lleva a cabo por enzimas denominadas colectivamente autolisinas9 y clasificadas en función de la especificidad del enlace escindido. Las autolisinas participan en muchos procesos celulares, incluyendo el crecimiento celular, la división celular, la motilidad, la maduración pg, la quimiotaxis, la secreción de proteínas, la competencia genética, la diferenciación y la patogenicidad10,11. Desentrañar las funciones biológicas específicas de las autolisinas individuales puede ser desalentador, debido en parte a la redundancia funcional. Sin embargo, los estudios biofísicos recientes 8,12,13 ycomputacionales 12 han proporcionado una nueva visión de sus roles en el metabolismo de PG. Además, informes recientes han proporcionado más información sobre la síntesis14 ylos 15,16,17 pasos mediados por membrana en el metabolismo de PG. Una comprensión profunda de la relación entre las vías degradativas y sintéticas del metabolismo de PG podría dar lugar a objetivos antibióticos previamente no explotados.
Si bien ha habido avances significativos en la metodología para estudiar la glicobiología en eucariotas, la glicobiología bacteriana y, en particular, el metabolismo de PG no ha avanzado a un ritmo similar. Los enfoques químicos actuales para estudiar el metabolismo de PG incluyen antibióticos marcados fluorescentemente18, sondas fluorescentes19,20 y etiquetado metabólico 21,22,23,24. Estos nuevos enfoques están proporcionando nuevas formas de interrogar el metabolismo de la pared celular bacteriana. Si bien algunas de estas estrategias son capaces de etiquetar PG in vivo, pueden ser específicas de la especie19, o solo funcionan en cepas que carecen de una autolisinaparticular 25. Muchas estrategias de etiquetado de PG están diseñadas para su uso con paredes celulares aisladas26 o con vías de biosíntesis de PG reconstituidas in vitro 20,27,28. El uso de antibióticos marcados fluorescentemente se limita actualmente a pasos biosintéticos y transpeptidación18.
El conocimiento actual de las autolisinas bacterianas y su papel en el metabolismo de la pared celular proviene del análisis bioquímico genético e in vitro 11,29,30,31,32. Si bien estos enfoques han proporcionado una gran cantidad de información sobre esta importante clase de enzimas, descifrar su papel biológico puede ser un desafío. Por ejemplo, debido a la redundancia funcional33, la eliminación de una autolisina en la mayoría de los casos no resulta en la detención del crecimiento bacteriano. Esto es a pesar de su papel implícito en el crecimiento celular y la división 7,12. Otra complicación es que la deleción genética de autolisinas bacterianas puede dar lugar a metafenotipos34. Los metafenotipos surgen de la compleja interacción entre la vía afectada por la deleción genética y otras vías interconectadas. Por ejemplo, un metafenotipo puede surgir a través de un efecto directo, como la falta de una enzima, o un efecto indirecto, como una interrupción de los reguladores.
Actualmente, solo hay unos pocos inhibidores de las autolisinasas glucosidasas como las N-acetilglucosaminidasas (GlcNAcase) y las N-acetilmuramidasas, que se pueden utilizar como sondas químicas para estudiar la degradación de PG. Para abordar esto, la diamida masarimicina (anteriormente denominada como fgkc) ha sido identificada y caracterizada35 como un inhibidor bacteriostático del crecimiento de Bacillus subtilis que se dirige a la GlcNAcase LytG32 (Figura 1). LytG es una GlcNAcase36 de exoacción, un miembro del grupo 2 dentro de la familia de la glicosilhidralasa 73 (GH73). Es el principal activo de GlcNAcase durante el crecimiento vegetativo32. Hasta donde sabemos, la masarimicina es el primer inhibidor de una GlcNAcase que actúa en PG y que inhibe el crecimiento celular. Estudios adicionales de masarimicina con Streptococcus pneumoniae encontraron que la masarimicina probablemente inhibe el metabolismo de la pared celular en este organismo37. Aquí, la preparación de masarimicina se informa para su uso como una sonda de biología química para estudiar la fisiología en los organismos Gram-positivos B. subtilis y S. pneumoniae. Se presentan ejemplos de análisis morfológico del tratamiento de concentración inhibitoria submámica con masarimicina, así como un ensayo de sinergia/antagonismo. Los ensayos de sinergia y antagonismo utilizando antibióticos con modos de acción bien definidos pueden ser una forma útil de explorar las conexiones entre los procesos celulares 38,39,40.

<table><tbody><tr><td>Ácido 2-yodobenzoico</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I7675-25G</td><td>Polvo corrosivo, irritante, de color amarillo claro a marrón anaranjado</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>109827-4L</td> líquido <td>inflamable, irritante, incoloro</td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>34851-4L</td> líquido <td>inflamable, irritante, incoloro</td></tr><tr><td>Placas de sílice con respaldo de aluminio</td><td>Sorbtech</td><td>4434126</td><td>gel de sílice XG F254 sobre placas con respaldo de aluminio</td></tr><tr><td>cloroformo-d</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>151823-50G</td><td>solvente para RMN</td></tr><tr><td>Espectrómetro de masas compacto</td><td>Advion-Interchim</td><td>Advion CMS</td><td>espectrómetro de masas compacto equipado con fuente APCI y sonda de análisis de sólidos atmosféricos</td></tr><tr><td>Corning Costar 96 placas de fondo plano de pozos-estéril</td><td>fisher chemical</td><td>07-200-90</td><td>para ensayos de sinergia/antagonismo</td></tr><tr><td>cubreobjetos</td><td>fisher chemical</td><td>12-547</td><td>para microscopía</td></tr><tr><td>Ciclohexanocarboxaldehído</td><td>CHEM-IMPEX INT'L INC.</td><td>24451</td><td>líquido inflamable, irritante, incoloro a rosado</td></tr><tr><td>Isocianuro de ciclohexilo</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>133302-5G</td><td>irritante, líquido incoloro, olor extremadamente desagradable</td></tr><tr><td>Ciclohexilamina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>240648-100ML</td><td>corrosivo, inflamable, irritante, líquido incoloro a menos que esté contaminado</td></tr><tr><td>Acetato de etilo</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>537446-4L</td><td>inflamable, irritante, incoloro </td></tr><tr><td>cartucho de sílice flash líquida (12g)</td><td>Advion-Interchim</td><td>PF-50SIHP-F0012</td><td>paquete de columnas de sílice flash (12g) para la purificación de masarimycina</td></tr><tr><td>formaldehído</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F8775-25ML</td><td>agente fijador para microscopía</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H8651-25G</td><td>tampón para solución de fijación de microscopía</td></tr><tr><td>Hexano, mezcla de isómeros</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>178918-4L</td><td>perjudicial para el medio ambiente, inflamable, irritante, peligroso para la salud, líquido incoloro</td></tr><tr><td>Espectrómetro de masas compacto de alto rendimiento</td><td></td><td>Sonda</td><td>de análisis de sólidos atmosféricos (ASAP), baja resolución</td></tr><tr><td>High Vac</td><td>eppendorf</td><td>Vacufuge plus</td><td>vacío asistido por la fuerza centrífuga y la temperatura</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>258148-2.5L</td><td>corrosivo, irritante, incoloro</td></tr><tr><td>ácido clorhídrico</td><td>líquido SIGMA-ALDRICH</td><td>320331-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>aceite de inmersión</td> en ácido fuerte <td>fisher chemical</td><td>12-365-19</td><td>para microscopía</td></tr><tr><td>Yodo, cristales resublimados</td><td>Alfa Aesar</td><td>41955</td><td>perjudicial para el medio ambiente, irritante, peligro para la salud, gris oscuro/púrpura cristales</td></tr><tr><td>Mestre Mnova</td><td>MestreLab Research</td><td></td><td>software para el procesamiento de espectros de RMN</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>439193-4L</td><td>inflamable, tóxico, peligro para la salud, líquido incoloro</td></tr><tr><td>azul de metileno</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M9140-25G</td><td>Tinción microscópica para la tinción de paredes celulares</td></tr><tr><td>Placas de agar Meuller-Hinton + 5% de sangre de oveja</td><td>Fisher Química</td><td>B21176X</td><td>medios de crecimiento para Streptococcus pneumoniae</td></tr><tr><td>Caldo Meuller-Hinton</td><td>fisher chemical</td><td>DF0757-17-6 medio de</td> crecimiento para portaobjetos de microscopio por <td>Streptococcus pneumoniae</td></tr><tr><td></td><td>fisher chemical</td><td>22-310397</td><td>para microscopía</td></tr><tr><td>estación de laboratorio de síntesis por microondas</td><td>MILESTONE</td><td>START SYNTH</td><td>dispositivo que requiere la ventilación de una campana de gases, equipado con carrusel de síntesis</td></tr><tr>tubos de<td>RMN SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>Z562769-5EA</td><td>Tubos de RMN de 5 mm 600 MHz</td></tr><tr><td>Resonancia Magnética Nuclear (RMN)</td><td>Bruker</td><td>Ascend 400</td><td>imán superconductor grande (400MHz)</td></tr><tr><td>Optocina</td><td>Fisher Químico</td><td>AAB21627MC</td><td>clorhidrato de etilhidrocupreína placas de</td></tr><tr><td>Petrie</td><td>Celltreat</td><td>229695</td><td>para la preparación de placas de agar para el crecimiento bacteriano</td></tr><tr><td>Microscopio de campo claro/contraste de fase Primo Star con cámara ERc5s</td><td>Zeiss</td><td></td><td>para estudios de morfología</td></tr><tr><td>puriFlash</td><td>interchim</td><td>XS520plus</td><td>sistema de purificación por cromatografía flash</td></tr><tr><td>resazurin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>R7017-1G</td><td>para ensayos de sinergia/antagonismo</td></tr><tr><td>evaporador rotativo</td><td>Heidolph</td><td>Hei-VAP Value "The Collegiate"</td><td>evaporador de disolvente</td></tr><tr><td>bicarbonato de sodio</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S6014-500G</td><td>irritante, blanco polvo</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>fisher químico</td><td>S271-1</td><td>cristalino, incoloro</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S5886-500G</td><td>para el crecimiento de B.subtilis y la preparación de medios LB</td></tr><tr><td>Sulfato de sodio</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>7985592-500G</td><td>anhidro, granular,</td></tr><tr><td>triptona</td> blanca <td>fisher químico</td><td>BP1421-500</td><td>para el crecimiento de B.subtilis y preparación de medios LB</td></tr><tr><td>Whitney DG250 Workstation</td><td>Microbiology International</td><td>DG250</td><td>estación de trabajo anaeróbica. Mezcla de gases anaeróbicos utilizada: 5% de hidrógeno, 10% de dióxido de carbono, extracto de levadura de nitrógeno de equilibrio</td></tr><tr><td></td><td>fisher chemical</td><td>BP1422-500</td><td>para el crecimiento de B.subtilis y preparación de medios LB</td></tr><tr><td>Zen Lite (azul) software</td><td>Zeiss</td><td></td><td>para la adquisición de micrografías</td></tr></tbody></table>

síntesis de masarimicina, un inhibidor de molécula pequeña del crecimiento bacteriano grampositivo

Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth

El peptidoglicano (PG) en la pared celular de las bacterias es una estructura macromolecular única que confiere forma y protección del entorno circundante. Un elemento central para comprender el crecimiento y la división celular es el conocimiento de cómo la degradación de PG influye en la biosíntesis y el ensamblaje de la pared celular. Recientemente, se ha reportado el etiquetado metabólico de PG a través de la introducción de azúcares o aminoácidos modificados. Si bien es posible el interrogatorio químico de pasos biosintéticos con inhibidores de moléculas pequeñas, las herramientas de biología química para estudiar la degradación de PG por autolisinas están subdesarrolladas. Las autolisinas bacterianas son una amplia clase de enzimas que están involucradas en la degradación estrechamente coordinada de PG. Aquí, se presenta un protocolo detallado para preparar una sonda de molécula pequeña, masarimicina, que es un inhibidor de la N-acetilglucosaminidasa LytG en Bacillus subtilis, y el metabolismo de la pared celular en Streptococcus pneumoniae. Se proporciona la preparación del inhibidor a través de la síntesis orgánica clásica y asistida por microondas. Se presenta su aplicabilidad como herramienta para estudiar la fisiología Gram-positiva en ensayos biológicos.

La masarimicina es un inhibidor bacteriostático de molécula pequeña de B. subtilis y S. pneumoniae y se ha demostrado que inhibe la GlcNAcase LytG de acción exo-acción en B. subtilis35,37 y se dirige a la pared celular en S. pneumoniae37. La masarimicina se puede preparar de manera eficiente mediante la síntesis orgánica clásica o asistida por microondas con rendimientos en el rango del 55% al 70%. La sí...

Se presenta un protocolo detallado para preparar la masarimicina de diamida bacteriostática, una sonda de molécula pequeña que inhibe el crecimiento de Bacillus subtilis y Streptococcus pneumoniae al dirigirse a la degradación de la pared celular. Su aplicación como sonda química está demostrada en ensayos de sinergia/antagonismo y estudios morfológicos con B. subtilis y S. pneumoniae.

Síntesis de masarimicina, un inhibidor de molécula pequeña del crecimiento bacteriano grampositivo

Peptidoglycan (PG) in the cell wall of bacteria is a unique macromolecular structure that confers shape, and protection from the surrounding environment. ...

La masarimicina es uno de los pocos inhibidores de las autolisinas bacterianas que detiene el crecimiento de las células bacterianas. Se puede utilizar para investigar las diferencias entre la inactivación química y genética de las autolisinas, y proporciona un enfoque ortogonal de la genética para estudiar la fisiología bacteriana. La síntesis de masarimicina puede parecer desalentadora.Siga de cerca los pasos que se muestran. En caso de duda si un paso de reacción funcionó, confirme mediante cromatografía de capa delgada y los cambios en los valores de RF. Para comenzar, prepare una solución 0.1-molar de ciclohexilamina, ciclohexil carboxaldehído, ácido ortoyodobenzoico y ciclohexil isocianuro en metanol.Agregue la barra de agitación magnética, luego, mezcle cinco mililitros de ciclohexilamina y cinco mililitros de ciclohexil carboxaldehído en un matraz de fondo redondo tapado y coloque el matraz en un baño de arena en un agitador de placa caliente durante 30 minutos a 40 grados centígrados. Controle la temperatura con un termómetro colocado aproximadamente un centímetro por debajo de la superficie de arena. Después de 30 minutos, agregue cinco mililitros de ciclohexil isocianuro a la solución y revuelva durante 20 minutos adicionales a 50 grados centígrados.Luego, agregue cinco mililitros de ácido ortoyodobenzoico a la mezcla de reacción y continúe revolviendo a 55 grados Celsius durante tres a cinco horas. Después de tres horas de agitación, monitoree el progreso de la reacción periódicamente mediante cromatografía de capa delgada, o TLC, a intervalos de aproximadamente una hora. Considere la reacción completa cuando solo un punto con un factor de retención igual a 0.3 es visible en la placa TLC.Retire el disolvente en el evaporador rotatorio a presión reducida. Una vez que todo el metanol se evapore, disuelva el producto crudo seco en 30 mililitros de acetato de etilo y transfiéralo a un embudo separador. Extraiga acetato de etilo secuencialmente con ácido clorhídrico monomolar, agua, solución saturada de bicarbonato de sodio, agua nuevamente y solución de cloruro de sodio saturado, descartando las capas acuosas en cada extracción.Luego, retire la capa de acetato de etilo del embudo separador y recójala en un matraz Erlenmeyer. Agregue una espátula llena de sulfato de sodio anhidro para eliminar el agua residual del acetato de etilo. Filtre la solución seca de acetato de etilo a través de un papel de filtro número uno para eliminar el sulfato de sodio.Luego, lave el papel de filtro con una pequeña cantidad de acetato de etilo. La solución filtrada de acetato de etilo se evaporó a sequedad en un evaporador rotatorio a presión reducida para obtener masaromicina como aceite una vez que se retira todo el acetato de etilo. Disuelva el aceite de masarimicina en uno o dos mililitros de una solución de hexano a isopropanol 9: 1 y revuelva en una placa de agitación magnética hasta que todo el compuesto se disuelva.Para purificar la masarimicina disuelta, realice una cromatografía flash con una columna flash de sílice de fase normal de 12 gramos. Equilibre la columna flash con 10 volúmenes de columna de fase móvil con los instrumentos ajustados a un caudal de 15 mililitros por minuto. Una vez completado el equilibrio, extraiga la masarimicina disuelta con una jeringa de cinco mililitros.Conecte la jeringa directamente a la parte superior de la columna de flash equilibrado e inyecte la solución en la columna. Vuelva a conectar la columna cargada al sistema de cromatografía flash e inicie la elución del gradiente. Elute masarimycin desde la columna usando elución de gradiente hasta una concentración final de fase móvil de 10:90 hexano a isopropanol en 12 volúmenes de columna.Controlar la elución de masarimicina a través de la absorción a 230 y 254 nanómetros. Para el estudio de morfología, cultive bacillus subtilis 11774 en placas de agar LB a 37 grados Centígrados. En todos los experimentos posteriores, use células de segundo paso cultivadas en cinco mililitros de caldo LB hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance 1.A continuación, utilizando una pipeta, añadir masarimicina a los tubos de cultivo marcados tratados con una concentración final de 3,8 micromoles. Para los tubos de cultivo etiquetados como control, agregue un volumen equivalente de DMSO. Coloque las muestras en una incubadora a 37 grados centígrados durante 90 minutos con agitación a 150 RPM.Después de 90 minutos, fije químicamente los cultivos en una mezcla 1:10 de medios de cultivo y fije el amortiguador a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, use una pipeta para aplicar de 10 a 20 microlitros de las muestras fijadas químicamente a los portaobjetos de microscopio de vidrio y deje que se sequen al aire. Luego, fije con calor las muestras secas al aire calentando los portaobjetos de vidrio con un quemador Bunsen.Después de la fijación térmica, manche las muestras con 100 microlitros de azul de metileno al 0,1%. Después de una incubación de 10 minutos con la mancha, lave el exceso de tinte con agua destilada. Luego, caliente suavemente los toboganes teñidos a 60 grados Celsius en un horno durante 15 a 20 minutos para llevar las células a un plano focal común.Selle las muestras teñidas colocando un resbalón de la cubierta del microscopio sobre las células teñidas. Luego, selle los bordes con cemento de portaobjetos de microscopio. Coloque el portaobjetos sellado del microscopio en el escenario del microscopio y enfoque la imagen con un aumento de 100X mediante microscopía de campo brillante.Coloque una gota de aceite de inmersión en el portaobjetos del microscopio y enfoque el campo de visión con un aumento de 1000X. Adquirir micrografías utilizando una cámara conectada al microscopio y su software asociado. Adquiera imágenes utilizando la configuración automática de balance de blancos y apertura del software.La cromatografía flash permite una rápida purificación de masarimicina con alta pureza. Aquí se presenta la evaluación de la sinergia o antagonismo con el inhibidor de la ATPasa optoquina en S.pneumoniae. La concentración más baja del compuesto para inhibir el crecimiento bacteriano, indicada por el color azul, se considera el valor mínimo de concentración inhibitoria en presencia de un co-fármaco.En contraste, los pozos con color rosa indican crecimiento bacteriano. Los ensayos fenotípicos que utilizaron masarimicina a 0,75 veces las concentraciones inhibitorias mínimas demostraron un fenotipo similar a la salchicha para B.subtilis y un fenotipo aglutinante para S.pneumoniae. Preste atención a la temperatura de la reacción.Asegúrese de que la reacción se complete mediante el monitoreo con TLC. Este método se puede utilizar junto con antibióticos marcados con fluorescencia para investigar los cambios en la pared celular mediante microscopía.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

La biosíntesis heteróloga de la eritromicina A...

La lógica, la Plaza experimentales, y el potencial de la Biosíntesis heteróloga Producto Natural Con la eritromicina Complejo antibiótico producido a través de un<em&gt; E. coli</em

Aquí se presenta un protocolo detallado de (A) la identificación de un producto natural con actividad antibiótica, (B) la purificación del compuesto, (C) el primer modelo de su biosíntesis, (D) la secuenciación del genoma / -Minería y la ( E) verificación de la agrupación de genes biosintéticos.

A partir de un producto natural a su cluster biosintético Gen: Una demostración del uso de Polyketomycin Streptomyces diastatochromogenes Tü6028

Aquí se establece y se describe un protocolo de minería del genoma guiado por espectrometría de masas. Se basa en la información de la secuencia del genoma y el análisis LC-MS/MS y tiene como objetivo facilitar la identificación de moléculas a partir de extractos microbianos y vegetales complejos.

La minería del genoma guiada por espectrometría de masas como herramienta para descubrir nuevos productos naturales

Aquí, describimos un bioensayo utilizando bromuro de 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) para probar oximas espirocíclicas previamente sintetizadas.

Ensayo funcionalizado de síntesis y citotoxicidad del heterociclo espirocíclico

Los compuestos de tiofenesulfonamida son inhibidores potentes y específicos de los reguladores de detección LuxR /HapR que bloquean su actividad in vivo, evitando así la transcripción de genes de virulencia, motilidad y biopelículas. Este protocolo detalla cómo se sintetizan, modelan in silico y analizan in vivo estos compuestos para determinar su actividad frente a LuxR/HapR.

Síntesis y ensayo de inhibidores de detección de quórum Vibrio

La levadura de fisión se utiliza aquí como huésped heterólogo para expresar proteínas citoesqueléticas bacterianas como FtsZ y MreB como proteínas de fusión traduccional con GFP para visualizar su polimerización. Además, los compuestos que afectan a la polimerización se identifican mediante imágenes con un microscopio de fluorescencia.

La levadura de fisión como plataforma para el cribado de fármacos antibacterianos dirigidos a las proteínas del citoesqueleto bacteriano

Este estudio desarrolló un ensayo para el cribado de alto rendimiento contra Mycobacterium abscessus con una cepa doble reportera de reciente creación, utilizando fluorescencia y luminiscencia para evaluar rápidamente la viabilidad bacteriana. Este protocolo será relevante para los investigadores que buscan cribar nuevos fármacos contra esta bacteria resistente a los fármacos.

Desarrollo de ensayos para el cribado de fármacos de alto rendimiento contra micobacterias

Este protocolo introduce una metodología de cribado fluorométrico optimizada para identificar inhibidores naturales de productos o pequeñas moléculas en la síntesis de proteínas. Su viabilidad la hace adecuada tanto para la enseñanza de grado en técnicas de descubrimiento de fármacos como para su implementación en campañas de química medicinal.

Un protocolo basado en fluorescencia para el cribado preliminar de inhibidores de síntesis de proteínas de fuentes naturales

Este protocolo describe un método para producir y evaluar la actividad antimicrobiana y la citotoxicidad del péptido catiónico Mel4 y el mímico del péptido RK758. Al integrar síntesis química, expresión recombinante y ensayos funcionales estandarizados, proporciona un flujo de trabajo optimizado para la producción y prueba de péptidos y mimetizadores de pequeñas moléculas.

Producción y pruebas de péptidos antimicrobianos y sus imitadores

Aquí presentamos un protocolo para identificar posibles candidatos a fármacos antituberculosos mediante cribado fenotípico, que abarca la síntesis química de un compuesto de 4-aminoquinolina, la determinación de su concentración inhibitoria mínima frente a Mycobacterium tuberculosis y la evaluación de su citotoxicidad en líneas celulares de mamíferos.

Identificación de posibles candidatos anti-TB: Guía paso a paso para la síntesis, determinación de la CIM y evaluación de citotoxicidad en células mamíferas

Aprende la síntesis de masarimycin, un inhibidor de autolisinas bacterianas, para estudiar la fisiología microbiana con Bacillus subtilis y Streptococcus pneumoniae. Este protocolo reproducible facilita ensayos de sinergia y estudios morfológicos.

Síntesis de masarimicina, un inhibidor de molécula pequeña del crecimiento bacteriano grampositivo

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