Name: Análisis de la dinámica de la actina, el acoplamiento del embrague y la fuerza de tracción para el avance del cono de crecimiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Aprende a analizar la dinámica de actina y fuerzas de tracción en conos de crecimiento neuronales usando microscopía de tracción y speckle. Este método permite estudiar mecanismos moleculares del avance neuronal.

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Esta investigación fue apoyada en parte por AMED bajo el número de subvención 21gm0810011h0005 (N.I. y Y.S.), JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) y JSPS Grants-in-Aid for Early-Career Scientists (JP19K16258, T.M.), la Osaka Medical Research Foundation for Incurable Diseases (T.M.), y NAIST Next Generation Interdisciplinary Research Project (Y.S.).

Los autores no tienen nada que revelar.

Los protocolos descritos en este estudio utilizan materiales disponibles comercialmente y equipos de microscopía que se encuentran rutinariamente en todos los laboratorios, institutos y universidades. Por lo tanto, los investigadores pueden adoptar fácilmente la actual microscopía de fuerza de tracción y imágenes de una sola mancha en sus estudios.
Las imágenes moteadas pueden analizar la polimerización de actina y el acoplamiento del embrague. Además, las imágenes moteadas pueden monitorear el flujo retrógrado de moléculas de embrague como shootin1 y cortactina, que interactúan con el flujo retrógrado de F-actina. Mediante el uso de un microscopio TIRF, también se puede monitorizar el flujo retrógrado de la molécula de adhesión celular L1-CAM23,41; L1-CAM se somete a comportamientos de agarre y deslizamiento que reflejan la eficiencia del acoplamiento del embrague23,41. Aunque el presente estudio emplea el sistema TMR-HaloTag para la obtención de imágenes moteadas, otras proteínas fluorescentes, como la EGFP y la proteína fluorescente roja monomérica, también están disponibles en el análisis16,18,20,23,24,27,39. Los elementos esenciales para visualizar las manchas de actina son un bajo nivel de expresión de actina fluorescente y la iluminación de un área mínima (Figura 2). En este protocolo, las señales Lifeact y HaloTag-actina se adquieren secuencialmente. Debido a que el flujo retrógrado de actina es relativamente lento (4,5 ± 0,1 μm/min)24, el análisis del flujo retrógrado de F-actina y la polimerización de actina no se ven afectados por la adquisición secuencial de imágenes de diferentes canales fluorescentes (intervalo de ~1 s). Lifeact es un marcador de actina F ampliamente utilizado, pero puede competir con las proteínas de unión a actina47. De mayor importancia, Lifeact puede alterar la dinámica de la actina, afectando así a las estructuras de la F-actina y a la morfología celular47,48,49.
La microscopía de fuerza de tracción puede detectar fuerzas para impulsar el avance del cono de crecimiento. Al montar las neuronas dentro de una matriz extracelular, los investigadores también pueden analizar las fuerzas generadas en un entorno semi-3D11. Las imágenes de alto aumento son importantes para la cuantificación precisa de la fuerza de tracción porque los conos de crecimiento generan fuerzas de tracción débiles7. Aunque también se utilizan otros métodos con nanopilares o biosensores sensibles al estrés para medir la fuerza de tracción50,51, el método basado en gel PAA es altamente adaptable y permite ajustar la rigidez del sustrato variando las concentraciones de acrilamida y bisacrilamida41,44,52. En este protocolo, el gel PAA se prepara a una concentración final de 3,75% de acrilamida y 0,03% de bis-acrilamida; El módulo de Young es ~270 Pa22 y esta rigidez está dentro del rango del tejido cerebral (100-10,000 Pa)53,54,55. Debido al grosor del gel PAA (~100 μm), este método limita el uso de lentes de alto aumento durante la microscopía. Para obtener imágenes de gran aumento, los investigadores deben usar la función de zoom en un microscopio confocal de barrido láser.
En conclusión, la actual imagen de motas y la microscopía de fuerza de tracción permiten análisis cuantitativos de los eventos clave en las generaciones de fuerza. Esta información será invaluable para mejorar la comprensión de los mecanismos que subyacen al avance y la navegación del cono de crecimiento.

En el cerebro de vertebrados en desarrollo, las neuronas se someten a migraciones elaboradamente organizadas y proyectan axones hacia socios sinápticos apropiados para establecer redes neuronales funcionales1,2,3. Los conos de crecimiento, que son estructuras sensoriales y móviles ubicadas en la punta de las neuritas, determinan la velocidad y la dirección de la migración neuronal y el crecimiento del axón3,4,5. Dado que las neuronas están rodeadas de ambientes apretados, los conos de crecimiento deben ejercer fuerzas contra su entorno para avanzar6,7. Para comprender los mecanismos subyacentes a la migración neuronal y la guía axonal, los análisis de la mecánica molecular para el avance del cono de crecimiento son esenciales.
Décadas de análisis han revelado que la fuerza de tracción para impulsar el avance del cono de crecimiento es generada por el mecanismo de 'embrague'; se cree que este mecanismo funciona no solo en el cono de crecimiento axonal, sino también en el cono de crecimiento del proceso principal de las neuronas migratorias8,9,10,11,12. Es decir, los filamentos de actina (F-actinas) en los conos de crecimiento polimerizan en el borde de ataque y se despolimerizan proximalmente, expulsando la membrana de vanguardia13,14,15. La fuerza resultante, junto con la contracción de la actomiosina, induce el movimiento hacia atrás de las F-actinas llamado flujo retrógrado7,11,16,17,18,19,20,21. Las moléculas de adhesión de embrague y célula median el acoplamiento mecánico entre el flujo retrógrado de F-actina y el sustrato adhesivo y transmiten la fuerza del flujo de F-actina sobre el sustrato, generando así fuerza de tracción para el avance del cono de crecimiento7,8,9,11,12,22 . Al mismo tiempo, el acoplamiento actina-sustrato reduce la velocidad de flujo F-actina y convierte la polimerización de actina en la fuerza para sobresalir de la membrana de vanguardia9,10.
Los conos de crecimiento axonales detectan señales químicas locales y las transducen en una fuerza motriz direccional para la navegación del cono de crecimiento3,23,24,25. Por ejemplo, una molécula de guía axónica netrin-1 estimula su receptor eliminado en el cáncer colorrectal (DCC) y activa las proteínas de unión a rho guanosina trifosfato (GTP) proteína de control de división celular 42 (Cdc42) y el sustrato 1 de toxina botulínica C3 relacionada con Ras (Rac1), y su quinasa 1 activada por quinasa p21 aguas abajo (Pak1)26. Cdc42 y Rac1 promueven 1) la polimerización de actina, y Pak1 fosforila una molécula de embrague shootin122,26. Shootin1 interactúa con el flujo retrógrado de F-actina a través de una proteína cortactina de unión a actina27. Shootin1 también interactúa con la molécula de adhesión celular L1 (L1-CAM)20,24. La fosforilación de Shootin1 aumenta las afinidades de unión para cortactina y L1-CAM, y mejora el acoplamiento de embrague 2) mediado por shootin124,27. Dentro del cono de crecimiento, las activaciones asimétricas de la polimerización de actina y el acoplamiento del embrague aumentan 3) la fuerza de tracción en el lado de la fuente netrin-1, generando así una fuerza motriz direccional para el giro del cono de crecimiento (Figura 1)24. La investigación intensiva en las últimas décadas con respecto a la migración neuronal y la guía de axones ha mejorado la comprensión de las moléculas de guía, sus receptores y las cascadas de señalización aguas abajo asociadas2,10,28,29,30. Sin embargo, las maquinarias moleculares para generar fuerzas para el avance del cono de crecimiento apenas están comenzando a dilucidarse; esto puede atribuirse al uso limitado de los protocolos para los análisis mecanobiológicos.
El presente estudio describe un protocolo detallado para el monitoreo del flujo retrógrado de F-actina mediante imágenes de una sola mota16,18. El monitoreo del flujo retrógrado de F-actina se ha realizado ampliamente utilizando microscopía de superresolución, microscopía confocal de disco giratorio y microscopía de fluorescencia de reflexión de interferencia total (TIRF)25,31,32,33,34,35,36,37,38 . El protocolo del presente estudio, sin embargo, utiliza un microscopio de epifluorescencia estándar y, por lo tanto, es fácilmente adoptable11,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42. Cuando se combina con el etiquetado de F-actina de Lifeact43, la imagen de una sola mota permite cuantificar la tasa de polimerización de actina y la eficiencia de acoplamiento del embrague entre el flujo retrógrado de F-actina y el sustrato adhesivo39,42. El presente estudio describe además un protocolo detallado de microscopía de fuerza de tracción utilizando un gel de poliacrilamida (PAA) incrustado en perla fluorescente11,22,23,24,27,39,41,42,44. Este método detecta y cuantifica la fuerza de tracción bajo el cono de crecimiento mediante el monitoreo de los movimientos de perlas inducidos por la fuerza44,45. Se proporciona un código de análisis de fuerza de tracción de código abierto y se explica en detalle el método para cuantificar la fuerza de tracción durante la migración del cono de crecimiento. Con la ayuda de imágenes de una sola mancha y microscopía de fuerza de tracción, se facilitará la comprensión de la mecánica molecular subyacente a la migración y navegación del cono de crecimiento. Estas técnicas también son aplicables para analizar la mecánica molecular subyacente al agrandamiento de la columna dendrítica, que se sabe que es importante en el aprendizaje y la memoria42.

<table><tbody><tr><td>Solución de tinción azul de tripano al 0,5%</td><td>Nacalai</td><td>29853-34</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropiltrimetioxisilano</td><td>Sigma</td><td>281778-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Monómero de acrilamida</td><td>Nacalai</td><td>00809-85</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Cytiva</td><td>17-1311-1</td><td></td></tr><tr><td>Axio Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td>431007-9902-000</td><td>Microscopio de epifluorescencia ( Imagen de una sola mancha)</td></tr><tr><td>Suplemento B-27 (50x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino albmina</td><td>Sigma</td><td>A7906-10G</td><td></td></tr><tr><td>C-Apochromat 63x/1.2 W Corr</td><td>Zeiss</td><td>421787-9970-799</td><td>Lente objetivo (microscopía de fuerza de tracción)</td></tr><tr><td>Cubreobjetos (diámetro 18 mm)</td><td>Matsunami</td><td>C018001</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Nacalai</td><td>16806-25</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>Paquete de software de código abierto</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr> <tr><td>FluoSpheres modificado con carboxilato 0,2 mm, rojo (580/605), 2% sólido</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F8810</td><td>modificado con carboxilato microesferas</td></tr><tr><td>Plato con fondo de vidrio (14 mm de diámetro)</td><td>Matsunami</td><td>D1130H</td><td></td></tr><tr><td>Plato con fondo de vidrio (27 mm de diámetro)</td><td>Matsunami</td><td>D1140H</td><td></td></tr><tr><td>Solución de glutaraldehído</td><td>Sigma</td><td>G5882-10X10ML</td><td></td></tr><tr><td>Ligtando HaloTag TMR</td><td>Promega</td><td>G8251</td><td></td></tr><tr><td>HBO103 W/2</td><td>Lámpara Osram</td><td>4050300382128</td><td>Mercury (una sola mota imagen)</td></tr><tr><td>Image Processing Toolbox</td><td>MathWork</td><td>https://www.mathworks.com/products/image.html</td><td></td></tr><tr><td>Solución de laminina del tumor EHS de ratón</td><td>Wako</td><td>120-05751</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s L-15 medio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Nacalai</td><td>16919-42</td><td></td></tr><tr><td>LSM710</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>Microscopio láser conforcal (microscopía de fuerza de tracción)</td></tr><tr><td>MATLAB2018a</td><td>MathWork</td><td>https://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html</td><td></td></tr><tr><td>Mouse C57BL/6</td><td>Japan SLC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kit de nucleoefecto de neurona de ratón</td><td>Lonza</td><td>VPG-1001</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina (TEMED)</td><td>Nacalai</td><td>33401-72</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-metilenebisacrilamida</td><td>Nacalai</td><td>22402-02</td><td></td></tr><tr><td>Medio neurobasal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector I</td><td>Amaxa</td><td>AAD-1001 Aparato de</td><td>electroporación</td></tr><tr><td>ORCA Flash 4.0 V2</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td>CMOS camera (single speckle imaging)</td></tr><tr><td>Papain</td><td>Nacalai</td><td>26036-34</td><td></td></tr><tr><td>Parallel Computing Toolbox</td><td>MathWork</td><td>https://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-C1</td><td>Clontech</td><td>1528177</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (100x)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>pFN21A-HaloTag-actina</td><td>(Minegishi et al., 2018)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7.4 (10x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 100x/1.4 Aceite</td><td>Zeiss</td><td>420790-9901-000</td><td>Lente objetivo (imágenes de una sola mancha)</td></tr><tr><td>pmNeonGreen-N1-Lifeact</td><td>(Kastian et al., 2021)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Hidrobromuro de poli-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Slulfo-SAMPHA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio</td><td>Nacalai</td><td>08933-05</td><td></td></tr><tr><td>Hidrato de sodio (NaOH)</td><td>Nacalai</td><td>31511-05</td><td></td></tr><tr><td>Bola de acero</td><td>Sako tekkou</td><td>N/A</td><td>Microshpere para determin la rigidez del gel de PAA. 0,6 mm de diámetro, 7,87 g/cm3.</td></tr><tr><td>ZEN2009</td><td>Zeiss</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td><td>Software de adquisición de imágenes (microscopía de fuerza de tracción)</td></tr><tr><td>ZEN2012</td><td>Zeiss</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td><td>Software de adquisición de imágenes (imágenes de una sola mancha)</td></tr></tbody></table>

análisis de la dinámica de la actina, el acoplamiento del embrague y la fuerza de tracción para el avance del cono de crecimiento

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

Para establecer redes funcionales, las neuronas deben migrar a sus destinos apropiados y luego extender los axones hacia sus células objetivo. Estos procesos dependen de los avances de los conos de crecimiento que se encuentran en las puntas de las neuritas. Los conos de crecimiento axonal generan fuerzas motrices al detectar su microambiente local y modular la dinámica citoesquelética y el acoplamiento actina-adhesión (acoplamiento de embrague). Décadas de investigación han llevado a la identificación de moléculas de guía, sus receptores y cascadas de señalización aguas abajo para regular la migración neuronal y la guía axonal; sin embargo, las maquinarias moleculares requeridas para generar fuerzas para impulsar el avance del cono de crecimiento y la navegación apenas están comenzando a dilucidarse. En el borde delantero de los conos de crecimiento neuronal, los filamentos de actina experimentan un flujo retrógrado, que es impulsado por la polimerización de actina y la contracción de actomiosina. Un acoplamiento de embrague entre el flujo retrógrado de F-actina y el sustrato adhesivo genera fuerzas de tracción para el avance del cono de crecimiento. El presente estudio describe un protocolo detallado para monitorear el flujo retrógrado de F-actina mediante imágenes de una sola mota. Es importante destacar que, cuando se combina con un marcador de actina F Lifeact, esta técnica puede cuantificar 1) la tasa de polimerización de F-actina y 2) la eficiencia de acoplamiento del embrague entre el flujo retrógrado de F-actina y el sustrato adhesivo. Ambas son variables críticas para generar fuerzas para el avance y la navegación del cono de crecimiento. Además, el presente estudio describe un protocolo detallado de microscopía de fuerza de tracción, que puede cuantificar 3) la fuerza de tracción generada por los conos de crecimiento. Por lo tanto, al acoplar los análisis de imágenes de una sola mancha y microscopía de fuerza de tracción, los investigadores pueden monitorear la mecánica molecular subyacente al avance y la navegación del cono de crecimiento.

Imágenes de una sola mota para cuantificar la tasa de polimerización de actina y la eficiencia de acoplamiento del embrague Una expresión de Lifeact alta permite la visualización de F-actina dentro del cono de crecimiento; una expresión baja de HaloTag-actina permite el monitoreo del flujo retrógrado de F-actina (Figura 3, Archivo Suplementario 2). El rastreo de las manchas de actina permite medir la velocidad del flujo de F-actina (Figura 3C, D). Dado que el acoplamiento mecánico del flujo retrógrado de F-actina y el sustrato adhesivo reduce la velocidad de flujo de F-actina, la eficiencia de acoplamiento del embrague se puede estimar a partir de la velocidad. Además, el etiquetado de F-actina con Lifeact ayuda a la visualización de la extensión de F-actina y es útil para cuantificar la tasa de polimerización de actina (Figura 3E, F).
Análisis cuantitativo de la fuerza de tracción El estricto cumplimiento de la metodología presentada aquí revelará los movimientos de las perlas fluorescentes bajo el cono de crecimiento (Figura 6C, Archivo Suplementario 4). El flujo retrógrado de F-actina sobre el sustrato genera fuerza de tracción haciendo que las perlas fluorescentes se muevan hacia atrás debajo del cono de crecimiento. El código de análisis de fuerza de tracción estima la fuerza de tracción a partir del desplazamiento de perlas fluorescentes y expresa la fuerza de tracción calculada como vector de fuerza. La dirección y la magnitud de la fuerza de tracción se determinan a partir de las componentes x e y del vector de fuerza (Figura 8C, D). El cuadro rojo de la Figura 8D representa las componentes x e y de un vector de fuerza; La Figura 8C muestra el cono de crecimiento correspondiente. En términos de coordenadas x-y, el vector apunta a -93.8° contra el eje x; esta orientación se dirige hacia la parte posterior del cono de crecimiento (Figura 8C). La magnitud de la fuerza de tracción F se calculó de la siguiente manera:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63227/63227eq02.jpg">
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig01.jpg"> Figura 1: Una maquinaria de cono de crecimiento para la generación de fuerza y la navegación de conos de crecimiento. Un gradiente quimioatrayente netrin-1 induce la estimulación asimétrica de su receptor DCC en un cono de crecimiento axonal. Esto activa Rac1 y Cdc42, y su quinasa aguas abajo Pak1. Rac1 y Cdc42 promueven (1) la polimerización de actina, mientras que Pak1 fosforila shootin1, mejorando el acoplamiento de embrague mediado por shootin1 (2). La activación asimétrica de la dinámica de la actina y el acoplamiento del embrague dentro del cono de crecimiento aumenta (3) la fuerza de tracción en el lado de la fuente netrin-1, generando así una fuerza motriz direccional para la atracción del cono de crecimiento. Los protocolos presentados aquí permiten la cuantificación de las variables clave (1)-(3) para la navegación del cono de crecimiento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig02.jpg"> Figura 2: Imágenes de fluorescencia de un cono de crecimiento neuronal debajo de un diafragma completamente abierto y estrecho. El cono de crecimiento expresa Lifeact y HaloTag-actina. (A) Una alta expresión de Lifeact permite la visualización de la morfología del cono de crecimiento. Por otro lado, los niveles de expresión de HaloTag-actina son muy bajos, con señales tenues cuando el diafragma está completamente abierto. (B) Cuando el diafragma se estrecha adecuadamente, las señales de fondo disminuyen y aparecen manchas de actina única en el cono de crecimiento. Barras de escala: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2.jpg"> Figura 3: Pasos para cuantificar la velocidad del flujo de F-actina y la tasa de polimerización de actina utilizando un software de procesamiento y análisis de imágenes Fiji. (A) Ajuste el ángulo de la imagen para el análisis. (1) Busque y seleccione una mancha de actina (punta de flecha) que fluya en un haz de actina F. (2) Seleccione Imagen &gt; Transformar &gt; Rotar. (3) Establezca el ángulo de modo que el fibrado de actina F se dirija hacia arriba. (4) Se cambiará el ángulo de la imagen. B) Demarcar la región, incluidas las motas de actina y el haz de actinas F. (1) Haga clic en Rectángulo en la barra de herramientas. (2) Delinear una región en la imagen. El brillo y el contraste de la imagen se incrementan para permitir una visualización clara de la mancha de actina y la punta del haz de F-actina. (3) Seleccione Imagen &gt; Duplicar. (4) Ingrese los cinco marcos de tiempo que muestran el flujo de motas de actina en el fibrado de actina F. (5) La imagen de pila seleccionada aparecerá en la pantalla. (C) Círculos superpuestos en la mota de actina. (1) Haga clic en Óvalo en la barra de herramientas. (2) Dibuja un círculo en una mota de actina. (3) Seleccione Imagen &gt; superposición &gt; Agregar selección. (4) El círculo está superpuesto. 5) Repita la superposición de los círculos en las manchas de actina restantes. (D) Medir la distancia de translocación de las motas de actina durante los cinco marcos de tiempo. (1) Haga clic en Recto en la barra de herramientas. (2) Dibuja una línea que vincule los centros de los círculos. (3) Seleccione Analizar &gt; medir. El resultado, indicado por el parámetro Altura (cuadro rojo), retransmite la distancia de translocación de la mancha de actina. (E) Medir el cambio en la longitud de la protuberancia de la F-actina durante los cinco marcos de tiempo. (1) Dibuje una línea que vincule las puntas de la protuberancia de la F-actina. (2) Seleccione Analizar &gt; medir. El resultado (cuadro rojo), Altura, indica la longitud de extensión del haz de F-actina. (F) La tasa de polimerización de actina se calcula a partir de la suma de la velocidad de flujo de F-actina y la tasa de extensión. Véase también el Expediente Complementario 2. El Archivo Suplementario 3 ayuda a los investigadores a practicar la metodología descrita anteriormente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig04.jpg"> Figura 4: Pasos para la preparación del gel PAA. Consulte el paso 7.1 para obtener una descripción detallada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig05.jpg"> Figura 5: Determinación de la rigidez del gel PAA. (A) Un método de indentación de microesferas. Cuando se coloca una microesfera sobre un gel PAA incrustado en perla fluorescente, el peso de la microesfera causa una hendidura en el gel. La profundidad de indentación se calcula restando las posiciones z de la superficie del gel PAA del fondo de las imágenes de fluorescencia de la microesfera (B, C) de un gel PAA sangrado por una microesfera y que contiene perlas fluorescentes. Se utilizó un microscopio confocal de barrido láser para capturar imágenes de la superficie del gel (B) y el fondo de la microesfera (C). Las señales de las perlas fluorescentes no son visibles en la superficie del gel en la región con sangría (B, círculo). Sin embargo, se pueden observar en el fondo de la microesfera. Barras de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig06.jpg"> Figura 6: Mapeo de fuerza de un cono de crecimiento neuronal. (A-C) Imágenes de fluorescencia de perlas incrustadas en un gel PAA y un cono de crecimiento neuronal visualizado con EGFP. Después de la adquisición de imágenes de lapso de tiempo (A), la neurona se liberó del sustrato del gel mediante la aplicación de solución SDS, y se capturó una imagen de las perlas en el sustrato no entrenado (B). (C) La imagen de las cuentas en el sustrato no tensado muestra las cuentas en sus posiciones originales (verde) y desplazadas (rojo). La señal EGFP del cono de crecimiento se muestra en azul. Los kymographs (derecha) muestran los movimientos de las cuentas a intervalos de 3 s durante una duración de 147 s, indicados por las flechas en las áreas en caja 1 y 2. La cuenta en el área 2 es una cuenta de referencia. Barras de escala: 2 μm para (A), (B) y (C, izquierda), y 1 μm para (C, centro). Véase también el Expediente Suplementario 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig07.jpg"> Figura 7: Pasos para corregir la posición x-y de la imagen de la cuenta en sustrato no entrenado usando Fiji. (A) Concatenar la imagen de la cuenta en sustrato no forzado con la imagen de pila de lapso de tiempo de cuentas fluorescentes. (1) Seleccione Pilas de &gt; de imágenes &gt; herramientas &gt; Concatenar. (2) Seleccione la imagen de cuentas en sustrato no forzado y la imagen de pila de lapso de tiempo de cuentas fluorescentes en Image1 e Image2, respectivamente. Haga clic en Aceptar. (3) La imagen de perla en el sustrato no entrenado se agrega a la imagen de pila de lapso de tiempo. (B) Corrija la posición x-y de la imagen de la cuenta fluorescente. (1) Utilice la barra de desplazamiento (marco rojo) para seleccionar el segundo fotograma (flecha roja) en la pila de imágenes. (2) Seleccione Plugins &gt; StackReg. (3) Seleccione Cuerpo rígido en la lista desplegable (marco rojo) y haga clic en Aceptar. Comenzará la corrección de la posición x-y. (C) Guarde la imagen de cuenta corregida por la posición x-y. Después de seleccionar el primer fotograma de la imagen de pila corregida por posición x-y, (1) seleccione Imagen &gt; Duplicar. (2) ingrese 1 en el Rango y anule la selección de Duplicar pila. Luego haga clic en Aceptar. (3) la imagen de la cuenta corregida por la posición x-y en el sustrato sin tensión aparecerá en la pantalla. Guarde esta imagen como un archivo tiff. El Archivo Suplementario 6 ayuda a los investigadores a practicar la metodología descrita anteriormente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig08.jpg"> Figura 8: Análisis de la fuerza de tracción bajo un cono de crecimiento neuronal utilizando un código de análisis de fuerza de tracción de código abierto. (A) GUI para analizar la fuerza de tracción. Las imágenes de lapso de tiempo seleccionadas en la GUI se pueden confirmar desde la lista desplegable y con el control deslizante indicado (cuadro rojo). (B) Seleccione una región que incluya el cono de crecimiento. (1) Haga clic en ROI en la GUI. Con el cursor del ratón, especifique dos puntos (puntas de flecha) en la imagen de celda. (2) Aparecerá un cuadro rojo en la imagen de la celda. Dos clics determinan las ubicaciones de dos esquinas. (C) Seleccione las cuentas detectadas (puntos blancos) debajo del cono de crecimiento. (1) En la GUI, haga clic en Seleccionar cuentas y demarque una región poligonal que incluya el cono de crecimiento haciendo clic. Presione la tecla Intro . (2) Los puntos blancos dentro de la región poligonal cambiarán a un color rojo. (D) Resultados calculados de la dirección y magnitud de la fuerza de tracción. El cuadro rojo de la hoja de cálculo representa los componentes x e y del vector de fuerza, estimados mediante análisis de fuerza de tracción. En la coordenada x-y en el panel derecho, el vector de fuerza generado por el cono de crecimiento apunta a -93.8° contra el eje x; esta orientación se dirige hacia la parte posterior del cono de crecimiento en (C). El Archivo Suplementario 6 ayuda a los investigadores a practicar la metodología descrita anteriormente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo suplementario 1: Recetas de soluciones y medios utilizados en este estudio. Consulte el texto para un uso detallado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%201-63227R1.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo suplementario 2: Imágenes de fluorescencia de Lifeact e imágenes de manchas fluorescentes de HaloTag-actina en un cono de crecimiento nervioso. Lifeact (verde) y HaloTag-actina (magenta). Las imágenes se adquirieron cada 3 s para una duración total de 147 s. Barra de escala: 2 μm. Consulte también la Figura 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%202.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo suplementario 3: Datos de práctica para cuantificar la velocidad del flujo de F-actina y la tasa de polimerización de actina. Una imagen de pila de lapso de tiempo multicanal de Lifeact (verde) y HaloTag-actina (magenta). Véase también la Figura 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/Supplemental%20file%203.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo suplementario 4: Un video de mapeo de fuerza que detecta la fuerza de tracción en un cono de crecimiento neuronal. Las posiciones originales (verde) y desplazadas (rojo) de las cuentas. La señal EGFP en el cono de crecimiento se muestra en azul. Las imágenes se adquirieron cada 3 s durante 147 s. Barra de escala: 2 μm. Véase también la Figura 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%204.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Expediente suplementario 5: Código de análisis de la fuerza de tracción. Consulte el paso 8.12 para obtener un uso detallado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20file%205.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Expediente suplementario 6: Datos de práctica para cuantificar la fuerza de tracción. Una imagen RGB de un solo canal de las perlas en sustrato sin tensión e imágenes RGB de pila de lapso de tiempo de un solo canal de cuentas fluorescentes bajo un cono de crecimiento, EGFP y campo brillante. Véanse también las figuras 7 y 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20file%206.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Para avanzar, los conos de crecimiento deben ejercer fuerzas de tracción contra el entorno externo. La generación de fuerzas de tracción depende de la dinámica de la actina y el acoplamiento del embrague. El presente estudio describe métodos para analizar la dinámica de la actina, el acoplamiento del embrague y las fuerzas de tracción para el avance del cono de crecimiento.

Análisis de la dinámica de la actina, el acoplamiento del embrague y la fuerza de tracción para el avance del cono de crecimiento

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...

El análisis de acoplamiento de imágenes de una sola mancha y la fuerza de tracción microscópica puede analizar maquinarias moleculares para el avance y la navegación del cono de crecimiento. Como las técnicas utilizan materiales disponibles comercialmente y microscopios estándar. Los investigadores pueden adaptarse literalmente a las técnicas de sus estudios.Comience por tratar las neuronas con tetrametil-rodamina o ligando TMR a una dilución de uno a 2000 en medio de cultivo en el día in vitro 3. Luego mantenga las neuronas a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante una hora. Después de la incubación, lave el ligando TMR tres veces con PBS precalentado.Retire el PBS antes de agregar 0,5 mililitros de medio L-15 de Leibovitz calentado en las neuronas. Mantenga las neuronas a 37 grados centígrados durante una hora. A continuación, encienda un microscopio de epifluorescencia y ajuste la incubadora superior del estado a 37 grados centígrados.Luego, coloque las neuronas tratadas con ligando TMR en el plato inferior de vidrio en la incubadora superior del escenario calentado. Establezca los parámetros de adquisición de imágenes, como el tiempo de exposición en 500 milisegundos para un canal de fluorescencia Lifeact y HaloTag-actina y el binning como 0,065 micras por 0,065 micras por píxel en un intervalo de tiempo de tres segundos durante 50 fotogramas. Después de seleccionar un cono de crecimiento que expresa fuertemente Lifeact y semanalmente expresa HaloTag-actina.Cierre el campo en el diafragma para iluminar un área mínima que incluya el cono de crecimiento y adquiera imágenes de lapso de tiempo. En el día in vitro 3, reemplace el medio de cultivo con 0,5 mililitros de medio L-15 de Leibovitz calentado y mantenga las neuronas durante una hora a 37 grados centígrados. Para la microscopía de fuerza de tracción, encienda un microscopio confocal de barrido láser y ajuste la incubadora superior del escenario a 37 grados centígrados.Coloque las neuronas en el plato inferior de vidrio en la incubadora superior de etapa preadvertida. Establezca los parámetros de adquisición de imágenes como se describe en el script de menú y seleccione un cono de crecimiento que exprese fuertemente la proteína de fluorescencia verde mejorada o EGFP. Concéntrese en la superficie del gel y adquiera imágenes de lapso de tiempo.Cuando haya terminado, utilice un software de procesamiento de imágenes para producir pilas de imágenes RGB de lapsos de tiempo de un solo canal. A continuación, guarde las imágenes como archivos tiff. A continuación, aplique 100 microlitros de 10% en peso por volumen de dodecil sulfato de sodio o SDS disuelto en agua destilada al plato con fondo de vidrio para relajar el sustrato del gel liberando neuronas del sustrato.Luego incube el plato en la incubadora superior del escenario durante cinco minutos a 37 grados centígrados para estabilizar la temperatura. En el microscopio confocal de barrido láser, concéntrese en la superficie del gel para adquirir una imagen de las perlas en el sustrato no forzado. Produzca una imagen RGB de un solo canal de las cuentas en el sustrato sin restricciones y guarde esta imagen como un archivo tiff.Descargue el código de análisis de fuerza de tracción TFM2021 y abra TFM2021 en MATLAB. Abrir principal. m en TFM2021 y ejecutarlo.Cuando aparece una interfaz gráfica de usuario en la pantalla. Haga clic en cargar imagen de sustrato sin entrenar y seleccione la imagen de cuenta corregida de posición X-Y en el sustrato sin forzar. Vaya a cargar imágenes de cuentas fluorescentes y seleccione la pila de lapso de tiempo de cuentas de imagen.Luego haga clic en cargar imágenes de campo brillante para elegir la imagen de pila de lapso de tiempo de campo brillante y use cargar imágenes GFP para seleccionar la imagen de pila de lapso de tiempo de EGFP. En la lista desplegable de la interfaz gráfica de usuario, seleccione GFP antes de hacer clic en ROI para especificar la región rectangular de interés, incluido el cono de crecimiento, haciendo clic en dos puntos de la imagen de celda mostrada. Una vez hecho esto, haga clic en el botón Guardar en la interfaz gráfica de usuario para guardar las imágenes de pila seleccionadas junto con el ROI en un archivo mat.A continuación, haga clic en detectar en el lugar e ingrese el valor deseado en el cuadro de diálogo para determinar un umbral para la detección de cuentas. Presione OK para comenzar el cálculo. Después de finalizar el cálculo, haga clic en trazar pista para ampliar la región seleccionada anteriormente y mostrar las cuentas detectadas como puntos blancos.Utilice cuentas seleccionadas para demarcar una región poligonal que incluya los puntos correctos debajo del cono de crecimiento. Luego, al presionar enter en el teclado, los puntos blancos dentro de la región poligonal cambiarán a rojo. Haga clic en estimar la fuerza en la interfaz gráfica de usuario.Luego ingrese valores para el tamaño de píxel y el módulo de Young como se explica en el manuscrito. Ponga el valor de la relación de Poisson como 0.3 y ejecute la fuerza de estimación para iniciar el cálculo. El software guardará los resultados del cálculo en un archivo de formato de hoja de cálculo.Las imágenes de fluorescencia de un cono de crecimiento neuronal mostraron una alta expresión de Lifeact que permite la visualización de la morfología del cono de crecimiento bajo un diafragma completamente abierto y estrecho. Los niveles de expresión de HaloTag-actina fueron muy bajos con señales tenues. Cuando el diafragma se estrecha adecuadamente, las señales de fondo disminuyen y aparecen un solo acto en las manchas en el cono de crecimiento.Los investigadores que logren adecuadamente todos los pasos observarán el flujo retrógrado de F-actina en el cono de crecimiento. La rigidez del gel de poliacrilamida se determinó calculando la profundidad de la hendidura causada por el peso de la microesfera. Se utilizó un microscopio confocal de barrido láser para capturar imágenes de la superficie del gel y el fondo de la microesfera.Las señales de las perlas fluorescentes no eran visibles en la superficie del gel en la región con sangría. Las imágenes de fluorescencia de las perlas incrustadas en el gel de poliacrilamida y el cono de crecimiento neural, mostraron las perlas en su origen y posiciones desplazadas. También se observó la señal EGFP del cono de crecimiento.Los kymographs mostraban los movimientos de la cuenta en comparación con una cuenta de referencia. Al realizar una sola imagen de motas, es importante seleccionar una neurona que exprese semanalmente cómo actuar bajo dos un área mínima. Al realizar una microscopía de fuerza de tracción, las imágenes de alto aumento son importantes para una concentración precisa de la fuerza de tracción.

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Neurociencia

Un método para visualizar y cuantificar la F-actina fines de púas en los conos de crecimiento neuronal se describe. Después de las neuronas de cultivo en cubreobjetos de vidrio, las células se permeabilized con una solución de saponina que contiene. A continuación, un corto de incubación con el tampón de saponina que contiene rodamina-actina incorpora actina fluorescente en los extremos de actina de púas libre.

Etiquetado de la F-actina Finaliza púas con Rodamina-actina en permeabilizadas Conos de Crecimiento Neuronal

Rigidez mecánica en el microambiente tumoral juega un papel fundamental en el impulso de comportamiento maligno mediante el aumento de la actividad invadopodios y actomyosin contractilidad. Geles de poliacrilamida utilizando (PaaS), ensayos de invadopodios y de la fuerza de tracción se pueden utilizar para estudiar las propiedades invasivas y contráctiles de las células cancerosas en respuesta a la matriz rigidez.

Los geles de poliacrilamida para invadopodios y Fuerza de tracción Ensayos sobre las células cancerosas

Presentamos una solución de software para el seguimiento semi-automatizado de la concentración relativa de proteínas a lo largo de la longitud de protrusiones celulares dinámicas.

Una interfaz gráfica de usuario para el seguimiento asistido por software de la concentración de proteínas en protones dinámicos celulares

Describimos cómo técnicas de micro - y Fotomanipulación como FRAP y fotoactivación permiten la determinación de los parámetros de motilidad y la dinámica espacio-temporal de las proteínas a migración de las células. Lecturas experimentales incluyen la dinámica subcelular y facturación de los reguladores de la motilidad o subyacente del citoesqueleto de actina.

Técnicas de micromanipulación que permite el análisis de las dinámicas morfogenéticas y facturación de los reguladores citoesqueléticos

En este protocolo, presentamos los procedimientos experimentales de un ensayo de propagación celular que se basa en microscopía de células vivas. Proporcionamos una herramienta computacional de código abierto para la segmentación imparcial de células etiquetadas fluorescentemente y análisis cuantitativos de dinámicas de lamellipodia durante la propagación celular.

Análisis cuantitativo de la dinámica del borde celular durante la propagación celular

Aquí se presenta un protocolo integral para realizar experimentos ultrarrápidos de abrazadera de fuerza en motores de miosina-5 procesuales, que podrían extenderse fácilmente al estudio de otras clases de motores de proceso. El protocolo detalla todos los pasos necesarios, desde la configuración del aparato experimental hasta la preparación de muestras, la adquisición de datos y el análisis.

Disección de las propiedades mecanoenzimáticas de miosinas procesivas con espectroscopia ultrarrápida de pinza de fuerza

Aquí, presentamos un protocolo para reconstituir haces de microtúbulos in vitro y cuantificar directamente las fuerzas ejercidas dentro de ellos utilizando trampeo óptico simultáneo y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Este ensayo permite la medición a nivel nanométrico de las fuerzas y desplazamientos generados por los conjuntos de proteínas dentro de las redes de microtúbulos activos.

Medición directa de las fuerzas dentro de haces de microtúbulos activos reconstituidos

Presentamos protocolos para ensayos microfluídicos de filamentos de actina simples, en combinación con microscopía de fluorescencia, que permiten monitorear con precisión filamentos de actina individuales en tiempo real mientras se exponen secuencialmente a diferentes soluciones de proteínas.

Uso de microfluídica y microscopía de fluorescencia para estudiar la dinámica de ensamblaje de filamentos y haces de actina única

Este artículo presenta protocolos para la ingeniería y caracterización de redes compuestas tridimensionales sintonizables de filamentos de actina coentrelazados y microtúbulos. Los compuestos experimentan una reestructuración activa y movimiento balístico, impulsado por motores de miosina II y quinesina, y están sintonizados por las concentraciones relativas de actina, microtúbulos, proteínas motoras y reticulantes pasivos.

Reconstitución y caracterización de compuestos de actina-microtúbulos con dinámica y mecánica accionada por motor sintonizable

Este protocolo describe cómo producir cometas de actina en las superficies de las perlas utilizando ingredientes proteicos disponibles comercialmente. Tales sistemas imitan las estructuras protrusivas que se encuentran en las células, y se pueden utilizar para examinar los mecanismos fisiológicos de la producción de fuerza de una manera simplificada.

Reconstitución de la motilidad basada en actina con proteínas disponibles comercialmente

Este protocolo describe un ensayo de movilidad de perlas con colas de cometa de actina ajustable para investigar cuantitativamente cómo la actividad del motor de miosina influye en el ensamblaje de actina ramificada y en la arquitectura de la red en una interfaz similar a una membrana.

Reconstitución del ensamblaje de actina ramificada mediado por miosina I en un ensayo de motilidad de colas de cometa de actina basado en microesferas

Aprende a analizar la dinámica de actina y fuerzas de tracción en conos de crecimiento neuronales usando microscopía de tracción y speckle. Este método permite estudiar mecanismos moleculares del avance neuronal.

Análisis de la dinámica de la actina, el acoplamiento del embrague y la fuerza de tracción para el avance del cono de crecimiento (Video) | JoVE Journal

Análisis de la dinámica de la actina, el acoplamiento del embrague y la fuerza de tracción para el avance del cono de crecimiento

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