Name: Imágenes confocales de alto rendimiento de trímeros de púas de SARS-CoV-2 conjugados con puntos cuánticos para rastrear la unión y la endocitosis en células HEK293T (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Aprende a visualizar la internalización de proteínas Spike de SARS-CoV-2 mediante puntos cuánticos conjugados en células HEK293T. Este método permite rastrear la unión al receptor hACE2 y la endocitosis para estudiar la entrada viral.

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Esta investigación fue apoyada en parte por el Programa de Investigación Intramuros del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales, NIH. El Laboratorio de Investigación Naval proporcionó fondos a través de su Instituto de Nanociencia interno. La preparación de reactivos se apoyó a través del fondo base NRL COVID-19.

La línea celular HEK293T utilizada en este estudio es una línea celular inmortalizada. No se utilizaron sujetos humanos o animales en este estudio.
1. Cultivo y siembra celular
<ol><li>Dentro de un gabinete de bioseguridad estéril, usando equipo de protección personal (incluidos guantes de laboratorio, bata de laboratorio y gafas de seguridad), prepare el medio de cultivo celular complementando el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco con suero bovino fetal (FBS) al 10%, penicilina / estreptomicina (P / S) y 250 μg / ml G418.<ol>
<li>Para 500 mL de medios, agregue 443.75 mL de DMEM, 50 mL de FBS, 5 mL de P/S y 1.25 mL de G418.</li>
		<li>Filtre a través de un matraz de filtro de 0,2 μm y mantenga la esterilidad para evitar la contaminación bacteriana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dentro de un gabinete de bioseguridad estéril, sembra el interior 60 pocillos de una placa de 96 pocillos negra, de fondo transparente, recubierta de poli-D-lisina con 20,000 células en 100 μL por pozo de medio de cultivo celular. Llene los 36 pocillos externos con 100 μL por pozo de solución salina tamponada con fosfato (PBS).<ol>
<li>Para contar las células, agregue 2 μL de naranja acridina y tinción de yoduro de propidio a 18 μL de suspensión celular.</li>
		<li>Cargue 10 μL de esta solución en un lado de una diapositiva de conteo de celdas.</li>
		<li>Repita los pasos 1.2.1. y 1.2.2. para cargar ambos lados de la diapositiva.</li>
		<li>Coloque la diapositiva en un contador de celdas automatizado.</li>
		<li>Seleccione el protocolo de conteo de fluorescencia y presione Count. Cuente ambos lados de la diapositiva y calcule el promedio de las dos densidades de células vivas.</li>
		<li>Para calcular el volumen de suspensión celular requerido, divida el número total de células necesarias por la densidad celular promedio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inspeccione los pozos después de la siembra bajo un microscopio de luz para asegurarse de que se haya logrado la densidad y distribución adecuadas.</li>
	<li>Incubar la placa durante la noche en una incubadora humidificada a 37 °C con un 5% de CO2.</li>
</ol>2. Tratamiento de células con QD-Spike
<ol><li>Preparar albúmina sérica bovina (BSA) al 0,1% diluyéndola en medios de imagen.<ol>
<li>Para 10 ml de medios de imagen, agregue 130 μL de BSA al 7,5% y mezcle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>En un reservorio o placa de ensayo de 12 pocillos, diluya el stock de 440 nM QD-Spike (SARS-CoV-2, Isolate USA-WA1/2020) a 20 nM utilizando BSA al 0,1% en medios de imagen.<ol>
<li>Para 1 pocillo de QD-Spike, agregue 2.27 μL de 440 nM QD-Spike a 47.73 μL de medios de imagen BSA al 0.1% para una concentración final de 20 nM.</li>
		<li>Para generar una dilución seriada de seis puntos 1:3 (por triplicado), agregue 14.26 μL de QD-Spike a 285.74 μL de medios de imagen BSA al 0.1% para hacer la concentración más alta de 20 nM. Agregue 100 μL de 20 nM QD-Spike a 200 μL de medios BSA al 0.1% para hacer la segunda dilución de 6.67 nM QD-Spike. Repita cuatro veces para generar los seis puntos de concentración.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usando un aspirador multicanal, retire todos los medios gastados de cada pozo. Con una pipeta multicanal, lavar una vez con soportes de imagen (100 μL/pocillo).</li>
	<li>Aspire 100 μL de medios de imagen y vuelva a agregar 50 μL/pocillo de solución QD-Spike.</li>
	<li>Incubar la placa durante 3 h en una incubadora humidificada a 37 °C con un 5% de CO2. Continúe con el paso 4.</li>
</ol>3. Fijación y tinción de núcleos
<ol><li>Dentro de un gabinete de bioseguridad estéril, usando equipo de protección personal (incluidos guantes de laboratorio, bata de laboratorio y gafas de seguridad), prepare paraformaldehído al 4% (PFA) en medios de imágenes BSA al 0.1%.</li>
	<li>Aspire 50 μL de QD-Spike de cada pozo y agregue 100 μL/pocillo de PFA al 4%.<ol>
<li>No deje que los pozos se sequen. Utilice una pipeta multicanal automatizada para evitar el secado de los pozos (recomendado).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar durante 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar tres veces con 1 solución salina tamponada con fosfato (PBS).</li>
	<li>Prepare el colorante nuclear de color rojo intenso diluyendo la solución madre de 5 mM a una dilución de 1:1000 en PBS.</li>
	<li>Aspire el PBS y vuelva a agregar 50 μL/pocillo de colorante nuclear diluido.</li>
	<li>Incubar durante 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavar tres veces con PBS.</li>
	<li>Tome una imagen de la placa o el sello con un sellador de placas para obtener imágenes en una fecha posterior. Guarde la placa a 4 °C. La fluorescencia debe ser estable durante varias semanas o más.</li>
</ol>4. Configuración de adquisición e imágenes
<ol><li>Inicie el software para la plataforma de imágenes. Encienda la plataforma de imágenes de alto contenido y la luz de la barra de estado debería estar encendida. Si la máquina no está conectada, el software entrará en modo de análisis sin conexión.</li>
	<li>Inicie sesión en la plataforma de imágenes.</li>
	<li>Cree un nuevo protocolo de adquisición.<ol>
<li>Seleccione Tipo de placa como placa de imagen inferior transparente de 96 pocillos. NOTA: La selección de la placa en el instrumento puede variar y se puede personalizar cargando las definiciones correctas de la placa que incluyen las dimensiones de la placa, como la altura, el ancho y otras distancias para definir el espaciado del pozo y los puntos focales.</li>
		<li>Seleccione Modo óptico como confocal y aumento como inmersión en agua 40x.</li>
		<li>Seleccione Binning como 1.</li>
		<li>Elija los canales y las longitudes de onda fluorescentes de excitación/emisión como se describe en los pasos 4.3.5-4.3.8. Tome una instantánea cuando se seleccione la configuración para ver la imagen y asegúrese de que la configuración sea adecuada. NOTA: El contraste de fase digital (DPC) permitirá la visualización de células vivas sin una mancha celular o tinte fluorescente. No se recomienda para células fijas.</li>
		<li>Seleccione el modo para DPC, como Alto contraste, para producir cuerpos celulares bien definidos. Tome una instantánea para confirmar que esta configuración es adecuada, como se ve en la ventana de la imagen.</li>
		<li>Seleccione el canal FITC para su uso con la línea celular ACE2-GFP que permite la visualización del tráfico ACE2 dentro de la célula.</li>
		<li>Para crear un canal personalizado para el canal QD, seleccione el menú desplegable triangular para el canal y elija la excitación en el rango de 405 nm y la emisión en el rango de 608 nm.</li>
		<li>Si se fijaron las células y se utilizó un tinte nuclear de color rojo intenso, seleccione el canal rojo lejano con una emisión superior a 630 nm para delinear aún más el cuerpo celular y actuar como una máscara celular.</li>
		<li>Seleccione un pozo con una señal QD citoplasmática fuerte para establecer el tiempo de exposición, la potencia del láser y la posición de altura Z. Siga los pasos de 4.3.10-4.3.13.</li>
		<li>Compruebe si la altura predeterminada produce una imagen en la que las celdas se encuentran en el plano focal deseado. Si los puntos endocitosados son el orgánulo objetivo, la posición Z será menor que si la membrana plasmática es el orgánulo objetivo.</li>
		<li>Elija un tiempo de exposición que produzca una imagen brillante con niveles de gris al menos tres veces mayores que la señal de fondo. Esto es típicamente entre 100 y 300 ms. A 20 nM, los niveles de gris deben ser de aproximadamente 6000 u.a.u. utilizando un tiempo de exposición de 200 ms y una potencia láser del 80%.</li>
		<li>Compruebe los niveles de gris haciendo clic con el botón derecho en la imagen producida con la función Instantánea en cada canal y seleccionando Mostrar intensidad. Luego, haga clic izquierdo en el objeto de interés o fondo para ver el nivel de gris de ese píxel.</li>
		<li>Ajuste la potencia del láser para ajustar la intensidad de los objetos de interés.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Guarde el protocolo de adquisición.</li>
	<li>Cambie a Ejecutar experimento e introduzca el nombre de la placa.</li>
	<li>Ejecute el experimento.</li>
</ol>5. Análisis de datos
<ol><li>Importe datos en el software de imágenes.<ol>
<li>Después de adquirir todas las imágenes, exporte las mediciones al software de imágenes. Esto requiere que se establezca un servidor y se cree una cuenta. Cree una pantalla para que los datos se exporten al software de imágenes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>En el software de imágenes, seleccione Análisis de imágenes para comenzar a crear el protocolo de análisis.</li>
	<li>Cargue las mediciones del experimento de imágenes haciendo clic con el botón derecho en el archivo en la lista de pantallas y haciendo clic en Seleccionar. El mapa de placas de los pozos fotografiados y sus campos asociados deben ser visibles en la esquina inferior izquierda de la ventana.</li>
	<li>Elija un pozo con puntos QD citoplasmáticos brillantes para comenzar la segmentación de la imagen.</li>
	<li>En el bloque de creación de imagen de entrada, seleccione Corrección de campo plano.</li>
	<li>Agregue el siguiente bloque de creación al protocolo seleccionando Buscar núcleos.<ol>
<li>Aquí, use el DPC o el canal rojo lejano como el marcador Nuclei.</li>
		<li>Seleccione primero el método que segmenta con precisión los objetos y, a continuación, ajuste la segmentación mediante el menú desplegable y ajustando los controles deslizantes. NOTA: Una buena segmentación define con precisión la región de interés (ROI) para el núcleo, la célula y las manchas. Solo los píxeles que son positivos para el marcador deben capturarse dentro de un ROI individual. Debe excluirse la señal de fondo. Si el fondo se captura en el ROI, se puede disminuir la sensibilidad del método o aumentar el umbral de intensidad para aumentar la rigurosidad del algoritmo de segmentación. Esto es aplicable a todos los bloques de creación de Buscar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A continuación, agregue el bloque de construcción Find Cytoplasm para identificar el citoplasma.<ol>
<li>En este caso, utilice el canal ACE2-GFP para la segmentación citoplasmática.</li>
		<li>Seleccione el método que mejor identifique el citoplasma de cada célula.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A continuación, agregue el bloque de construcción Buscar puntos para identificar el punto QD-Spike.<ol>
<li>Seleccione los núcleos como la población de ROI.</li>
		<li>Seleccione la celda como región de ROI. Esto captura la puncta dentro de toda la célula.</li>
		<li>Seleccione el método que mejor identifique la puntuación QD en cada celda.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una vez que todos los objetos de la imagen se hayan segmentado e identificado con precisión en este pozo, elija otros pozos para garantizar que los bloques de construcción y la configuración se puedan aplicar generalmente a los otros pozos y otras condiciones.</li>
	<li>Agregue las propiedades de calcular intensidad para todos los objetos segmentados (núcleos, citoplasma/células y manchas).</li>
	<li>Agregue las propiedades de cálculo de morfología para todos los objetos segmentados (núcleos, citoplasma/células y manchas).</li>
	<li>Agregue la opción Calcular propiedades de textura para todos los objetos segmentados (núcleos, citoplasma/células y manchas).</li>
	<li>Defina los resultados seleccionando los parámetros para cada población, incluidos los núcleos y las manchas. El número de objetos se puede utilizar como una medida indirecta de la viabilidad celular.</li>
</ol>6. Exportar datos
<ol><li>Haga clic en Análisis por lotes. Espere a que finalice el análisis antes de continuar con el siguiente paso (paso 6.2). NOTA: El análisis por lotes permite que el servidor de software de análisis de imágenes cargue el protocolo de análisis utilizando las mediciones seleccionadas para analizar los datos de forma remota.</li>
	<li>Exporte el conjunto de datos a un equipo local o unidad de red.<ol>
<li>Conecte el software de análisis de imágenes a una aplicación auxiliar en el equipo descargando y abriendo un archivo de conexión.</li>
		<li>Seleccione el tipo de archivo de resultados (.txt, .csv, .html o XML nativo).</li>
		<li>Elija la configuración de la carpeta de archivos con el menú desplegable.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Analiza los datos en una hoja de cálculo
<ol><li>Abra el archivo exportado. Si se trata de un archivo .csv, guárdelo como un formato de archivo .xls para habilitar el uso de tablas dinámicas. Si la ruta del archivo es demasiado larga, guarde el archivo .xls más arriba en la jerarquía de carpetas para evitar errores en el guardado.</li>
	<li>Agregue columnas a la hoja de cálculo que designen las condiciones para cada pozo. Por ejemplo, el tipo de célula, las variantes de QD-Spike, las concentraciones de QD-Spike, el tiempo de incubación, etc.</li>
	<li>Elija la función Tabla dinámica y cree la tabla utilizando las condiciones agregadas como filas y los parámetros medidos como columnas. Seleccione el cálculo para cada parámetro, es decir, Promedio, Desviación estándar, Mediana, Mín, Máx. o Recuento.</li>
	<li>Normalizar los datos para controlar las muestras, incluidos los QD no conjugados como 0% y la mayor concentración de QD-Spike como 100%. NOTA: Si evalúa la eficacia de inhibidores como los anticuerpos neutralizantes, normalice los datos a células tratadas solo con medios (100% de eficacia) y QD-Spike sin inhibidor (0% de eficacia).</li>
	<li>Trazar los datos en un software de gráficos.</li>
</ol>

<ol><li>Chazotte, B. Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChazotte%2C+B+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2011 (2), 5571(2011).</li>
<li>Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+activity+architectures+visualized-using+genetically+encoded+fluorescent+biosensors+to+map+the+spatial+boundaries+of+signaling+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).</li>
<li>Barroso, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Quantum dots in cell biology.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).</li>
<li>Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACE2%3A+Evidence+of+role+as+entry+receptor+for+SARS-CoV-2+and+implications+in+comorbidities%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities.</a> eLife. 9, 61390(2020).</li>
<li>Shang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+entry+mechanisms+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).</li>
<li>Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-Coronaviruses+use+lysosomes+for+egress+instead+of+the+biosynthetic+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">β-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway.</a> Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).</li>
<li>Buchser, W., et al. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuchser%2C+W+%22Assay+Guidance+Manual%22">Assay Guidance Manual</a>. Markossian, S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. (2012).</li>
<li>Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+profiling+for+drug+discovery%3A+due+for+a+machine-learning+upgrade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).</li>
<li>Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+properties+of+SARS-CoV-2+spike+protein%3A+potential+antivirus+drug+development+for+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).</li>
<li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+spike+protein+interacts+with+multiple+innate+immune+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%3A+the+preprint+server+for+biology%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors.</a> bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462(2020).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+assists+SARS-CoV-2+in+cell+entry+and+can+be+targeted+by+approved+drugs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro.</a> Cell Discovery. 6 (1), 80(2020).</li>
<li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+Is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li>
<li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+conformational+states+of+SARS-CoV-2+spike+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein.</a> Science. 369 (6511), New York, N.Y. 1586-1592 (2020).</li>
<li>Oh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meta-analysis+of+cellular+toxicity+for+cadmium-containing+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots.</a> Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).</li>
<li>Gorshkov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot-conjugated+SARS-CoV-2+spike+pseudo-virions+enable+tracking+of+angiotensin+Converting+enzyme+2+binding+and+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis.</a> ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).</li>
<li>Narayanan, S. S., Pal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregated+CdS+quantum+dots%3A+Host+of+biomolecular+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+the+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+together+with+virus+receptor+ACE2%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2.</a> Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).</li>
<li>Hildebrandt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+transfer+with+semiconductor+quantum+dot+bioconjugates%3A+A+versatile+platform+for+biosensing%2C+energy+harvesting%2C+and+other+developing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications.</a> Chemical Reviews. 117 (2), 536(2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

El método descrito en este artículo proporciona los pasos necesarios para obtener imágenes de QD funcionalizados en células humanas mediante microscopía confocal de alto rendimiento. Este método es más adecuado para las células donde la endocitosis es la principal vía de entrada viral en lugar de la actividad de TMPRSS2 y la fusión de membrana, ya que permite el estudio de la endocitosis del pico del SARS-CoV-2 y la endocitosis hACE2. Debido a la naturaleza del modelo QD y la etiqueta C-terminal His-tag en el trímero Spi...

La microscopía de fluorescencia permite a los investigadores observar el funcionamiento interno de la célula utilizando colorantes especializados1, proteínas fluorescentes codificadas genéticamente2 y nanopartículas fluorescentes en forma de puntos cuánticos (QD)3. Para la pandemia mundial del coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo de 2019 (SARS-CoV-2), los investigadores han empleado la microscopía de fluorescencia para comprender cómo el virus interactúa con la célula tanto en la membrana plasmática como en el citoplasma. Por ejemplo, los investigadores han podido obtener información sobre la unión de la proteína Espiga del SARS-CoV-2 en la superficie del virión a la enzima convertidora de angiotensina humana 2 (hACE2) en la superficie de las células humanas, la internalización posterior a través de la fusión en la membrana plasmática y la endocitosis del complejo proteico Spike:hACE24,5. También se han obtenido grandes conocimientos sobre la salida del SARS-CoV-2 de las células a través del lisosoma utilizando imágenes de fluorescencia celular, una característica única de los coronavirus que anteriormente se pensaba que ocurrían a través de la vesícula tradicional que brota del Golgi, como ocurre con muchos otros virus6. Un pilar de casi todos los aspectos de la investigación biológica, la técnica de microscopía de fluorescencia celular ha avanzado necesariamente en su amplitud y alcance de aplicaciones, desde imágenes de superresolución de animales enteros hasta imágenes multiparamétricas automatizadas de alto contenido para la detección de drogas. Aquí, la microscopía confocal automatizada de alto contenido se aplica al estudio de la entrada de células del SARS-CoV-2 utilizando QD fluorescentes conjugados con la proteína espiga viral.
El análisis de alto contenido de las imágenes generadas por las plataformas de imágenes biológicas permite una mayor extracción de valiosos conocimientos biológicos que los parámetros individuales, como la intensidad de todo el pozo, que se obtendría utilizando un lector de placas multimodal7. Al separar los objetos en un campo de visión utilizando algoritmos de segmentación automatizados, cada objeto o una población de objetos se puede analizar en busca de parámetros como la intensidad, el área y la textura en cada canal de fluorescencia disponible8. La combinación de muchas mediciones en conjuntos de datos multivariados es un enfoque útil para la elaboración de perfiles fenotípicos. Cuando se conoce el fenotipo deseado, como la internalización de QD en forma de puntcta, se pueden usar las mediciones relacionadas con puncta como el tamaño, el número y la intensidad para evaluar la eficacia de un tratamiento.
El software de análisis de imágenes de alto contenido basado en la nube puede acomodar una gran variedad de salidas de datos de instrumentos, incluida la plataforma de imágenes de alto contenido. Mediante el uso de un servidor basado en la nube para el almacenamiento de imágenes y el análisis en línea, el usuario puede cargar sus datos desde el instrumento de imágenes o desde la unidad de red donde se almacenan los datos. La parte de análisis del protocolo se lleva a cabo dentro del entorno de software en la nube, y los datos se pueden exportar en una variedad de formatos de archivo para la visualización de datos posteriores.
El virus SARS-CoV-2 está compuesto por proteínas no estructurales y no estructurales que ayudan en su ensamblaje y replicación. El pico del SARS-CoV-2 tiene dos dominios llamados S1 y S2, con S1 que contiene el dominio de unión al receptor responsable de las interacciones hACE2 en la membrana plasmática9. También se ha encontrado que Spike interactúa con otras moléculas en la membrana plasmática que pueden actuar como co-receptores además de hACE210,11. A lo largo de la secuencia de proteínas espiga y particularmente en la interfaz S1/S2, hay sitios de escisión de la proteasa que permiten la fusión en la membrana después de la serina proteasa transmembrana 2 (TMPRSS2)12. Se han producido varias proteínas recombinantes de pico de SARS-CoV-2 a partir de dominios de unión a receptores individuales, a S1, S2, S1 con S2 y trímeros de pico enteros de múltiples proveedores comerciales para su uso en actividades de investigación13.
En este trabajo, la superficie de los QD se funcionalizó con trímeros de pico recombinantes que contienen una etiqueta de histidina (QD-Spike). Los QD producidos por la Sección de Nanomateriales Ópticos del Laboratorio de Investigación Naval contienen un núcleo de seleniuro de cadmio y una carcasa de sulfuro de zinc14,15. El zinc en la superficie QD coordina los residuos de histidina dentro de la proteína recombinante para formar un QD funcionalizado que se asemeja a una partícula viral del SARS-CoV-2 en forma y función. La generación de las nanopartículas y la conjugación de proteínas se describió previamente utilizando el dominio de unión al receptor conjugado QD15. Este método describe las preparaciones de cultivo celular, el tratamiento QD, la adquisición de imágenes y el protocolo de análisis de datos que pueden guiar a un investigador en el estudio de la actividad del pico del SARS-CoV-2 en el contexto fisiológico de una célula humana.

<table><tbody><tr><td>32% Paraformaldehído</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>15714</td><td>Se utiliza para fijar células después del tratamiento con puntos cuánticos, concentración final 3,2% Se utiliza para estabilizar QDs en Optimem I y prevenir interacciones inespecíficas, concentración final 0,1%</td></tr><tr><td>7,5% Albúmina sérica bovina</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td>Se utiliza como colorante de viabilidad celular para el recuento de células de fluorescencia</td></tr><tr><td>Tinción de naranja acridina / yoduro de propidio</td><td>Logos Biosystems</td><td>F23001</td><td>Placas de micropocillos utilizadas para la siembra de células y el ensayo QD-Spike</td></tr><tr><td>Black clear bottom 96 placa bien recubierta con poli-D-lisina</td><td>Greiner</td><td>655946</td><td>Se utiliza para apoyar el cultivo celular, suplemento DMEM</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino caracterizado</td><td>Cytiva/HyClone</td><td>SH30071.03</td><td>Software de análisis de imágenes de alto contenido basado en la nube; V2.9.1</td></tr><tr><td>Columbus Analyzer</td><td>Perkin Elmer</td><td>NA</td><td>Se utiliza para marcar núcleos y cuerpos celulares después de la fijación, colorante nuclear rojo intenso</td></tr><tr><td>DRAQ5 (5 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62252</td><td>Medios basales para cultivo HEK293T celular</td></tr><tr><td>Medios esenciales mínimos de Dulbecco, D-glucosa (4,5 g/L), L-glutamina, piruvato de sodio (110 mg/L), rojo fenol</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td>Se utiliza para organizar los datos después de la exportación desde Columbus; V2110 Microsoft 365</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>NA</td><td>Se utiliza para continuar la selección de células hACE2-GFP positivas, suplemento DMEM</td></tr><tr><td>G418</td><td>InvivoGen</td><td>ant-gn-5</td><td>Expresión estable de la línea celular de riñón embrionario humano enzima convertidora de angiotensina humana 2 marcada con GFP</td></tr><tr><td>HEK293T hACE2-GFP</td><td>Codex Biosolutions</td><td>CB-97100-203</td><td>Contador de células automatizado</td></tr><tr><td>Luna Contador de células automatizado</td><td>Logos Biosystems</td><td>NA</td><td>Se utiliza para el recuento de células de fluorescencia</td></tr><tr><td>Diapositivas de recuento de células Luna</td><td>Logos</td><td>Biosystems L12001</td><td>Plataforma de imágenes de alto contenido</td></tr><tr><td>Opera Phenix</td><td>Perkin Elmer</td><td>NA</td><td>Medios de imagen, utilizados para incubar células con puntos cuánticos</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Medio de suero reducido</td><td>Gibco</td><td>11058-021</td><td>Solución salina tamponada con fosfato sin calcio ni magnesio utilizada para lavar las células durante el paso y el ensayo</td></tr><tr><td>PBS -/-</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>Se utiliza para prevenir la contaminación bacteriana del cultivo celular, suplemento de DMEM</td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Se utiliza para gráficos, visualización de datos y análisis estadístico; V9.1.0</td></tr><tr><td>Prisma</td><td>GraphPad</td><td>NA</td><td>Se utiliza para analizar la unión de la espícula del SARS-Cov-2 a la hACE2 y monitorear la endocitosis de la espiga</td></tr><tr><td>Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)</td> <td>hecho a medida por el Laboratorio de Investigación Naval</td><td></td><td>Utilizado para la inhibición de la unión de la espícula del SARS-Cov-2 a hACE2</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Anticuerpo neutralizante de la espícula, ratón Mab</td><td>Sino Biológico</td><td>40592-MM57</td><td>Se utiliza para disociar las células del matraz durante el paso</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-010</td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes confocales de alto rendimiento de trímeros de púas de sars-cov-2 conjugados con puntos cuánticos para rastrear la unión y la endocitosis en células hek293t

High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

El desarrollo de nuevas tecnologías para la microscopía de fluorescencia celular ha facilitado métodos de detección de alto rendimiento para el descubrimiento de fármacos. Los puntos cuánticos son nanopartículas fluorescentes con excelentes propiedades fotofísicas imbuidas de fotoluminiscencia brillante y estable, así como de bandas de emisión estrechas. Los puntos cuánticos son de forma esférica, y con la modificación adecuada de la química de la superficie, se pueden utilizar para conjugar biomoléculas para aplicaciones celulares. Estas propiedades ópticas, combinadas con la capacidad de funcionalizarlas con biomoléculas, las convierten en una excelente herramienta para investigar las interacciones receptor-ligando y el tráfico celular. Aquí, presentamos un método que utiliza puntos cuánticos para rastrear la unión y endocitosis de la proteína espiga del SARS-CoV-2. Este protocolo se puede utilizar como una guía para los experimentalistas que buscan utilizar puntos cuánticos para estudiar las interacciones proteína-proteína y el tráfico en el contexto de la fisiología celular.

Tras el tratamiento, los QD se internalizarán ya que la nanopartícula se unirá a ACE2 en la membrana plasmática e inducirá endocitosis. Utilizando una línea celular que expresa ACE2-GFP, la translocación de QDs y ACE2 se puede visualizar utilizando microscopía de fluorescencia. Una vez internalizadas, las dos señales QD y ACE2 muestran una fuerte colocalización. A partir de estas imágenes, se puede realizar la segmentación de imágenes y el análisis posterior para extraer parámetros relevantes como el recuento de puntos (...

En este protocolo, los puntos cuánticos conjugados con el pico recombinante del SARS-CoV-2 permiten que los ensayos basados en células monitoreen la unión del pico a hACE2 en la membrana plasmática y la posterior endocitosis de las proteínas unidas al citoplasma.

Imágenes confocales de alto rendimiento de trímeros de púas de SARS-CoV-2 conjugados con puntos cuánticos para rastrear la unión y la endocitosis en células HEK293T

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

Hemos establecido una tecnología de plataforma para SARS COVID 2 que puede ser aplicable a otros virus con el reconocimiento y la entrada de células mediadas por Spike como el primer paso en la infección viral celular. Los puntos cuánticos son brillantes, estables y su superficie se puede funcionalizar para una variedad de aplicaciones celulares. Usando este método, podemos visualizar y medir la internalización de Spike en las células.Preparar 0.1%BSA. Agregue 130 microlitros de 7.5% BSA a 10 mililitros de medios de imagen en mezcla. Para una dilución en serie de 6.1 a tres y triplicado, agregue 14.26 microlitros de QD Spike a 285.74 microlitros del 0.1% BSA para hacer la concentración más alta de 20 nanomoles.Luego agregue 100 microlitros de 20 nanomoles o QD Spike a 200 microlitros de 0.1% BSA para hacer el segundo engaño de 6.67 nanomoles QD Spike. Retire todos los medios gastados de cada pozo con un aspirador multicanal, lave una vez con una pipeta multicanal con 100 microlitros de medios de imagen por pozo, luego aspire 100 microlitros del medio de imagen. Agregue 50 microlitros de solución QD Spike por pozo e incube la placa durante tres horas en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.Usando equipo de protección, prepare medios de imágenes 4% PFA y 0.1% PSA dentro de un gabinete de bioseguridad estéril, aspire 50 microlitros de QD Spike de cada pozo y agregue 100 microlitros de 4% PFA por pozo con una pipeta multicanal automatizada para evitar el secado de los pozos. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente, luego lavar tres veces con PBS, preparar el tinte nuclear de color rojo intenso diluyendo la solución madre de cinco milímetros de uno a 1000 en PBS, aspirar el PBS y agregar 50 microlitros de tinte nuclear diluido por pozo. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego lavar tres veces con PBS, obtener una imagen de la placa o sellarla con un sellador de placas para obtener imágenes más tarde.Guarde el plato a cuatro grados centígrados. Inicie el software para la plataforma de imágenes. Después de iniciar sesión en la plataforma de imágenes, cree un nuevo protocolo de adquisición seleccionando el tipo de placa como una placa de imagen inferior transparente de 96 paredes, el modo óptico seleccionado se ha centrado y la ampliación como 40 veces la inmersión en agua, seleccione el binning como uno.Seleccione el modo para contrastes faciales digitales, como alto contraste, para producir cuerpos celulares bien definidos. Tome una instantánea para confirmar que este encabezado es apropiado como se ve en la ventana de la imagen, seleccione el canal C adecuado para usar con la línea celular ACE2-GFP para visualizar el tráfico ace2 dentro de la celda. Para hacer un canal QD personalizado, seleccione el menú desplegable del triángulo y elija la excitación en el rango de 405 nanómetros en emisión en el rango de 608 nanómetros, seleccione un pozo con una señal QD citoplasmática robusta para establecer el tiempo de exposición, la potencia del láser y la posición de altura Z.Compruebe si la altura predeterminada produce una imagen de las celdas en el plano focal deseado. La posición Z será más baja para la endocita puntiaguda que la posición Z para la membrana plasmática. Elija un tiempo de exposición, generalmente entre 100 y 300 milisegundos que produzca una imagen brillante con niveles de gris, al menos tres veces mayores que la señal de fondo.A 20 nanomoles, los niveles de gris deben ser de aproximadamente 6.000 unidades atómicas con un tiempo de exposición de 200 milisegundos y una potencia láser del 80%. Verifique los niveles de gris haciendo clic derecho en la imagen producida con la función de instantánea en cada canal y seleccionando la intensidad del espectáculo, luego haga clic izquierdo en el objeto de interés o fondo para ver el nivel de gris de ese píxel, ajuste la potencia del láser para ajustar la intensidad de los objetos de interés. Guarde el protocolo de adquisición, cambie para ejecutar el experimento e ingrese el nombre de la placa, ejecute el experimento.La translocación tanto de QDs como de ACE2 se visualizó mediante microscopía de fluorescencia y una línea celular de expresión de ACE2-GFP. Se realizó segmentación de imágenes y posterior análisis para extraer parámetros relevantes como el conteo de puntos. Primero, los núcleos se segmentaron del canal de marcadores nucleares para crear una población de ROI.A continuación, una región de ROI que describe la celda con segmentado utilizando el canal ACE2-GFP. Por último, los puntos de pico QD 608 se segmentaron de la región de ROI celular, las señales QD y ACE2 internalizadas mostraron una fuerte colocalización. Se realizó un experimento de respuesta de concentración con seis concentraciones diferentes de QD Spike en células HEK 293T.Al determinar las concentraciones ópticas de QD, QDS se puede usar tan bajo como 2.22 nanomoles, sin embargo, se recomienda usar concentraciones de 10 nanomoles o más para garantizar una respuesta robusta. Durante la conjugación a la agregación de proteínas QD puede ocurrir. Los agregados se detectaron en la solución de QD como precipitados agrupados brillantes y células HEK 293T, los QD se incubaron con anticuerpos neutralizados a partir de 30 microgramos por microlitro antes de la adición a las células, estos anticuerpos bloquearon la internalización de la unión y causaron una reducción en el recuento de puntos en comparación con las células tratadas solo con QD.Este ensayo también se puede utilizar para el cribado de alto rendimiento, la evaluación principal de anticuerpos neutralizantes para identificar antivirales de juego de palabras para bloquear la entrada viral y adaptarse para estudiar nuevas variantes emergentes.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Neisseria meningitidis (Nm), una gram negativos humanos específicos de patógenos respiratorios, se puede unir a humanos α-actinina. Aquí se presenta un protocolo para la visualización de la colocalización de la bacteria intracelular de α-actinina después de la entrada de bacterias en las células endoteliales microvasculares cerebrales (HBMECs).

La visualización y cuantificación de interacciones intracelulares de Neisseria meningitidis Humanos y α-actinina de imagen confocal

Source: Tran, B. N., et. al. High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the use of quantum dot–conjugated spike protein (QD-Spike) to visualize dose-dependent viral entry in ACE2-GFP–expressing cells. Confocal imaging captures the internalization of QD-Spike via receptor-mediated endocytosis, modeling early coronavirus entry.

Visualizing Dose-Dependent Spike Protein Uptake with Quantum Dot Conjugates

Este video demuestra la aplicación de la Reacción en Cadena de Hibridación (HCR)-Hibridación In Situ de Fluorescencia (FISH) para visualizar la distribución espacial del ARN subgenómico del SARS-CoV-2. La combinación de HCR con técnicas de inmunofluorescencia tiene el potencial de proporcionar información sobre las interacciones huésped-virus a nivel de una sola célula.

Uso de la hibridación in situ de fluorescencia de inmunoARN para visualizar el SARS-CoV-2

Este protocolo describe cómo utilizar la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para visualizar y rastrear receptores individuales en la superficie de las células vivas y, por lo tanto, analizar la movilidad lateral del receptor, el tamaño de los complejos de receptores, así como para visualizar las interacciones transitorias receptor-receptor. Este protocolo puede extenderse a otras proteínas de membrana.

De alta resolución espacio-temporal Análisis de la Dinámica del receptor por Casa molécula de microscopía de fluorescencia

Este protocolo describe un nuevo método que permite la visualización cuantitativa de la formación de complejos de proteínas SNARE, basado en la transferencia de energía de resonancia Förster y toda la vida de la fluorescencia microscopía de imágenes.

Visualizar el lazo intracelular del tráfico de por vida de fluorescencia microscopía de imágenes

Anticuerpos que se unen a los receptores de blanco en la superficie celular pueden conferir conformación y alteraciones clustering. Estos cambios dinámicos tienen implicaciones para caracterizar el desarrollo de fármacos en las células diana. Este protocolo utiliza la microscopia confocal y espectroscopia de la correlación de imagen a través de ImageJ/FIJI para cuantificar el grado de agrupamiento en la superficie celular del receptor.

Agregación del Receptor de superficie celular microscopia confocal revela a través espectroscopia de la correlación de imagen

Aquí, describimos un método simple que combina el hibridación in situ de la fluorescencia del ARN (RNA-PESCADO) con la inmunofluorescencia para visualizar el ARN agudo severo del coronavirus 2 del coronavirus del síndrome respiratorio (SARS-CoV-2). Este protocolo puede aumentar la comprensión de las características moleculares de las interacciones ARN-huésped SARS-CoV-2 a nivel unicelular.

Visualización Del SARS-CoV-2 Usando Inmuno ARN-Fluorescencia Hibridación In Situ

El protocolo descrito aquí describe un método rápido y efectivo para medir anticuerpos neutralizantes contra la proteína espiga del SARS-CoV-2 mediante la evaluación de la capacidad de las muestras de suero convaleciente para inhibir la infección por un virus de estomatitis vesicular marcada con proteína verde fluorescente mejorada pseudotipado con glicoproteína espiga.

Detección de anticuerpos neutralizantes del SARS-CoV-2 mediante imágenes fluorescentes de alto rendimiento de la infección por pseudovirus

Este protocolo describe la dinámica de las infecciones virales utilizando luciferasa y fluorescencia recombinante (r)SARS-CoV-2 y un sistema de imágenes in vivo (IVIS) en ratones transgénicos K18 hACE2 para superar la necesidad de enfoques secundarios necesarios para estudiar las infecciones por SARS-CoV-2 in vivo.

Imágenes en vivo y cuantificación de la infección viral en ratones transgénicos K18 hACE2 utilizando SARS-CoV-2 recombinante que expresa el reportero

Aquí, describimos un inmunoensayo fluorescente multiplex recientemente desarrollado que utiliza un sistema citométrico de flujo de doble reportero para detectar simultáneamente dos epítopos únicos de proteína de pico en partículas virales intactas del coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2) que habían sido capturadas por microesferas magnéticas acopladas a la enzima convertidora de angiotensina-2.

Perfil de epítopos de proteínas de superficie en partículas virales mediante la estrategia Multiplex Dual-Reporter

Este protocolo detalla las aplicaciones avanzadas de imagen y la gestión de recursos compartidos de un sistema de microscopio confocal de barrido láser integrado con un detector de matriz multiplexada para imágenes celulares y subcelulares de alta resolución. El flujo de trabajo permite la obtención de imágenes multimodales desde confocal hasta superresolución (~120 nm) dentro de una sola plataforma, haciendo que la visualización a escala nanométrica sea más accesible.

Imagen de superresolución y gestión compartida: un protocolo para microscopía confocal con detección multiplex

Aprende a visualizar la internalización de proteínas Spike de SARS-CoV-2 mediante puntos cuánticos conjugados en células HEK293T. Este método permite rastrear la unión al receptor hACE2 y la endocitosis para estudiar la entrada viral.

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