Name: Protocolos optimizados de muestreo óseo para la recuperación de ADN antiguo de restos arqueológicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Aprende protocolos optimizados de muestreo óseo para recuperar ADN antiguo de restos arqueológicos y forenses. Estos métodos utilizan taladros dentales en sala limpia para maximizar el rendimiento de ADN endógeno desde múltiples ubicaciones anatómicas.

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Los autores desean agradecer al personal de laboratorio del Instituto Max Planck para la Ciencia de la Historia Humana por su ayuda en el desarrollo e implementación de estos protocolos. Este trabajo no habría sido posible sin el aporte y el arduo trabajo del Dr. Guido Brandt, la Dra. Elizabeth Nelson, Antje Wissegot y Franziska Aron. Este estudio fue financiado por la Sociedad Max Planck, el Consejo Europeo de Investigación (ERC) bajo el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo los acuerdos de subvención No 771234 - PALEoRIDER (WH, ABR) y Starting Grant No. 805268 CoDisEASe (a KIB).

<ol><li>Adler, C. J., Haak, W., Donlon, D., Cooper, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+recovery+of+DNA+from+ancient+teeth+and+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Archaeological+Science%22%5BJournal%5D)">Survival and recovery of DNA from ancient teeth and bones.</a> Journal of Archaeological Science. 38 (5), 956-964 (2011).</li>
<li>Dabney, J., Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+highly+degraded+DNA+from+ancient+bones+and+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Ancient+DNA%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Extraction of highly degraded DNA from ancient bones and teeth.</a> Ancient DNA: Methods and Protocols. , 25-29 (2019).</li>
<li>Palsdottir, A. H., Bläuer, A., Rannamäe, E., Boessenkool, S., Hallsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+a+limitless+resource%3A+ethics+and+guidelines+for+destructive+sampling+of+archaeofaunal+remains%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+Open+Science%22%5BJournal%5D)">Not a limitless resource: ethics and guidelines for destructive sampling of archaeofaunal remains.</a> Royal Society Open Science. 6 (10), 191059(2019).</li>
<li>Pinhasi, R., Fernandes, D. M., Sirak, K., Cheronet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+the+human+cochlea+to+generate+bone+powder+for+ancient+DNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolating the human cochlea to generate bone powder for ancient DNA analysis.</a> Nature Protocols. 14 (4), 1194-1205 (2019).</li>
<li>Latham, K. E., Miller, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+recovery+and+analysis+from+skeletal+material+in+modern+forensic+contexts%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sciences+Research%22%5BJournal%5D)">DNA recovery and analysis from skeletal material in modern forensic contexts.</a> Forensic Sciences Research. 4 (1), 51-59 (2019).</li>
<li>Mundorff, A. Z., Bartelink, E. J., Mar-Cash, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+preservation+in+skeletal+elements+from+the+World+Trade+Center+disaster%3A+Recommendations+for+mass+fatality+management%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Forensic+Sciences%22%5BJournal%5D)">DNA preservation in skeletal elements from the World Trade Center disaster: Recommendations for mass fatality management.</a> Journal of Forensic Sciences. 54 (4), 739-745 (2009).</li>
<li>Gamba, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+flux+and+stasis+in+a+five+millennium+transect+of+European+prehistory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genome flux and stasis in a five millennium transect of European prehistory.</a> Nature Communications. 5 (1), 1-9 (2014).</li>
<li>Alberti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+DNA+sampling+of+ancient+bones+using+Computed+Tomography+scans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">Optimized DNA sampling of ancient bones using Computed Tomography scans.</a> Molecular Ecology Resources. 18 (6), 1196-1208 (2018).</li>
<li>Hansen, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+ancient+DNA+preservation+in+petrous+bone+and+tooth+cementum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparing ancient DNA preservation in petrous bone and tooth cementum.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0170940(2017).</li>
<li>Sirak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+auditory+ossicles+as+an+alternative+optimal+source+of+ancient+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Human auditory ossicles as an alternative optimal source of ancient DNA.</a> Genome Research. 30 (3), 427-436 (2020).</li>
<li>Parker, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+investigation+of+human+DNA+preservation+in+medieval+skeletons%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A systematic investigation of human DNA preservation in medieval skeletons.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18225(2020).</li>
<li>Pinhasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+ancient+DNA+yields+from+the+inner+ear+part+of+the+human+petrous+bone%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Optimal ancient DNA yields from the inner ear part of the human petrous bone.</a> PLoS ONE. 10 (6), 0129102(2015).</li>
<li>Sirak, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimally-invasive+method+for+sampling+human+petrous+bones+from+the+cranial+base+for+ancient+DNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">A minimally-invasive method for sampling human petrous bones from the cranial base for ancient DNA analysis.</a> BioTechniques. 62 (6), 283-289 (2017).</li>
<li>Orfanou, E., Himmel, M., Aron, F., Haak, W. Minimally-invasive sampling of pars petrosa (os temporale) for ancient DNA extraction. protocols.io. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.protocols.io/view/minimally-invasive-sampling-of-pars-petrosa-os-tem-bqd8ms9w">https://www.protocols.io/view/minimally-invasive-sampling-of-pars-petrosa-os-tem-bqd8ms9w</a> (2020).</li>
<li>Damgaard, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+access+to+endogenous+DNA+in+ancient+bones+and+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Improving access to endogenous DNA in ancient bones and teeth.</a> Scientific Reports. 5 (1), 1-12 (2015).</li>
<li>Harney, É, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimally+destructive+protocol+for+DNA+extraction+from+ancient+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">A minimally destructive protocol for DNA extraction from ancient teeth.</a> Genome Research. 31 (3), 472-483 (2021).</li>
<li>Cooper, A., Poinar, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ancient+DNA%3A+Do+it+right+or+not+at+all%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ancient DNA: Do it right or not at all.</a> Science. 289 (5482), 1139(2000).</li>
<li>Llamas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+field+to+the+laboratory%3A+Controlling+DNA+contamination+in+human+ancient+DNA+research+in+the+high-throughput+sequencing+era%5BTitle%5D)+AND+%22STAR%3A+Science+%26+Technology+of+Archaeological+Research%22%5BJournal%5D)">From the field to the laboratory: Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high-throughput sequencing era.</a> STAR: Science & Technology of Archaeological Research. 3 (1), 1-14 (2017).</li>
<li>Llamas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+field+to+the+laboratory%3A+Controlling+DNA+contamination+in+human+ancient+DNA+research+in+the+high-throughput+sequencing+era%5BTitle%5D)+AND+%22STAR%3A+Science+%26+Technology+of+Archaeological+Research%22%5BJournal%5D)">From the field to the laboratory: Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high-throughput sequencing era.</a> STAR: Science & Technology of Archaeological Research. 3 (1), 1-14 (2017).</li>
<li>Boessenkool, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+bleach+and+mild+predigestion+improves+ancient+DNA+recovery+from+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">Combining bleach and mild predigestion improves ancient DNA recovery from bones.</a> Molecular Ecology Resources. 17 (4), 742-751 (2017).</li>
<li>García-Garcerà, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragmentation+of+contaminant+and+endogenous+DNA+in+ancient+samples+determined+by+shotgun+sequencing%3B+Prospects+for+human+palaeogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Fragmentation of contaminant and endogenous DNA in ancient samples determined by shotgun sequencing; Prospects for human palaeogenomics.</a> PLoS ONE. 6 (8), 24161(2011).</li>
<li>Malmström, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+on+contamination%3A+The+use+of+asymmetric+molecular+behavior+to+identify+authentic+ancient+human+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">More on contamination: The use of asymmetric molecular behavior to identify authentic ancient human DNA.</a> Molecular Biology and Evolution. 24 (4), 998-1004 (2007).</li>
<li>Basler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+the+contaminant+fraction+of+DNA+obtained+from+an+ancient+giant+panda+bone%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Reduction of the contaminant fraction of DNA obtained from an ancient giant panda bone.</a> BMC Research Notes. 10, 754(2017).</li>
<li>Kemp, B. M., Smith, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bleach+to+eliminate+contaminating+DNA+from+the+surface+of+bones+and+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Science+International%22%5BJournal%5D)">Use of bleach to eliminate contaminating DNA from the surface of bones and teeth.</a> Forensic Science International. 154 (1), 53-61 (2005).</li>
<li>Korlević, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+microbial+and+human+contamination+in+DNA+extractions+from+ancient+bones+and+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Reducing microbial and human contamination in DNA extractions from ancient bones and teeth.</a> BioTechniques. 59 (2), 87-93 (2015).</li>
<li>Dabney, J., Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+highly+degraded+DNA+from+ancient+bones+and+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Extraction of highly degraded DNA from ancient bones and teeth.</a> Methods in Molecular Biology. 1963, 25-29 (2019).</li>
<li>Hansen, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+ancient+DNA+preservation+in+petrous+bone+and+tooth+cementum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparing ancient DNA preservation in petrous bone and tooth cementum.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0170940(2017).</li>
<li>Gansauge, M. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+DNA+library+preparation+from+highly+degraded+DNA+using+T4+DNA+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Single-stranded DNA library preparation from highly degraded DNA using T4 DNA ligase.</a> Nucleic Acids Research. 45 (10), 79(2017).</li>
<li>Peltzer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EAGER%3A+efficient+ancient+genome+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">EAGER: efficient ancient genome reconstruction.</a> Genome Biology. 17 (1), 60(2016).</li>
<li>Korneliussen, T. S., Albrechtsen, A., Nielsen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ANGSD%3A+analysis+of+next+generation+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ANGSD: analysis of next generation sequencing data.</a> BMC Bioinformatics. 15, 356(2014).</li>
<li>Renaud, G., Hanghøj, K., Willerslev, E., Orlando, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gargammel%3A+A+sequence+simulator+for+ancient+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Gargammel: A sequence simulator for ancient DNA.</a> Bioinformatics. 33 (4), 577-579 (2017).</li>
<li>Ponce de León, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bony+labyrinth+is+an+indicator+of+population+history+and+dispersal+from+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human bony labyrinth is an indicator of population history and dispersal from Africa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (16), 4128-4133 (2018).</li>
<li>Nagaoka, T., Kawakubo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+petrous+part+of+the+temporal+bone+to+estimate+fetal+age+at+death%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Science+International%22%5BJournal%5D)">Using the petrous part of the temporal bone to estimate fetal age at death.</a> Forensic Science International. 248, 188(2015).</li>
<li>Norén, A., Lynnerup, N., Czarnetzki, A., Graw, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+angle%3A+A+method+for+sexing+using+the+petrous+bone%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physical+Anthropology%22%5BJournal%5D)">Lateral angle: A method for sexing using the petrous bone.</a> American Journal of Physical Anthropology. 128 (2), 318-323 (2005).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que informar.

La práctica actual en genética de poblaciones humanas antiguas es tomar muestras preferentemente de la pars petrosa (paso 2.1) siempre que sea posible. Sin embargo, la pars petrosa puede ser una muestra difícil de obtener, ya que es muy valorada para una miríada de evaluaciones esqueléticas (por ejemplo, historia poblacional32, estimación de la edad fetal al morir33 y determinación del sexo34), y, históricamente, el muestreo de la pars petrosa para el análisis de ADN puede ser altamente destructivo3,4 (incluido el protocolo presentado aquí, aunque los nuevos protocolos mínimamente invasivos13,14 han sido ampliamente adoptados para aliviar esta preocupación). Esto se ve agravado por el hecho de que, hasta hace muy poco, no se había intentado un estudio sistemático a gran escala de la recuperación del ADN humano a través del esqueleto11, lo que dificulta encontrar una estrategia de muestreo adecuada cuando la pirámide petrosa no está disponible.
Los protocolos presentados aquí ayudan a aliviar ese desafío al proporcionar un conjunto de procedimientos optimizados para el muestreo de ADN de restos óseos arqueológicos / forenses, incluida la pars petrosa, así como siete ubicaciones alternativas de muestreo anatómico en cuatro elementos esqueléticos adicionales. Todos los pasos críticos incluidos están destinados a minimizar la posibilidad de pérdida/daño del ADN debido a un muestreo ineficiente (pasos 2.1.6 y 3.2.1.3) o al sobrecalentamiento de las muestras durante la perforación / corte (paso 3.1.6). Además, se ha observado a lo largo del protocolo que puede ser necesario modificar/omitir los pasos previos al tratamiento para garantizar el mejor rendimiento en muestras altamente degradadas. También debe tenerse en cuenta que incluso entre los elementos seleccionados presentados aquí, quedan varias técnicas de muestreo alternativas posibles (particularmente para la pars petrosa13,14), así como un amplio espacio para una mayor optimización de los lugares de muestreo anatómico subexplotados presentados aquí (es decir, el astrágalo: paso 2.5 y las vértebras: paso 2.3).
También es importante tener en cuenta que estos protocolos han sido diseñados y probados utilizando restos antiguos juveniles-adultos de alta calidad (buena preservación morfológica) para fines de análisis endógenos de ADN humano. Los resultados presentados pueden no extenderse a materiales más altamente degradados, otros contextos de preservación, restos infantiles, restos no humanos o estudios de patógenos o el microbioma, ya que aún se necesita una mayor exploración del uso de estos protocolos en contextos adicionales. Además, los elementos esqueléticos alternativos presentados aquí (los dientes, las vértebras, la falange distal y los tali) pueden ser difíciles de asignar a un solo individuo entre los restos mezclados, lo que requiere un muestreo de múltiples elementos para garantizar un origen único. A pesar de estas limitaciones, hacer que estos protocolos estén ampliamente disponibles puede ayudar a aliviar parte de la heterogeneidad que rodea la selección y el procesamiento de muestras al proporcionar un marco generalizado y cuantitativamente optimizado para su uso en una amplia gama de futuros estudios de ADNa / forenses en restos humanos.

El muestreo de restos humanos antiguos con fines de recuperación y análisis de ADN es inherentemente destructivo 1,2,3,4. Las muestras en sí mismas son especímenes preciosos y la preservación morfológica debe preservarse siempre que sea posible. Como tal, es imperativo que las prácticas de muestreo se optimicen para evitar la destrucción innecesaria de material irremplazable y maximizar la probabilidad de éxito. Las técnicas actuales de mejores prácticas se basan en una pequeña cohorte de estudios limitados a estudios forenses5,6, estudios de especímenes antiguos donde el desarrollo de un muestreo óptimo no es el objetivo directo del estudio7, o estudios dedicados que utilizan restos no humanos8 o dirigidos a una selección muy pequeña de lugares de muestreo anatómico (utilizados aquí para denotar un área específica de un elemento esquelético del cual el polvo óseo, para su uso en análisis de ADN aguas abajo, se generó)9,10. Los protocolos de muestreo presentados aquí fueron optimizados en el primer estudio sistemático a gran escala de preservación de ADN a través de múltiples elementos esqueléticos de múltiples individuos11. Todas las muestras provienen de elementos óseos recuperados de 11 individuos excavados en el cementerio de la iglesia del asentamiento medieval abandonado de Krakauer Berg cerca de Peißen, Sajonia-Anhalt, Alemania (ver Tabla 1 para datos demográficos detallados de la muestra) y, como tal, pueden necesitar modificaciones para su uso con muestras fuera de este rango geográfico / temporal.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Individual</td>
			<td>Sexo</td>
			<td>Edad estimada de muerte</td>
			<td>14 Fechas C (CE, Cal 2-sigma)</td>
		</tr><tr><td>KRA001</td>
			<td>Masculino</td>
			<td>25-35</td>
			<td>1058-1219</td>
		</tr><tr><td>KRA002</td>
			<td>Hembra</td>
			<td>20-22</td>
			<td>1227-1283</td>
		</tr><tr><td>KRA003</td>
			<td>Masculino</td>
			<td>25</td>
			<td>1059-1223</td>
		</tr><tr><td>KRA004</td>
			<td>Masculino</td>
			<td>15</td>
			<td>1284-1392</td>
		</tr><tr><td>KRA005</td>
			<td>Masculino</td>
			<td>10-12</td>
			<td>1170-1258</td>
		</tr><tr><td>KRA006</td>
			<td>Hembra</td>
			<td>30-40</td>
			<td>1218-1266</td>
		</tr><tr><td>KRA007</td>
			<td>Hembra</td>
			<td>25-30</td>
			<td>1167-1251</td>
		</tr><tr><td>KRA008</td>
			<td>Masculino</td>
			<td>20</td>
			<td>1301-1402</td>
		</tr><tr><td>KRA009</td>
			<td>Masculino</td>
			<td>Desconocido</td>
			<td>1158-1254</td>
		</tr><tr><td>KRA010</td>
			<td>Masculino</td>
			<td>25</td>
			<td>1276-1383</td>
		</tr><tr><td>KRA011</td>
			<td>Hembra</td>
			<td>30-45</td>
			<td>1040-1159</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Sexo determinado genéticamente, edad estimada de muerte determinada arqueológicamente y datación por radiocarbono (14C Cal 2-sigma) para los 11 individuos muestreados. Esta tabla ha sido adaptada de Parker, C. et al. 202011.
Estos protocolos permiten una generación relativamente sencilla y eficiente de polvo óseo a partir de ocho ubicaciones de muestreo anatómico a través de cinco elementos esqueléticos (incluida la pars petrosa) con contaminación limitada de ADN inducida por laboratorio. De estos cinco elementos esqueléticos, se ha determinado que siete lugares de muestreo anatómico encontrados en cuatro elementos esqueléticos son alternativas viables al muestreo destructivo de la pirámide petrosa11,12. Estos incluyen el cemento, la dentina y la cámara pulpar de los molares permanentes; hueso cortical recogido de la muesca vertebral superior, así como del cuerpo de las vértebras torácicas; hueso cortical derivado de la superficie inferior del mechón apical y el eje de las falanges distales; y el hueso cortical denso a lo largo de la porción exterior del tali. Si bien existen varios métodos ampliamente aplicados para el muestreo de la pars petrosa 4,12,13,14, dentina y la cámara de la pulpa dental 1,2,15, los métodos publicados describen la generación exitosa de polvo óseo a partir del cemento 16 , el cuerpo vertebral, la muesca vertebral inferior y el astrágalo pueden ser difíciles de obtener. Como tal, aquí demostramos protocolos de muestreo optimizados para la pirámide petrosa (paso 3.1); cemento (paso 3.2.1), dentina (paso 3.2.2) y pulpa dental (paso 3.2.3) de molares adultos; hueso cortical del cuerpo vertebral (paso 3.3.1) y arco vertebral superior (paso 3.3.2); la falange distal (paso 3.4); y el astrágalo (paso 3.5) para hacer más accesible el uso efectivo de estos elementos esqueléticos tanto para el ADN como para la investigación forense.

<table><tbody><tr><td>#16 Broca dental NTI</td><td></td><td>H1-016-HP Ejemplo de</td><td>broca</td></tr> de <tr><td>perforación Hoja de sierra de calado de 0,6 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-949-097</td><td>hoja para joyería Sierra de</td></tr><tr><td>22 mm disco de corte de diamante</td><td>Kahla</td><td>SKU 806 104 358 514 220</td><td>Accesorio de corte Dremel</td></tr><tr><td>Lejía comercial Fisher</td><td>Scientific</td><td></td> NC1818018 <td></td></tr><tr><td>Control Company Ultra-Clean Papel de aluminio supremo</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-078-29X</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tubos (2 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>22431048</td><td></td></tr><tr><td>Dremel 225-01 Accesorio de eje flexible</td><td>Dremel</td><td>225-01</td><td>Extensión flexible Dremel Dremel</td></tr><tr><td>4300 Herramienta rotativa Dremel 4300</td><td>Taladro de ejemplo</td><td>Dremel</td><td>kit</td></tr> de <tr><td>pinzas y tuercas Dremel</td><td>4485</td><td></td><td>Adaptadores para varios Accesorios/brocas para herramientas Dremel</td></tr><tr><td>Eagle 33 galones Rojo Bolsa de residuos de riesgo biológico</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-988-501</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf DNA LoBind 2 mL tubo de microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-698-792</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (grado de biología molecular)</td><td>Millipore Sigma</td><td>1.08543</td><td></td></tr><tr><td>Mascarilla quirúrgica de nivel 2 aprobada por la FDA</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-206-0397</td><td>EPI</td></tr><tr><td>Guantes de nitrilo Fisherbrand Comfort Fisher</td><td>Scientific</td><td>19-041-171X</td><td></td></tr><tr><td>EPI Gafas de seguridad</td><td>Fisherbrand PPE Fisher Scientific</td><td>19-130-208X</td><td>PPE</td></tr><tr><td>Granger Tornillo de banco estacionario Granger</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1336173</td><td>tornillo de banco</td></tr><tr><td>Invitrogen UltraPure Agua destilada sin DNasa/Rnasa</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-977-023</td><td></td></tr><tr><td>Joyeros Sierra</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-949-231</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Sigma-Aldritch</td><td>Z188956</td><td></td></tr><tr><td>Labconco Purifier Logic Gabinete de bioseguridad</td><td>Fisher Scientific</td><td>30-368-1101</td><td></td></tr><tr><td>LookOut DNA Erase</td><td>Millipore Sigma</td><td>L9042-1L</td><td></td></tr><tr><td>Barco de pesaje medio</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS120223</td><td></td></tr><tr><td>MSC 10pc juego de alicates/abrazaderas</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-129-5352</td><td>Miscelánea&nbsp; abrazaderas/mordazas para sujetar de forma segura las muestras durante la perforación/corte</td></tr><tr><td>Sartorius Quintix Semi-Micro Balance</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-560-019</td><td>balanza cerrada</td></tr><tr><td>Tyvek overol con capucha</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-361-7X</td><td></td></tr><tr><td>PPE Papel de pesaje</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS120116</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolos optimizados de muestreo óseo para la recuperación de adn antiguo de restos arqueológicos

Optimized Bone Sampling Protocols for the Retrieval of Ancient DNA from Archaeological Remains

Los métodos presentados aquí buscan maximizar las posibilidades de recuperación de ADN humano de restos arqueológicos antiguos al tiempo que limitan el material de muestra de entrada. Esto se hizo apuntando a lugares de muestreo anatómico previamente determinados para producir las mayores cantidades de ADN antiguo (ADNa) en un análisis comparativo de la recuperación de ADN en todo el esqueleto. Investigaciones anteriores han sugerido que estos protocolos maximizan las posibilidades de recuperación exitosa del ADN humano y patógeno antiguo de restos arqueológicos. Los rendimientos de ADN fueron evaluados previamente por Parker et al. 2020 en una amplia encuesta de preservación de ADNa a través de múltiples elementos esqueléticos de 11 individuos recuperados del cementerio medieval (datado por radiocarbono en un período de alrededor de (ca.) 1040-1400 CE, rango calibrado 2-sigma) en Krakauer Berg, un asentamiento medieval abandonado cerca de Peißen, Alemania. Estos ocho puntos de muestreo, que abarcan cinco elementos esqueléticos (pars petrosa, molares permanentes, vértebras torácicas, falange distal y astrágalo) produjeron con éxito ADN humano antiguo de alta calidad, donde los rendimientos fueron significativamente mayores que el promedio general en todos los elementos e individuos. Los rendimientos fueron adecuados para su uso en los análisis genéticos poblacionales más comunes aguas abajo. Nuestros resultados apoyan el uso preferencial de estos lugares de muestreo anatómico para la mayoría de los estudios que involucran el análisis de ADN humano antiguo de restos arqueológicos. La implementación de estos métodos ayudará a minimizar la destrucción de preciosos especímenes arqueológicos.

En un estudio separado 11, se extrajo ADN del polvo óseo generado a partir de cada ubicación de muestreo anatómico en11 individuos, utilizando un protocolo estándar de extracción de ADN optimizado para fragmentos cortos de tejido calcificado2. Luego se produjeron bibliotecas monocatenarias28 y se secuenciaron en un HiSeq 4000 (extremo pareado de 75 pb) a una profundidad de ~ 20,000,000 lecturas por muestra. Los datos de secuencia resultantes se evaluaron para determinar el contenido de ADN humano endógeno utilizando la tubería EAGER29 (configuración de BWA: longitud de semilla de 32, penalización de desajuste de 0.1, filtro de calidad de mapeo de 37). Todos los resultados representativos se informan utilizando las mismas métricas que Parker et al. 202011 para mayor coherencia. Las bibliotecas de las porciones en polvo de la pars petrosa produjeron, en promedio, ADN endógeno más alto que cualquiera de los otros 23 lugares de muestreo anatómico estudiados (Figura 6A-B). Los siete lugares de muestreo anatómico adicionales presentados en este protocolo (el cemento, el primer paso de la cámara de la pulpa dental y la dentina de los molares permanentes; el hueso cortical del cuerpo vertebral y el arco vertebral superior de la vértebra torácica; el hueso cortical del mechón apical de la falange distal; y el hueso cortical del cuello del astrágalo) produjeron los siguientes rendimientos más altos (sin significación estadística entre estos lugares de muestreo anatómico; Figura 6A-B; Archivo complementario 1: DNAPreCap endógeno). Todas estas ubicaciones alternativas produjeron consistentemente rendimientos de ADN adecuados para los análisis genéticos de poblaciones estándar, como los análisis mitocondriales y los análisis de polimorfismo de nucleótido único (SNP). Las tasas de duplicación en las bibliotecas derivadas de todas las ubicaciones de muestreo anatómico fueron bajas (factores de conglomerado &lt; 1,2 en promedio, calculado como la relación entre todas las lecturas de mapeo y lecturas de mapeo únicas, Tabla 2; Archivo complementario 1: ClusterFactor), lo que indica que todas las bibliotecas examinadas eran de muy alta complejidad. Del mismo modo, las estimaciones promedio de contaminación por ADN humano exógeno fueron bajas, con un promedio de &lt; 2% (contaminación del cromosoma X en hombres, n = 7, según lo informado por la tubería ANGSD30) en todos los lugares de muestreo anatómico, excepto en el arco vertebral superior (contaminación promedio estimada: 2.11%, con una muestra eliminada como valor atípico; KRA005: 19,52%, véase el cuadro 2; Archivo complementario 1: Xcontaminación). La longitud promedio del fragmento (después de filtrar para eliminar todas las lecturas &lt; 30 pb) fue más baja en el material recolectado de la cámara de la pulpa dental y la dentina, sin variación significativa entre otras ubicaciones de muestreo anatómico (55.14 pb y 60.22 pb, respectivamente, en comparación con una mediana promedio de 62.87, valores de p por pares &lt; 0.019, Tabla 2; Archivo complementario 1: AvgFragLength). Además, los dientes y las vértebras torácicas contienen múltiples ubicaciones de muestreo anatómico donde se observó una alta recuperación endógena de ADN, lo que las hace particularmente adecuadas como alternativas a la pars petrosa.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63250/63250fig06.jpg"> Figura 6: Contenido de ADN humano para todas las muestras examinadas. Las líneas negras representan la media general, mientras que las líneas rojas representan la mediana (sólido: proporción de ADN humano, discontinuo: lecturas humanas mapeadas por millón de lecturas generadas). Los lugares de muestreo anatómico individuales con una proporción promedio de ADN humano superior a la media general (8,16%) se colorean en todos los análisis. (A) La proporción de lecturas que se asignan al genoma de referencia hg19. La línea discontinua azul representa el máximo teórico dados los parámetros de mapeo de la tubería (generados usando Gargammel31 para simular una distribución aleatoria de 5,000,000 lecturas del genoma de referencia hg19 con daño simulado). Las medias individuales (X negra) y las medianas (círculo rojo) se informan para aquellas muestras con una proporción promedio de ADN humano más alta que la media general. Los intervalos de confianza indican los límites superior e inferior, excluidos los valores atípicos estadísticos. (B) El número de lecturas únicas que se asignan al genoma de referencia hg19 por millón de lecturas de esfuerzo de secuenciación (75 pb de final pareado). Los intervalos de confianza indican los límites superior e inferior, excluidos los valores atípicos estadísticos. Esta figura ha sido adaptada de Parker, C. et al. 202011. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63250/63250fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 2: Niveles promedio de duplicación (lecturas de mapeo/lecturas únicas), longitudes promedio y mediana de fragmentos y estimaciones de contaminación del cromosoma X para todas las ubicaciones de muestreo anatómico. Error notificado como el error estándar de la media. Esta tabla ha sido adaptada de Parker, C. et al. 202011.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Lugar de muestreo</td>
			<td>Factor de duplicación promedio (# lecturas asignadas /# lecturas asignadas únicas)</td>
			<td>Longitud media del fragmento en pb</td>
			<td>Proporción media estimada de contaminación por el cromosoma X</td>
		</tr><tr><td>Pirámide de Petrous</td>
			<td>1.188 ± 0.006</td>
			<td>65,40 ± 1,36</td>
			<td>0,000 ± 0,003</td>
		</tr><tr><td>Cementum</td>
			<td>1.197 ± 0.028</td>
			<td>67,28 ± 1,76</td>
			<td>0,011 ± 0,003</td>
		</tr><tr><td>Dentina</td>
			<td>1.188 ± 0.061</td>
			<td>60,22 ± 2,37</td>
			<td>0,002 ± 0,007</td>
		</tr><tr><td>Pulpa</td>
			<td>1.179 ± 0.024</td>
			<td>55,14 ± 2,90</td>
			<td>0,013 ± 0,006</td>
		</tr><tr><td>Falange distal</td>
			<td>1.191 ± 0.049</td>
			<td>65,95 ± 1,08</td>
			<td>0,013 ± 0,005</td>
		</tr><tr><td>Cuerpo vertebral</td>
			<td>1.194 ± 0.037</td>
			<td>66,14 ± 1,03</td>
			<td>0,008 ± 0,003</td>
		</tr><tr><td>Arco vertebral superior</td>
			<td>1,19 ± 0,017</td>
			<td>63,02 ± 1,23</td>
			<td>0,021 ± 0,009*</td>
		</tr><tr><td>Astrágalo</td>
			<td>1.198 ± 0.010</td>
			<td>68,20 ± 1,24</td>
			<td>0,011 ± 0,003</td>
		</tr><tr><td>*Muestra KRA005 eliminada como valor atípico en 0.1952</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Disponibilidad del código Todos los programas de análisis y módulos R utilizados en los análisis de este manuscrito están disponibles gratuitamente de sus respectivos autores. Todo el código R personalizado está disponible a pedido.
Disponibilidad de datos Todos los datos brutos utilizados en el cálculo de resultados representativos están disponibles gratuitamente en el repositorio de datos ENA del Archivo Europeo de Nucleótidos (número de acceso PRJ-EB36983) o en materiales complementarios de Parker, C. et al.11.
Archivo complementario 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63250/SupplementalFile1.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

El protocolo presenta una serie de protocolos de mejores prácticas para la recolección de polvo óseo de ocho ubicaciones de muestreo anatómico recomendadas (ubicaciones específicas en un elemento esquelético dado) a través de cinco elementos esqueléticos diferentes de individuos medievales (radiocarbono fechado en un período de ca. 1040-1400 CE, rango calibrado 2-sigma).

Protocolos optimizados de muestreo óseo para la recuperación de ADN antiguo de restos arqueológicos

The methods presented here seek to maximize the chances for the recovery of human DNA from ancient archaeological remains while limiting input sample ...

Estos protocolos sirven como pautas de mejores prácticas para la generación de polvo óseo para su uso en la extracción de ADN aguas abajo en una variedad de elementos esqueléticos. Hay algunos protocolos de muestreo de ADN antiguo publicados para lugares distintos de la dentina y la pirámide petrosa. Hoy, mostraremos los métodos de muestreo detallados para tres alternativas.Estos métodos también muestran un gran potencial para su uso con restos forenses degradados, pero también como línea de base para desarrollar técnicas similares con especímenes no humanos. Realice todas las tomas de muestras en una sala limpia dedicada, bajo una campana de PCR equipada con luz UV o un gabinete de bioseguridad. Apague el flujo de aire y extienda papel de aluminio estéril a través de la parte superior del banco para atrapar cualquier polvo o fragmento de hueso perdido.Coloque una hoja de papel de pesaje en una bandeja de pesaje estéril. Sostenga el molar descontaminado por el esmalte con la raíz hacia abajo sobre una bandeja de pesaje, usando una abrazadera de mano. Equipe un taladro dental con una rueda de corte circular con bordes de diamante.Con el taladro ajustado a un ajuste de velocidad media, toque ligeramente el borde del taladro hasta la raíz en un ángulo de aproximadamente 20 grados. Raspa la muestra hacia abajo en la bandeja para recoger el material amarillo más externo de la raíz. Detenga la recolección una vez que el material más ligero de la dentina se haga visible.Transfiera el polvo a un tubo LoBind Safe-Lock de dos mililitros y registre esta masa de polvo recolectada utilizando una balanza cerrada con una precisión de al menos 0.01 miligramos. Transfiera el polvo del papel de pesaje a un tubo LoBind Safe-Lock de dos mililitros para su extracción. Guarde este tubo a 20 grados centígrados.Asegúrese de recuperar todos los fragmentos óseos y la mayor cantidad de polvo posible. Cambie la lámina entre cada muestreo, desechando la lámina usada en una bolsa de riesgo biológico en autoclave. Descontamine el área de trabajo y extienda papel de aluminio estéril por la parte superior del banco cada vez antes de pasar al siguiente hueso.Coloque una pequeña hoja de papel de pesaje en una bandeja de pesaje estándar. Retire y deseche la capa más externa del hueso cortical del arco vertebral superior con un taladro dental. Luego, asegure las vértebras en una abrazadera de mano, con el proceso espinoso hacia afuera y el aspecto superior hacia abajo.Mientras sostiene la vértebra, perfore hacia arriba en el centro de la muesca en forma de V, formada por la fusión del proceso espinoso con las laminillas con baja velocidad y alto torque. Deje de perforar cuando haya una caída notable en la resistencia. Cambie ligeramente la posición de perforación y repita hasta que se recojan de 50 a 100 miligramos de polvo óseo.Transfiera el polvo óseo del papel de pesaje a un tubo LoBind de dos mililitros para su extracción y guárdelo a 20 grados centígrados. Asegúrese de que se recuperen todos los fragmentos óseos y la mayor cantidad de polvo posible antes de desechar una lámina. Descontamine el área de trabajo y prepárese para la recolección de muestras, como se describió anteriormente.Coloque una pequeña hoja de papel de pesaje en una bandeja de pesaje estándar. Sostenga la cúpula del astrágalo hacia arriba, y la superficie medial hacia el colector, sobre la bandeja de pesaje. Raspa el hueso cortical a una profundidad de aproximadamente un milímetro desde el cuello del astrágalo usando un taladro dental con una broca de bajo calibre ajustada a baja velocidad y alto torque.Cambie la posición de perforación y repita esto hasta que se recojan aproximadamente de 50 a 100 miligramos de polvo óseo. Transfiera este polvo óseo del papel de pesaje a un tubo LoBind de dos mililitros para su extracción. Guarde el polvo a 20 grados centígrados indefinidamente.Almacene el hueso restante y el exceso de polvo en un ambiente estéril seco y con temperatura controlada a 25 grados centígrados. Deseche todos los residuos en bolsas o recipientes de riesgo biológico para autoclave. Esterilice o descontamine todo el equipo reutilizable y exponerlo a los rayos UV entre cada muestreo.La Pars petrosa produjo ADN endógeno más alto que los otros 23 lugares de muestreo anatómico estudiados. Las siete ubicaciones adicionales de muestreo anatómico presentadas en este protocolo produjeron los siguientes rendimientos más altos. Las ubicaciones alternativas produjeron consistentemente rendimientos de ADN adecuados para los análisis genéticos de poblaciones estándar.Las tasas de duplicación en las bibliotecas derivadas de todas las ubicaciones de muestreo anatómico fueron bajas, lo que indica una alta complejidad. Los dientes, así como las vértebras torácicas mostraron una recuperación molecular adecuada. Uno de los aspectos más desafiantes del muestreo óseo es el proceso de perforación, como cómo sostener un taladro, dónde perforar y cuándo detener la perforación.

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Investigación

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Protocolos optimizados de muestreo óseo para la recuperación de ADN antiguo de restos arqueológicos

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