Name: Modelado de señalización Wnt no canónica paracrina in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Aprende a evaluar la señalización Wnt no canónica paracrina in vitro usando células C2C12 y O9-1. Este protocolo permite estudios funcionales y moleculares del mecanismo Wnt/PCP en biología del desarrollo.

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Este trabajo fue apoyado en parte por los premios NIH F30HL154324 a O.T. y K08HL121191 y R03HL154301 a S.R.K. Los autores desean reconocer que el esquema de la Figura 1 de este manuscrito fue creado con biorender.com.

<ol><li>Ho, H. Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a-Ror-Dishevelled+signaling+constitutes+a+core+developmental+pathway+that+controls+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).</li>
<li>Čapek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-activated+Frizzled7+reveals+a+permissive+role+of+noncanonical+wnt+signaling+in+mesendoderm+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration.</a> Elife. (8), 42093(2019).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+signaling+regulates+polarized+second+heart+field+morphogenesis+to+promote+both+arterial+and+venous+pole+septation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation.</a> Development. 146 (20), 181719(2019).</li>
<li>Lutze, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncanonical+WNT-signaling+controls+differentiation+of+lymphatics+and+extension+lymphangiogenesis+via+RAC+and+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4739(2019).</li>
<li>Buttler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maldevelopment+of+dermal+lymphatics+in+Wnt5a-knockout-mice%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice.</a> Developmental Biology. 381 (2), 365-376 (2013).</li>
<li>Betterman, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atypical+cadherin+FAT4+orchestrates+lymphatic+endothelial+cell+polarity+in+response+to+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).</li>
<li>Descamps, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frizzled+4+regulates+arterial+network+organization+through+noncanonical+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling.</a> Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).</li>
<li>Weeraratna, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt5a+signaling+directly+affects+cell+motility+and+invasion+of+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma.</a> Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).</li>
<li>Henry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+novel+Wnt+receptor+ROR2+is+increased+in+breast+cancer+and+may+regulate+both+%CE%B2-catenin+dependent+and+independent+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Research+and+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling.</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).</li>
<li>Anastas, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+complex+of+SCRIB%2C+NOS1AP+and+VANGL1+regulates+cell+polarity+and+migration%2C+and+is+associated+with+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression.</a> Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).</li>
<li>Niehrs, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+world+of+WNT+receptor+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The complex world of WNT receptor signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).</li>
<li>Dong, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+redundancy+of+frizzled+3+and+frizzled+6+in+planar+cell+polarity+control+of+mouse+hair+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles.</a> Development. 145 (19), (2018).</li>
<li>Bernascone, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sfrp3+modulates+stromal-epithelial+crosstalk+during+mammary+gland+development+by+regulating+Wnt+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels.</a> Nature Communications. 10 (1), 2481(2019).</li>
<li>Hendrickx, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNT16+requires+G%CE%B1+subunits+as+intracellular+partners+for+both+its+canonical+and+noncanonical+WNT+signalling+activity+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts.</a> Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).</li>
<li>Avgustinova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+cell-derived+Wnt7a+recruits+and+activates+fibroblasts+to+promote+tumour+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness.</a> Nature Communications. (7), 10305(2016).</li>
<li>Tseng, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAPE+suppresses+migration+and+invasion+of+prostate+cancer+cells+via+activation+of+noncanonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling.</a> Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Wnt%2FCa2%2B+signaling+in+actin+cytoskeleton+remodeling+and+cell+motility+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer.</a> PLoS One. 5 (5), 10456(2010).</li>
<li>Gibbs, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prickle1+mutation+causes+planar+cell+polarity+and+directional+cell+migration+defects+associated+with+cardiac+outflow+tract+anomalies+and+other+structural+birth+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects.</a> Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).</li>
<li>Cui, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+PCP+protein+required+for+ciliogenesis%2C+regulates+directional+cell+migration+and+cell+polarity+by+direct+modulation+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton.</a> PLoS Biology. 11 (11), 1001720(2013).</li>
<li>Gombos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formin+DAAM+functions+as+molecular+effector+of+the+planar+cell+polarity+pathway+during+axonal+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila.</a> The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).</li>
<li>Toubat, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Crest+Cell-derived+Wnt5a+Regulates+Planar+Cell+Polarity+in+Cranial+Second+Heart+Field+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells.</a> Circulation. 142, Suppl_3 12540(2020).</li>
<li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+of+cell+cohesion+by+Wnt5a+during+second+heart+field+progenitor+deployment%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment.</a> Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).</li>
<li>Sinha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Wnt5a+disrupts+second+heart+field+cell+deployment+and+may+contribute+to+OFT+malformations+in+DiGeorge+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).</li>
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<li>Butler, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planar+cell+polarity+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Planar cell polarity in development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).</li>
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<li>Kodo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Sema3c+and+the+interaction+between+cardiac+neural+crest+and+second+heart+field+during+outflow+tract+development%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development.</a> Scientific Reports. 7 (1), 6771(2017).</li>
<li>Waldo, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+neural+crest+is+necessary+for+normal+addition+of+the+myocardium+to+the+arterial+pole+from+the+secondary+heart+field%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field.</a> Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).</li>
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<li>Nguyen, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+Manipulation+of+O9-1+Neural+Crest+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e58346(2018).</li>
<li>Suarez-Arnedo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+J+plugin+for+the+high+throughput+image+analysis+of+in+vitro+scratch+wound+healing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays.</a> PLoS One. 15 (7), 0232565(2020).</li>
<li>Martinotti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scratch+wound+healing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Scratch wound healing assay.</a> Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).</li>
</ol>

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

La vía de señalización no canónica Wnt/polaridad celular plana (PCP) es una vía de señalización celular de importancia crítica que ha sido implicada en múltiples procesos de desarrollo 24,25 y de enfermedad24,26. Durante el desarrollo embrionario, la señalización Wnt no canónica implica una red expansiva de señales moleculares de células emisoras de señales que finalmente inducen cambios en la mo...

La señalización Wnt no canónica es una vía conservada evolutivamente que regula la organización del filamento celular y la migración direccional. Esta vía ha sido implicada en múltiples procesos biológicos, incluyendo la morfogénesis tisular embrionaria 1,2,3, la angiogénesis linfática y vascular 4,5,6,7, y el crecimiento y metástasis del cáncer 8,9,10 . A nivel celular, la señalización Wnt no canónica se lleva a cabo a través de interacciones paracrinas coordinadas entre las células emisoras y receptoras de señales. Estas interacciones ocurren frecuentemente entre células de diferentes linajes o tipos e involucran una red molecular diversa que incluye hasta 19 ligandos y múltiples receptores, correceptores y efectores de transducción de señales aguas abajo11. Para complicar aún más este proceso de señalización, estudios previos han demostrado que las combinaciones ligando-receptor pueden variar de manera dependiente del contexto y del tejido 12,13, y que los mismos ligandos fuente que impulsan la señalización Wnt no canónica en las células receptoras de señales pueden ser producidos por múltiples tipos de células emisoras de señales 14,15 . Dada la complejidad celular y molecular asociada con la señalización Wnt no canónica, la capacidad de estudiar mecanismos individuales y clínicamente relevantes in vivo ha sido limitada.
Se han hecho intentos para estudiar la señalización Wnt no canónica utilizando técnicas de cultivo celular in vitro. Por ejemplo, los ensayos de cicatrización de heridas realizados en monocapas celulares se han utilizado para evaluar funcionalmente la migración direccional celular 4,16,17,18,19. Se han utilizado técnicas de inmunotinción para realizar análisis espaciales de la expresión de proteínas de superficie para evaluar cambios no canónicos inducidos por Wnt en morfología celular 7,10, arquitectura y polarización asimétrica18,19,20. Aunque estos enfoques han proporcionado herramientas importantes para caracterizar fenotipos relacionados con Wnt en células receptoras de señales, la falta de componentes de envío de señales en estos protocolos limita su capacidad para modelar con precisión los mecanismos de señalización paracrina observados in vivo. Como resultado, sigue existiendo una necesidad crítica de desarrollar sistemas in vitro que permitan una evaluación robusta y reproducible de las interacciones de señalización paracrina entre las células emisoras y receptoras de señales de la vía Wnt no canónica, particularmente aquellas de diferentes tipos celulares.
Con este fin, el objetivo principal de este estudio fue establecer un protocolo para modelar interacciones de señalización Wnt paracrinas no canónicas in vitro. Desarrollamos un sistema de cocultivo sin contacto que recapitula los componentes de envío y recepción de señales de estas interacciones y permite el uso de enfoques moleculares, genéticos o farmacológicos estándar para estudiar de forma independiente mecanismos específicos de ligando-receptor en la vía Wnt no canónica. Los mecanismos de señalización Wnt mediada por NCC se examinaron en mioblastos utilizando líneas celulares murinas establecidas. Como prueba de principio, este modelo se utilizó para corroborar los hallazgos de estudios previos in vivo en ratones que implican el eje Wnt5a-ROR2 como una vía de señalización Wnt no canónica relevante entre NCCs 21 y progenitores de cardiomioblastos SHF 3,22,23.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-7522</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje antidecoloración con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td>Almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2323</td><td>Almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>C2C12 línea celular de mioblastos murinos</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Matraces de cultivo celular, 75 cm2</td>Sistema de portaobjetos de cámara de <td>156499</td><td></td> <td>ThermoFisher Scientific</td></tr><tr><td>, 4 pocillos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>154526</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio (DMEM), glucosa alta (4,5 g/L), L-glutamina (2 mM)</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td>Almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga cónicos Falcon, 15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Soporte permeable Falcon para placa de 24 pocillos con 0.4 y micro; Membrana de PET transparente</td><td>Corning</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3381E</td><td>Almacenado en alícuotas de 50 mL a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Solución de gelatina, 0.1%</td><td>ATCC</td><td>PCS-999-027</td><td>Almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta graduadas y estériles, 10 y micro; L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-3810</td><td></td></tr><tr><td>Factor inhibidor de la leucemia (LIF), 106 unidades/mL</td><td>Millipore Sigma</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>MEM aminoácidos no esenciales (MEM NEAA) 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Medio esencial mínimo (MEM)</td><td>Corning</td><td>10-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>Mitomicina C</td><td>Roche</td><td>10107409001</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos antiadherentes para vidrios para automóviles, 24 x 55 mm</td><td>Línea celular de cresta neural Springside Scientific</td><td>HRTCG2455</td><td></td></tr><tr><td>O9-1</td><td>Millipore Sigma</td><td>SCC049</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I, 1x</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído solución en PBS, 4%</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>Almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL de penicilina y 10.000 &mu; g/mL de estreptomicina)</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3470H</td><td>Almacenado en alícuotas de 10 mL a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Phalloidin-iFluor 488</td><td>Abcam</td><td>ab176753</td><td>Almacenado a -20 &deg; C, Mantener fuera de la luz</td></tr><tr><td>Solución salina tampón de fosfato (PBS), 1x, sin calcio ni magnesio, pH 7.4</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>Almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento de fibroblastos humanos recombinante-básico (rhFGF-básico)</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Proteína Wnt5a recombinante humano/ratón</td><td>R& D Systems</td><td>645-WN-010</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio, 100 mM</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri cuadrada con rejilla</td><td>Thomas Scientific</td><td>1219C98</td><td></td></tr><tr><td>STO celdas alimentadoras de fibroblastos murinos</td><td>ATCC</td><td>CRL-1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 solución</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA, 0,25%</td><td>Fisher Scientific</td><td>W3513C</td><td>Almacenado a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia Zeiss Apotome.2</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio óptico Zeiss Axio Vert.A1 invertido</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen lite 2012 software de microscopía</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>software de imagen</td></tr></tbody></table>

modelado de señalización wnt no canónica paracrina in vitro

Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro

La señalización Wnt no canónica regula la organización intracelular del filamento de actina y la migración polarizada de las células progenitoras durante la embriogénesis. Este proceso requiere interacciones paracrinas complejas y coordinadas entre las células emisoras y receptoras de señales. Dado que estas interacciones pueden ocurrir entre varios tipos de células de diferentes linajes, la evaluación in vivo de defectos específicos de células puede ser un desafío. El presente estudio describe un método altamente reproducible para evaluar la señalización paracrina no canónica de Wnt in vitro. Este protocolo fue diseñado con la capacidad de (1) realizar evaluaciones funcionales y moleculares de la señalización Wnt no canónica entre dos tipos de células de interés; (2) diseccionar el papel de las moléculas de envío de señales versus moléculas receptoras de señales en la vía de señalización Wnt no canónica; y (3) realizar experimentos fenotípicos de rescate con enfoques moleculares o farmacológicos estándar.
Este protocolo se utilizó para evaluar la señalización Wnt no canónica mediada por células de la cresta neural (NCC) en mioblastos. La presencia de NCC se asocia con un mayor número de filopodios citoplasmáticos positivos para faloidina y lamellipodia en mioblastos y una mejor migración de mioblastos en un ensayo de cicatrización de heridas. El eje Wnt5a-ROR2 se identificó como una vía de señalización Wnt no canónica crucial entre NCC y progenitores de cardiomioblastos del segundo campo cardíaco (SHF). En conclusión, este es un protocolo altamente manejable para estudiar los mecanismos de señalización Wnt no canónicos paracrinos in vitro.

Efectos de los NCC sobre la capacidad migratoria de los mioblastos murinos Este ensayo se aplicó por primera vez para evaluar el impacto de los NCC en la capacidad migratoria de los mioblastos. La figura 1 describe el modelo esquemático del ensayo. Para probar este impacto, se realizaron ensayos de rasguño con mioblastos que se cultivaron de forma aislada (sin inserciones NCC) en comparación con los cultivados en presencia de inserciones. Como control positivo, se agregar...

El presente estudio describe un método altamente reproducible y manejable para estudiar eventos de señalización Wnt no canónicos paracrinos in vitro. Este protocolo se aplicó para evaluar el impacto de la señalización paracrina Wnt5a en células murinas de la cresta neural y mioblastos.

Modelado de señalización Wnt no canónica paracrina in vitro

Noncanonical Wnt signaling regulates intracellular actin filament organization and polarized migration of progenitor cells during embryogenesis. This ...

Este protocolo describe un método altamente reproducible para evaluar funcional y molecularmente la señalización paracrina no canónica de Wnt en cualquier población celular de interés. Las evaluaciones funcionales y moleculares se realizan en la misma población celular y se pueden aplicar para estudiar cualquier componente de la vía Wnt/PCP. Para comenzar, resuspenda la celda C2C12 previamente peletizada en 10 mililitros de medio C2C12.Para diluir las células en una proporción de 1:20, agregue 0,5 mililitros de suspensión celular en un tubo de 15 mililitros que contenga 9,5 mililitros de medio C2C12 fresco y mezcle suavemente con una pipeta serológica con una pipeta P1000, agregue un mililitro de la suspensión celular diluida a cada pocillo de un nuevo pozo de cuatro cámaras y colóquelo en la incubadora. Para placar los insertos de células O9-1, resuspenda el pellet de celda O9-1 en 10 mililitros de medio de crecimiento O9-1. Y similar a la dilución celular C2C12, diluya las células O9-1 en una proporción de 1:20.A continuación, coloque un solo inserto permeable dentro de cada pocillo de un nuevo pozo de cuatro cámaras lleno de un mililitro de medio de crecimiento O9-1. Agregue 300 microlitros de la suspensión de celda O9-1 diluida a cada inserto y asegúrese de que el inserto esté completamente sumergido. Luego incubar el pozo a 37 grados centígrados.Para realizar la eliminación del ARNip en las células O9-1, diluya el ARNip y el reactivo de transfección en el medio sérico reducido de acuerdo con las recomendaciones del fabricante a las concentraciones deseadas. Mezclar suavemente el siRNA diluido y el reactivo de transfección e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante siete minutos. Después de 18 a 24 horas de recubrimiento celular, agregue los complejos lipídicos de ARNip a los insertos de células O9-1 e incube durante aproximadamente 34 a 48 horas.Cuando las células alcancen una confluencia del 70 al 80%, retire bien el medio de la cámara C2C12 y lave las células una vez con PBS. Después de retirar el PBS, comience a rascar las células pasando firmemente una punta de pipeta P10 estéril en una sola dirección para abarcar toda la longitud o anchura de la monocapa celular. Una vez que las células estén rayadas, agregue rápidamente un mililitro de PBS.A continuación, encienda la computadora y el microscopio. Coloque la corredera de la cámara en el escenario y gire el dial del objetivo con un aumento de 5X. Abra el software de imágenes.Haga clic en la pestaña cámara y, a continuación, haga clic en el botón Live para visualizar las celdas en la pestaña AxioCam IC. Asegúrese de que el filtro de luz esté completamente extendido para permitir que la luz pase a la cámara y a la pantalla de la computadora, mueva o gire manualmente la diapositiva de la cámara para colocar el área de la herida en el centro de la imagen en vivo en la pestaña AxioCam IC. Para tomar imágenes, haga clic en ajustar para abrir una nueva pestaña junto a la pestaña AxioCam IC que contiene la imagen.Para guardar esta imagen fija, haga clic en el archivo, seleccione guardar como, seleccione escritorio en la barra de la izquierda para guardar el archivo en el escritorio, ingrese el nombre del archivo en el cuadro de nombre de archivo y guarde la figura en formato de archivo czi. Para guardar la imagen como un tiff, haga clic en archivo, seleccione guardar como, escriba el nombre del archivo en el cuadro nombre de archivo. Haga clic en el botón Guardar como tipo y seleccione tiff en el menú desplegable.Cambie manualmente la diapositiva de la cámara para tomar dos o tres imágenes más en otros puntos de la herida en el mismo pozo. Después de la imagen, retire el PBS de cada pocillo y agregue un mililitro de C2C12 medio. Ensamble el sistema de cocultivo de insertos de pozo colocando manualmente los insertos que contienen las células O9-1 en cada pocillo del pozo de la cámara.Empuje suavemente los insertos hacia abajo en el pozo, de modo que la parte inferior del inserto se encuentre justo encima de las células C2C12 subyacentes. Devuelva las construcciones del inserto del pozo a la incubadora y permita que las células migren durante un total de nueve a 12 horas. Para determinar el tiempo óptimo de migración, verifique las células seis horas después de la creación de la herida, luego cada dos o tres horas después de eso.Termine el experimento cuando las células en condiciones de control cubran completamente la herida. Comience la terminación del ensayo de migración y la deconstrucción del sistema de inserción de pozo eliminando los insertos de células O9-1 después de nueve a 12 horas del período de migración. Aspirar cuidadosamente el medio C2C12.Agregue 0.5 mililitros de PBS a los pocillos de la cámara y tome imágenes finales de las células después de la migración. Aspire cuidadosamente todo el PBS mezclado con medio y retire las cámaras de plástico de los pozos de la cámara siguiendo las instrucciones del kit. Dejando la diapositiva subyacente que contiene las celdas C2C12.Para la inmunotinción, incubar inmediatamente el portaobjetos con aldehído paraformado al 4% durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego retire el paraformaldehído y lave el portaobjetos con Triton X-100 al 0,1% que contiene PBST durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de 15 minutos, vierta PBST y lave el portaobjetos dos veces con PBS durante 10 minutos cada una.Luego cree un límite hidrofóbico con una pluma hidrófoba alrededor del portaobjetos para evitar que las soluciones se derramen del portaobjetos evitando la interrupción de las células de adherencia. A continuación, agregue aproximadamente 0,5 mililitros de solución de bloqueo BSA al 1% al portaobjetos dentro del límite hidrofóbico e incube el portaobjetos durante una hora a temperatura ambiente en una cámara de portaobjetos humidificada. Al final de la incubación, retire la solución de bloqueo y agregue el anticuerpo faloidina a esta diapositiva dentro del límite hidrofóbico, e incube a cuatro grados centígrados durante la noche.Al día siguiente, coloque la diapositiva en un portaportaobjetos protegido de la exposición a la luz. Lave las celdas tres veces con PBS durante 10 minutos cada una a temperatura ambiente. Agregue un medio de montaje que contenga DAPI, monte los portaobjetos con cubreobjetos de vidrio y capture las células con un microscopio de fluorescencia estándar.En el presente estudio, la adición de Wnt5a recombinante a los pozos de cocultivo aceleró la migración de mioblastos con la recuperación completa de algunas áreas en nueve horas. Los mioblastos migratorios en las tres condiciones exhibieron una morfología celular migratoria normal, incluyendo filopodios y lamellipodia bien formados y sobresalientes y polarización asimétrica de las proyecciones citoesqueléticas de actina. Se estudió el efecto paracrino de Wnt5a derivado de NCC sobre la migración de mioblastos.El tratamiento con 50 siRNA nanomolares contra Wnt5a redujo la expresión del gen Wnt5a en un 64% en comparación con el control negativo. La migración de explosiones de C2C12 millas con una reducción significativa después del derribo de Wnt5a en NCC y la adición de Wnt5a recombinante exógeno rescató este déficit migratorio y defecto morfológico en estos mioblastos. Para comprender mejor los mecanismos de las células receptoras de señales en el modelo paracrino, el receptor ROR2 fue derribado y la expresión génica se redujo en un 54%La caída de ROR2 en mioblastos reduce su capacidad migratoria a pesar de la presencia de NCC.El Wnt5a recombinante exógeno no pudo rescatar la migración de mioblastos después del derribo de ROR2, lo que sugiere que el agotamiento de ROR2 interrumpe la capacidad de los mioblastos para recibir señales de Wnt5a. Cultive células a una densidad adecuada rasguño con punta P10 solo una vez ensamble y desensamble el sistema de cocultivo con cuidado sin interrumpir la célula subyacente. Esta técnica se utilizó como prueba de concepto para estudiar un eje de señalización molecular específico dentro de la compleja vía Wnt/PCP con relevancia para la biología de las células de la cresta neural y el segundo campo cardíaco.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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