Imágenes confocales de alto rendimiento de trímeros de púas de SARS-CoV-2 conjugados con puntos cuánticos para rastrear la unión y la endocitosis en células HEK293T

Hemos establecido una tecnología de plataforma para SARS COVID 2 que puede ser aplicable a otros virus con el reconocimiento y la entrada de células mediadas por Spike como el primer paso en la infección viral celular. Los puntos cuánticos son brillantes, estables y su superficie se puede funcionalizar para una variedad de aplicaciones celulares. Usando este método, podemos visualizar y medir la internalización de Spike en las células.

Preparar 0.1%BSA. Agregue 130 microlitros de 7.5% BSA a 10 mililitros de medios de imagen en mezcla. Para una dilución en serie de 6.1 a tres y triplicado, agregue 14.26 microlitros de QD Spike a 285.74 microlitros del 0.1% BSA para hacer la concentración más alta de 20 nanomoles.

Luego agregue 100 microlitros de 20 nanomoles o QD Spike a 200 microlitros de 0.1% BSA para hacer el segundo engaño de 6.67 nanomoles QD Spike. Retire todos los medios gastados de cada pozo con un aspirador multicanal, lave una vez con una pipeta multicanal con 100 microlitros de medios de imagen por pozo, luego aspire 100 microlitros del medio de imagen. Agregue 50 microlitros de solución QD Spike por pozo e incube la placa durante tres horas en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.

Usando equipo de protección, prepare medios de imágenes 4% PFA y 0.1% PSA dentro de un gabinete de bioseguridad estéril, aspire 50 microlitros de QD Spike de cada pozo y agregue 100 microlitros de 4% PFA por pozo con una pipeta multicanal automatizada para evitar el secado de los pozos. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente, luego lavar tres veces con PBS, preparar el tinte nuclear de color rojo intenso diluyendo la solución madre de cinco milímetros de uno a 1000 en PBS, aspirar el PBS y agregar 50 microlitros de tinte nuclear diluido por pozo. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego lavar tres veces con PBS, obtener una imagen de la placa o sellarla con un sellador de placas para obtener imágenes más tarde.

Guarde el plato a cuatro grados centígrados. Inicie el software para la plataforma de imágenes. Después de iniciar sesión en la plataforma de imágenes, cree un nuevo protocolo de adquisición seleccionando el tipo de placa como una placa de imagen inferior transparente de 96 paredes, el modo óptico seleccionado se ha centrado y la ampliación como 40 veces la inmersión en agua, seleccione el binning como uno.

Seleccione el modo para contrastes faciales digitales, como alto contraste, para producir cuerpos celulares bien definidos. Tome una instantánea para confirmar que este encabezado es apropiado como se ve en la ventana de la imagen, seleccione el canal C adecuado para usar con la línea celular ACE2-GFP para visualizar el tráfico ace2 dentro de la celda. Para hacer un canal QD personalizado, seleccione el menú desplegable del triángulo y elija la excitación en el rango de 405 nanómetros en emisión en el rango de 608 nanómetros, seleccione un pozo con una señal QD citoplasmática robusta para establecer el tiempo de exposición, la potencia del láser y la posición de altura Z.

Compruebe si la altura predeterminada produce una imagen de las celdas en el plano focal deseado. La posición Z será más baja para la endocita puntiaguda que la posición Z para la membrana plasmática. Elija un tiempo de exposición, generalmente entre 100 y 300 milisegundos que produzca una imagen brillante con niveles de gris, al menos tres veces mayores que la señal de fondo.

A 20 nanomoles, los niveles de gris deben ser de aproximadamente 6.000 unidades atómicas con un tiempo de exposición de 200 milisegundos y una potencia láser del 80%. Verifique los niveles de gris haciendo clic derecho en la imagen producida con la función de instantánea en cada canal y seleccionando la intensidad del espectáculo, luego haga clic izquierdo en el objeto de interés o fondo para ver el nivel de gris de ese píxel, ajuste la potencia del láser para ajustar la intensidad de los objetos de interés. Guarde el protocolo de adquisición, cambie para ejecutar el experimento e ingrese el nombre de la placa, ejecute el experimento.

La translocación tanto de QDs como de ACE2 se visualizó mediante microscopía de fluorescencia y una línea celular de expresión de ACE2-GFP. Se realizó segmentación de imágenes y posterior análisis para extraer parámetros relevantes como el conteo de puntos. Primero, los núcleos se segmentaron del canal de marcadores nucleares para crear una población de ROI.

A continuación, una región de ROI que describe la celda con segmentado utilizando el canal ACE2-GFP. Por último, los puntos de pico QD 608 se segmentaron de la región de ROI celular, las señales QD y ACE2 internalizadas mostraron una fuerte colocalización. Se realizó un experimento de respuesta de concentración con seis concentraciones diferentes de QD Spike en células HEK 293T.

Al determinar las concentraciones ópticas de QD, QDS se puede usar tan bajo como 2.22 nanomoles, sin embargo, se recomienda usar concentraciones de 10 nanomoles o más para garantizar una respuesta robusta. Durante la conjugación a la agregación de proteínas QD puede ocurrir. Los agregados se detectaron en la solución de QD como precipitados agrupados brillantes y células HEK 293T, los QD se incubaron con anticuerpos neutralizados a partir de 30 microgramos por microlitro antes de la adición a las células, estos anticuerpos bloquearon la internalización de la unión y causaron una reducción en el recuento de puntos en comparación con las células tratadas solo con QD.

Este ensayo también se puede utilizar para el cribado de alto rendimiento, la evaluación principal de anticuerpos neutralizantes para identificar antivirales de juego de palabras para bloquear la entrada viral y adaptarse para estudiar nuevas variantes emergentes.