Uso de tinción de rojo de alizarina para detectar la pérdida ósea inducida químicamente en larvas de pez cebra
28 de diciembre de 2021
Aquí, hemos utilizado la tinción de rojo alizarina para mostrar que la exposición al acetato de plomo causa un cambio de masa ósea en las larvas de pez cebra. Este método de tinción se puede adaptar a la investigación de la pérdida ósea en larvas de pez cebra inducida por otros tóxicos peligrosos.
Este método puede ayudar a detectar la toxicidad ósea inducida por productos químicos en el pez cebra. La tinción de rojo de alizarina de tejido fijo genera un registro permanente de cambios esqueléticos que pueden facilitar las comparaciones de varias muestras. Esta técnica podría ser útil para estudiar la osteoporosis en el modelo de pez cebra, ya que una de las características de la osteoporosis es la disminución de la masa ósea.
Retire 10 larvas de pez cebra al azar de cada grupo a los nueve días después de la fertilización, y fije el pez en un mililitro de aldehído paraformado al 2% y 1X PBS durante dos horas. Decantar la solución y lavar la larva de pez cebra utilizando 100 milimolares Tris HCL con un pH de 7,5 o 10 milimolares de cloruro de magnesio. Para la decoloración, decantar la solución e incubar la larva durante cinco minutos en una serie de soluciones como se describe en el manuscrito.
Después de la incubación final, decantar la solución y eliminar el pigmento blanqueando con una solución que consiste en 3% de peróxido de hidrógeno e hidróxido de potasio al 0,5%. Observe una vez cada 10 minutos hasta que el pigmento se elimine por completo. Enjuague la larva de pez cebra varias veces con 25% de glicerina, hidróxido de potasio al 0,1% durante 10 minutos cada uno hasta que no haya burbujas.
Mancha en la larva remojándola en un mililitro de 0,01% de Alizarina. Decantar la solución y agregar un mililitro de 50% de glicerina o hidróxido de potasio al 0,1% para limpiar el fondo. Almacene el pescado en hidróxido fresco al 50% de glicerina o 0,1% de potasio para su posterior observación.
Transfiera una larva a la vez al portaobjetos de vidrio manteniendo la larva en el medio de la gota de líquido. Observe la larva bajo un microscopio estereoscópico. Encienda la cámara.
Abra el software y mantenga la configuración predeterminada. Haga clic en AE y elija un tiempo de exposición adecuado para obtener la mejor imagen. Capture todas las imágenes con la misma configuración.
Guarde las imágenes en formato punto tiff para su posterior análisis. Haga doble clic en el icono imageJ. Para analizar las imágenes guardadas, haga clic en el archivo, luego ábralo, luego haga clic en la imagen, luego escriba y seleccione ocho bits.
Haga clic en editar e invierta. Haga clic en analizar, luego calibrar. Seleccione OD sin calibrar en la interfaz emergente.
Compruebe la calibración global en la parte inferior izquierda de la interfaz inferior y haga clic en Aceptar. Haga clic en analizar, establecer escala y, a continuación, eliminar escala. Marque global a continuación y haga clic en Aceptar.
Haga clic en analizar y, a continuación, establezca las medidas. Seleccione el área del elemento en la interfaz emergente. Marque el límite al umbral a continuación para medir solo el rango seleccionado y haga clic en Aceptar.
Haga clic en la imagen, ajuste, luego en el umbral y deslice el control deslizante en el centro de la interfaz emergente. Para seleccionar el umbral adecuado para que se seleccionen todos los objetivos que se van a probar en una imagen. Y haga clic en establecer.
Haga clic en analizar, luego mida, guarde las fechas. La tinción roja de alizarina es un método sensible y específico para medir los cambios en la mineralización ósea en larvas de pez cebra. A los nueve días después de la fertilización, muchos huesos del esqueleto de la cabeza, como el paraesfenoides, el opercular, el ceratobranquial y la notocorda, se mineralizan y, por lo tanto, se tiñen de rojo.
En contraste, las estructuras no óseas como los otolitos, aparecen de color negro marrón. El análisis digital realizado para cuantificar el área total teñida, mostró una disminución significativa en el área teñida para los grupos de tratamiento de acetato de plomo de 10 y 20 miligramos por litro. Los cambios en la mineralización ósea mostraron dependencia de la dosis.
Para un mejor efecto de tinción y observación, es importante eliminar el pigmento original de las larvas de pez cebra y eliminar las burbujas después del blanqueo.
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Descripción general
Este estudio utiliza la tinción con rojo de alizarina para demostrar que la exposición al acetato de plomo provoca cambios en la masa ósea de larvas de pez cebra. El método es adaptable para investigar la pérdida ósea causada por diversos tóxicos peligrosos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Toxicología
- Biología del desarrollo
Antecedentes
- La tinción con rojo de alizarina es una técnica utilizada para visualizar estructuras esqueléticas.
- El pez cebra es un organismo modelo para estudiar el desarrollo óseo y la toxicidad.
- Se sabe que el acetato de plomo tiene efectos tóxicos sobre los sistemas biológicos.
- La osteoporosis se caracteriza por una disminución de la masa ósea, lo cual puede modelarse en el pez cebra.
Objetivo del estudio
- Evaluar el impacto del acetato de plomo en la masa ósea de larvas de pez cebra.
- Establecer un método para detectar la toxicidad ósea inducida por productos químicos.
- Facilitar comparaciones de cambios esqueléticos entre especímenes.
Métodos Utilizados
- Tinción con rojo de alizarina de tejido de pez cebra fijado.
- Fijación de larvas de pez cebra en paraformaldehído y PBS.
- Lavado de las larvas con Tris HCl o cloruro de magnesio.
- Procedimientos de descoloración según se describe en el manuscrito.
Resultados principales
- La exposición al acetato de plomo provocó cambios observables en la masa ósea.
- El método de tinción proporcionó un registro permanente de los cambios esqueléticos.
- Los resultados respaldan el uso del pez cebra como modelo para estudiar la osteoporosis.
- La metodología permite la investigación de otros tóxicos peligrosos.
Conclusiones
- La tinción con rojo de alizarina es efectiva para evaluar la toxicidad ósea en pez cebra.
- El estudio resalta el potencial del pez cebra en la investigación toxicológica.
- Investigaciones futuras pueden ampliar el conocimiento sobre los efectos de diversos tóxicos en la salud ósea.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la detección temprana de la pérdida ósea inducida químicamente en larvas de pez cebra, apoyando la reducción de riesgos mecanicistas en toxicología y la validación de dianas para las vías de salud esquelética. Al cuantificar los cambios en el tejido mineralizado mediante tinción con rojo de alizarina, proporciona una lectura reproducible y dependiente de la dosis para evaluar los efectos de compuestos sobre la mineralización ósea. El enfoque respalda la confianza predictiva en la optimización de fármacos y el cribado preclínico de seguridad para compuestos activos sobre el hueso.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar hipótesis terapéuticas relacionadas con la mineralización ósea y la integridad esquelética.
- Valor operativo: Apoya la reducción de riesgos biológicos al proporcionar un registro permanente y cuantificable de los cambios esqueléticos en diferentes especímenes.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al identificar compuestos con efectos dependientes de la dosis sobre la masa ósea en las primeras etapas del descubrimiento.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Proporciona mediciones cuantitativas basadas en umbrales del área teñida para permitir comparaciones objetivas entre grupos de tratamiento.
- Valor operativo: Estandariza los protocolos de preparación de muestras y adquisición de imágenes para garantizar la reproducibilidad y escalabilidad en formatos de múltiples pocillos.
- Preparación del ensayo: Genera salidas digitales compatibles con el análisis en ImageJ, lo que permite el cribado de alto contenido de fenotipos de toxicidad ósea.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Valor científico: Modela respuestas esqueléticas relevantes para el ser humano frente a tóxicos, apoyando la alineación de biomarcadores traslacionales para la pérdida ósea.
- Valor operativo: Conecta los flujos de trabajo de descubrimiento y preclínicos al proporcionar un ensayo conservado, basado en vertebrados, para la mineralización ósea.
- Reducción de riesgos: Informa decisiones de avance con ajuste de riesgo al detectar señales de pérdida ósea antes de los estudios en mamíferos.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos y la evaluación preclínica de seguridad, especialmente para compuestos con posibles efectos fuera del blanco sobre los sistemas esqueléticos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis sobre los efectos químicos en las vías de desarrollo y mineralización ósea en un modelo vertebrado.
- Selección: Permite la estandarización de ensayos y lecturas cuantitativas para detectar cambios dependientes de la dosis en el área teñida.
- Análisis: Proporciona mediciones de área calibradas y basadas en umbrales que permiten la comparación estadística de la mineralización ósea entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante la modelización de respuestas esqueléticas conservadas frente a tóxicos en larvas de pez cebra.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la selección de diversas bibliotecas químicas en busca de riesgos de toxicidad ósea.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas al reducir la ambigüedad mecanicista en las vías relacionadas con el hueso.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad mediante pasos estandarizados de fijación, tinción y cuantificación digital.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance/no avance al proporcionar señales tempranas y cuantitativas de la responsabilidad por pérdida ósea.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al identificar riesgos de toxicidad esquelética antes de realizar inversiones significativas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de pez cebra, histología e imágenes fluorescentes o colorimétricas.
- Depende de la microscopía estereoscópica y del software de análisis de imágenes (por ejemplo, ImageJ) para la cuantificación estandarizada.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de tinción y de los ajustes de umbral para obtener resultados reproducibles.
- Implica consideraciones de adaptación al extenderse a otros sistemas modelo o clases químicas distintas del acetato de plomo.
- Limitado por la necesidad de pasos de eliminación de pigmentos y de clarificación del fondo para garantizar una detección precisa de la señal.
