Los ensayos ACT1-CUP1 determinan las sensibilidades específicas del sustrato de los mutantes espliceosomales en levaduras en ciernes

El ensayo ACT1-CUP1 puede identificar si una mutación afecta el empalme de ARN premensajero y dar una indicación de qué paso de empalme se ve más afectado. El ensayo ACT1-CUP1 vincula la mutación del factor de empalme con su impacto en el complejo proceso de empalme. Utiliza la lectura simple del fenotipo de crecimiento y tiene un amplio rango de sensibilidad.

El uso eficiente del tiempo es importante cuando se lleva a cabo un ensayo ACT1-CUP1. Comience con un ensayo de cinco a 10 cepas para minimizar las aberraciones de crecimiento inducidas por el estrés. Demostrando el proceso seremos yo e Isabelle Marasigan, una investigadora de pregrado de mi laboratorio.

Para comenzar, agregue 790 miligramos de agar y una barra de agitación a cada botella. En un vaso de precipitados grande, prepare los medios de crecimiento de leucina para que se viertan todas las placas de cobre. Esto incluye 265 miligramos de base de nitrógeno de levadura, 64 miligramos de mezcla de gota, menos leucina y 34 mililitros de agua desionizada para cada plato que se verterá.

Revuelva para disolver Luego, agregue 34 mililitros de la solución de medios de crecimiento de leucina a cada botella preparada de 100 mililitros y cubra con papel de aluminio. A continuación, autoclave para esterilizar y disolver el agar, utilizando el ciclo líquido recomendado para el autoclave. Tan pronto como sea posible después del autoclave, agregue cuatro mililitros de glucosa al 20% a cada botella.

Luego, haga coincidir la etiqueta del tubo con la etiqueta de la botella para agregar las dos diluciones de mililitros de sulfato de cobre cada una a su botella prevista. Usando un plato de agitación, mezcle durante aproximadamente 30 segundos y vierta o pipete 35 mililitros en el plato etiquetado, evitando burbujas. Por cepa de levadura, agregue nueve mililitros de medios de crecimiento de leucina y un mililitro de 20% de glucosa a un tubo cónico estéril de 50 mililitros.

Usando un palillo estéril, o punta de pipeta, reúna una pequeña muestra de levadura e inocule el medio. Luego, agite todos los cultivos durante la noche a 180 RPM y 30 grados centígrados. A continuación, agregue 100 microlitros de cultivo a una cubeta, que contenga 900 microlitros de agua por cepa.

Después, mida la densidad óptica con un espectrofotómetro y calcule la dilución requerida para estar a una densidad óptica de 0.5 en un volumen final de dos mililitros. Luego, diluya cada cepa a una densidad óptica de 0.5 en 10% de glicerol y vuelva a medir la densidad óptica para confirmar que la densidad celular está dentro del rango deseado. Después de configurar un lugar de trabajo estéril, encienda un quemador Bunsen.

Para un replicador de 48 pines, pipetea 200 microlitros de cada cepa diluida en un pocillo separado de una placa de 96 pocillos y llena los espacios vacíos en la rejilla de seis por ocho con 200 microlitros de 10% de glicerol. Luego, sumerja el replicador en un plato poco profundo de 95% de etanol y llama para esterilizar. Deje que se enfríe durante al menos dos minutos después de que la llama se extinga para evitar que el calor choque las células.

Coloque cuatro placas cerca del quemador y retire las tapas. Sumerja el replicador en la placa de 96 pocillos y levántelo en un movimiento rápido. Luego, coloque suavemente sobre el plato y balancee ligeramente hacia adelante y hacia atrás para facilitar una buena transferencia.

Levante en un movimiento rápido y colóquelo exactamente en la misma orientación en la placa de 96 pocillos. Después de que se haya plateado una placa, muévase con un movimiento suave hacia un lado, pero aún dentro del paraguas de esterilización de la llama. Deje que las placas se sequen completamente antes de colocar las tapas, generalmente de tres a cinco minutos.

Luego, incubar las placas durante tres días a 30 grados centígrados. Después de retirar las placas de la incubadora, inspecciónelas visualmente. El ensayo de crecimiento demostró que a medida que aumenta la concentración de cobre, las cepas con menor empalme muestran una disminución de la confluencia, hasta el punto en que la concentración de cobre se vuelve letal.

El fondo de levadura incluye un gen ADE2 alterado, lo que hace que las colonias sean de diferentes tonos de rojo. Y las colonias maduras eran de color rojo intenso. Durante el recubrimiento, si el replicador se levanta mientras se mueve hacia la izquierda o hacia la derecha, se lleva en ángulo o si se agita por encima de la placa, es posible crear colonias de forma ovalada o microcolonias a partir de pequeñas gotas de solución celular.

La levadura con el reportero A3c sobrevivió a 0,15 milimolares de cobre, mientras que las células reporteras de tipo salvaje mantuvieron la viabilidad hasta el final del rango de concentraciones de cobre probadas. Los resultados del ensayo mostraron que las diferentes bases en la posición 57 del snRNA U6 tienen impactos únicos en el espliceosoma en combinación con una mutación de 5 primos o rama. Mientras que U57c es una mutación aditiva, disminuyendo la tolerancia al cobre, en combinación con A3c y reporteros de sitio G de rama.

En contraste, U57a aumenta la tolerancia al cobre porque promueve la progresión al segundo paso. Después de identificar la perturbación del empalme a través de ACT1-CUP1, la investigación puede pasar a métodos más cuantitativos, como la extensión del cebador y la identificación de la interacción molecular interrumpida a través de EMSA y sondeo enzimático. ACT1-CUP1 ha sido un ensayo fundamental, construyendo nuestra comprensión de la robustez y selectividad del espliceosoma de levadura.

Y continúa expandiendo nuestra comprensión de la función espliceosomal.