Name: Aislamiento de células endoteliales pulmonares primarias de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Aprende a aislar células endoteliales pulmonares primarias de ratón con alta pureza usando selección con inmunoperlas magnéticas. Este protocolo permite obtener cultivos viables para estudios de biología vascular y funciones endoteliales.

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Este trabajo fue apoyado por NIH T32GM008440 (JH / EW) y NIH R01AI058106 (JH). Reconocemos el UCSF Parnassus Flow Cytometry Core (RRID: SCR_018206) apoyado en parte por Grant NIH P30 DK063720 y por NIH S10 Instrumentation Grant S10 1S10OD021822-01.

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California en San Francisco. Para el estudio se utilizaron crías de ratón neonatal macho C57BL/6 (edad 5-7 días). Todo el protocolo tarda de 7 a 10 días (Figura 1).
1. Preparación del medio celular endotelial
<ol><li>Prepare el medio basal: Medio Eagle Modificado de Dulbecco con 4,500 mg/L de glucosa y 4 mM de L-Glutamina (DMEM) suplementado con 20% (v/v) de suero fetal bovino inactivado por calor, 100 U/100 μg/mL de penicilina/estreptomicina y 25 mM de HEPES (ver Tabla de Materiales). Filtro estéril con filtro de 22 μM. Conservar el medio basal a 4 °C y utilizarlo en el plazo de un mes a partir de su preparación.</li>
	<li>Prepare el medio completo: Medio basal suplementado con 100 μg/mL de heparina, 100 μg/mL de suplemento de crecimiento celular endotelial, 1x aminoácidos no esenciales y 1 mM de piruvato de sodio (ver Tabla de Materiales). Filtro estéril con filtro de 22 μM. Conservar a 4 °C y utilizar en el plazo de un mes a partir de la preparación.</li>
</ol>2. Prerecubrimiento de perlas magnéticas anti-rata13
<ol><li>Hacer 50 ml de tampón de lavado de perlas: solución tamponada con fosfato (PBS) suplementada con albúmina sérica bovina (BSA) al 0,1% (p/v). Filtro estéril con filtro de 22 μM y conservar a 4 °C y utilizar en el plazo de un mes a partir de la preparación.</li>
	<li>Vaporizar las perlas magnéticas durante unos segundos para resuspender las perlas y pipetear 50 μL de las perlas (2 x 107 perlas) en dos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, uno para CD-31 y otro para CD-102 (ver Tabla de materiales). Agregue 1 ml de tampón de lavado de perlas y mezcle bien. NOTA: Todos los volúmenes mencionados se utilizaron para aislar células endoteliales de 3-4 crías de ratón neonatales (5-7 días de edad). CD-31 y CD-102 son los marcadores de superficie celular endotelial utilizados para la selección de inmunoperlas magnéticas.</li>
	<li>Coloque los tubos en un separador magnético y retire el sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio. Repita el lavado 3 veces con 1 ml de tampón de lavado de perlas cada vez.</li>
	<li>Resuspender las perlas en el volumen original de la perla, 50 μL, con tampón de lavado de perlas. Luego agregue 5 μL (2.5 μg) de anticuerpo (CD-31/CD-102) a cada 50 μL de perlas.</li>
	<li>Incubar la suspensión del talón en una rotación suave en un rotador de extremo a extremo durante la noche a 4 °C o durante 3 h a temperatura ambiente. Repita el lavado 4 veces.</li>
	<li>Resuspender las inmunoperlas en el volumen original, 50 μL, con tampón de lavado de perlas y almacenar a 4 °C y utilizar en un plazo de 1-2 semanas.</li>
</ol>3. Aislamiento y recubrimiento de las células pulmonares
<ol><li>Prepare la solución de colagenasa tipo 1 el día del aislamiento: Agregue 25 mg de colagenasa tipo 1 a 25 ml de HBSS (consulte la Tabla de materiales). Incubar a 37 °C durante 1 h con rotación suave y filtro estéril utilizando un filtro de 22 μM. Mantener la solución caliente a 37 °C.</li>
	<li>Inyectar cachorros de ratón de 5-7 días de edad por vía intramuscular con heparina (25 μL/ratón, 1.000 U/ml) 10 min antes de la eutanasia para minimizar la activación de las células endoteliales y la formación de coágulos14,15.</li>
	<li>Eutanasia al cachorro de ratón con decapitación usando tijeras afiladas de acuerdo con las Pautas AVMA 2020 para la eutanasia. Luego, fije el mouse a una placa de disección con el lado ventral hacia arriba.</li>
	<li>Rocíe la carcasa con etanol al 70%, luego exponga la cavidad torácica cortando primero el diafragma y luego cortando superiormente hacia arriba a lo largo de todas las paredes laterales del tórax. Reflejar la caja torácica en ese entonces expone el corazón y los pulmones. NOTA: Use fórceps y tijeras más pequeños para este paso dado el pequeño tamaño de los ratones neonatos, y asegúrese de no perforar el corazón o los pulmones, ya que esto conducirá a una extracción inadecuada de sangre de los pulmones.</li>
	<li>Conecte una aguja de 25 G a una jeringa de 10 ml e inyecte 5 ml de DMEM frío en el ventrículo derecho del corazón para extraer sangre de los pulmones. Los pulmones se volverán blancos.</li>
	<li>Retire los pulmones de la cavidad torácica, un lóbulo a la vez, cortando los lóbulos distales a los bronquios correspondientes.</li>
	<li>Agrupar todos los lóbulos pulmonares en un tubo cónico de 50 ml precargado con 20 ml de medio basal helado (a partir del paso 1.1).</li>
	<li>Repita los pasos 3.2-3.7 con los otros cachorros de ratón, agrupando todos los lóbulos pulmonares en el mismo tubo cónico de 50 ml.</li>
	<li>Agite suavemente el tubo a mano durante 10-15 s para lavar cualquier exceso de glóbulos rojos que se aprecie visualmente en la superficie de los pulmones. NOTA: No es necesario extraer toda la sangre de dentro o alrededor de los pulmones; Sin embargo, esto mejora la pureza. Cualquier manipulación adicional de tejidos debe realizarse en una campana estéril.</li>
	<li>Use un colador celular para extraer los pulmones del medio y transfiera el tejido a un plato de cultivo de tejido estéril y desechable de 100 mm de diámetro y pique con tijeras esterilizadas.</li>
	<li>Transfiera el tejido picado al tubo cónico de 50 ml con 25 ml de solución de colagenasa precalentada (paso 3.1). Agitar suavemente en una batidora giratoria durante 45 min a 37 °C. NOTA: La sobredigestión durante incluso 60 minutos puede conducir a rendimientos más bajos.</li>
	<li>Conecte una jeringa de 20 ml a una cánula roma de 15 G (consulte la Tabla de materiales) y triture la suspensión de 10 a 15 veces para romper el tejido en una suspensión celular. Sea vigoroso, pero evite la espuma excesiva. NOTA: Ya no habrá piezas visibles del pulmón y, en cambio, la suspensión estará turbia al completar este paso.</li>
	<li>Filtrar la suspensión a través de un filtro de células de 70 μm en un tubo cónico fresco de 50 ml. Además, enjuague el tubo cónico utilizado para la digestión y el colador celular con 15 ml adicionales de medio basal.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular a 400 x g durante 8 min a 4 °C.</li>
	<li>Retirar el sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio y volver a suspender el pellet en 2 ml de medio completo. Pasar a un matraz T-75 y añadir 8 ml de cultivo medio completo a 37 °C en una incubadora humidificada al 5% deCO2 .</li>
	<li>Al día siguiente, lave los frascos dos veces con 10 ml de la solución salina equilibrada de Hank sin calcio y magnesio (HBSS/CMF) (consulte la Tabla de materiales) y agregue 10 ml de medio completo. NOTA: Después de 2-3 días, el cultivo será 90-95% confluente y listo para el aislamiento primario de inmunoperlas.</li>
</ol>4. Aislamiento primario de inmunoperlas y cultivo de células endoteliales
<ol><li>Lave las células endoteliales adherentes dos veces con 10 mL HBSS/CMF. Añadir 2 ml de solución de desprendimiento celular libre de tripsina (ver Tabla de materiales) e incubar a 37 °C durante ~5 min. Asegúrese de que todas las celdas se han levantado del matraz. NOTA: Se debe usar una solución de desprendimiento sin tripsina en lugar de tripsina, ya que la tripsina puede interrumpir el marcador de adhesión de la superficie celular CD-31.</li>
	<li>Agregue 8 ml de medio basal para neutralizar la solución de desprendimiento celular y transfiera el contenido a un tubo cónico de 15 ml. Girar hacia abajo a 400 x g durante 4 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retirar el sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio y resuspender las células en 2 ml de medio basal. Transfiera la suspensión de 2 ml de celda a un tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Perlas recubiertas anti-CD-31 Vortex durante unos segundos para resuspender las perlas y añadir 30 μL de perlas por cada 2 ml de suspensión celular. Asegure la tapa.</li>
	<li>Incubar el tubo durante 10 minutos a temperatura ambiente en un rotador de extremo a extremo. Luego coloque los tubos en un separador magnético y déjelos durante 2 minutos.</li>
	<li>Suavemente usando una pipeta Pasteur de vidrio, aspirar el sobrenadante. Retire el tubo del imán, resuspenda el pellet de células de perla agregando 3 ml de medio basal al tubo y pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces.</li>
	<li>Vuelva a colocar el tubo del separador magnético durante 2 minutos y, a continuación, aspire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur.</li>
	<li>Repita los lavados (paso 4.6-4.7) al menos 4 veces hasta que el sobrenadante parezca claro.</li>
	<li>Después del lavado final, resuspender el pellet de células de perla en un medio de crecimiento completo de 3 ml y transferirlo a un matraz T-75. Añadir 7 ml del medio de cultivo completo e incubar a 37 °C en una incubadora humidificada deCO2 al 5%.</li>
	<li>Al día siguiente, lave las celdas con HBSS/CMF, luego agregue 10 ml de medio completo fresco. Reemplace los medios con 10 ml de medio completo fresco cada 2-3 días hasta que el 90-95% sea confluente. NOTA: Una vez que las células son ~ 90-95% confluentes, lo que toma ~ 3-4 días, el cultivo está listo para el aislamiento secundario de inmunoperlas.</li>
</ol>5. Aislamiento secundario de inmunoperlas y cultivo de células endoteliales
<ol><li>Lave las células endoteliales adherentes dos veces con 10 ml de HBSS/CMF. Añadir 2 ml de solución de desprendimiento celular libre de tripsina e incubar a 37 °C durante ~5 min. Asegúrese de que todas las celdas se han levantado del matraz.</li>
	<li>Agregue 8 ml de medio basal para neutralizar la solución de desprendimiento celular y transfiérala a un tubo cónico de 15 ml. Girar hacia abajo a 400 x g durante 4 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retirar el sobrenadante con una pipeta Pasteur de vidrio y resuspender las células en 2 ml de medio basal. Transfiera la suspensión de 2 ml de celda a un tubo de poliestireno de fondo redondo de 5 ml.</li>
	<li>Perlas recubiertas anti-CD-102 Vortex durante unos segundos para resuspender las perlas y añadir 30 μL de perlas por cada 2 mL de suspensión celular. Asegure la tapa.</li>
	<li>Incubar el tubo durante 10 minutos a temperatura ambiente en un rotador de extremo a extremo. Coloque los tubos en un separador magnético y déjelos actuar durante 2 minutos. A continuación, aspire suavemente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur.</li>
	<li>Retire el tubo del imán, resuspenda el pellet de células de perla agregando 3 ml de medio basal al tubo y pipetear hacia arriba y hacia abajo varias veces.</li>
	<li>Vuelva a colocar el tubo del separador magnético durante 2 minutos antes de aspirar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur.</li>
	<li>Repita los lavados (paso 5.6-5.7) 4 veces o más hasta que el sobrenadante parezca claro.</li>
	<li>Después del lavado final, resuspender el pellet de células de perla en un medio de crecimiento completo de 3 ml y transferirlo a un matraz T-75. Añadir 7 ml de medio de crecimiento completo e incubar a 37 °C en una incubadora humidificada deCO2 al 5%.</li>
	<li>Al día siguiente, lave las celdas con HBSS/CMF, luego agregue 10 ml de medio completo fresco. Reemplace los medios con 10 ml de medio completo fresco cada 2-3 días hasta que el 90-95% sea confluente. Una vez que las células endoteliales están completamente confluentes, están listas para la experimentación. Las células no deben usarse más allá del paso seis, ya que puede ocurrir senescencia y otros tipos de células pueden tomar el control.</li>
</ol>6. Confirmación de los marcadores de superficie celular endotelial mediante citometría de flujo
<ol><li>Después de usar la solución de desprendimiento celular libre de tripsina para separar las células, resuspenda el pellet celular a 1 x 10 5 células/ml y alícuota 100 μL de la suspensión celular en tres tubos de microcentrífuga de1,5 ml, marcados como 1, 2 y 3.</li>
	<li>Lave las celdas con 1 ml de 1x PBS. Centrifugar a 500 x g durante 2 min a 4 °C. Retire el tampón de lavado y repita dos veces.</li>
	<li>Resuspender el pellet celular en 100 μL de 1x PBS. Al tubo 1, agregue 1 μL de anticuerpo conjugado contra el ratón CD-31 (PECAM-1) (por ejemplo, anticuerpo CD-31 contra el ratón con ficoeritrina (PE)) y 1 μL de CD-102 conjugado contra el ratón (ICAM-2) (por ejemplo, anticuerpo CD102 contra el ratón anti-ratón con isotiocianato de fluoresceína (FITC)) (consulte la Tabla de materiales). Al tubo 2, agregue los controles de isotipo apropiados. El tubo nº 3 permanecerá sin teñir.</li>
	<li>Incubar los tubos en hielo y en la oscuridad durante 30-45 min.</li>
	<li>Añadir 1 ml de PBS a cada tubo, vórtice suavemente y centrifugar a 500 x g durante 2 min a 4 °C. Retire el lavado y repita tres veces. Resuspender el pellet final en 500 μL de PBS.</li>
	<li>Mantener los tubos cubiertos con papel de aluminio a 4 °C hasta el análisis. El análisis debe completarse dentro de 3-4 h.</li>
	<li>Adquiera datos de flujo utilizando un citómetro. Utilice una muestra no teñida como control negativo para ajustar correctamente el voltaje del láser de acuerdo con la autofluorescencia celular. Población total de celdas de puerta con una gráfica dispersa hacia adelante y una gráfica de dispersión lateral. NOTA: Después de excluir dobletes, las células CD31+ CD102+ doble positivas se definen como células endoteliales.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo simple se presta a células endoteliales de alta pureza de pulmones murinos. Aunque el tiempo total de principio a fin es de 7-10 días, el tiempo práctico es de alrededor de 3-4 h. En comparación con otros métodos13,14,15,16, el protocolo actual se simplifica, manteniendo los pasos esenciales sin comprometer el rendimiento y la pureza.
Vale la pena señalar algunos aspectos críticos de este protocolo. Primero, es importante usar cachorros neonatales en lugar de ratones adultos. En nuestra experiencia, las células endoteliales de ratones adultos no proliferan tan fácilmente como las células de cachorros neonatales, y son fácilmente invadidas por células con morfología fusiforme consistente con fibroblastos o células madre mesenquimales15,16. Una posible explicación para la diferencia es que el desarrollo pulmonar está en la etapa alveolar en ratones neonatos, caracterizada por la proliferación más rápida de células endoteliales20. También puede haber algún grado de senescencia con el envejecimientode 21 años. El tiempo de digestión enzimática también debe ser preciso, ya que la subdigestión puede conducir a una suspensión unicelular de bajo rendimiento. Por el contrario, la digestión excesiva puede conducir a una cantidad sustancial de muerte celular. Hemos determinado que el tiempo óptimo para la digestión de la colagenasa es de 45 minutos. Esto es seguido por la disociación mecánica con una cánula roma. También se ha descrito la instilación de colagenasa intratraqueal durante la digestión enzimática14,15; Sin embargo, esto puede llevar mucho tiempo y conduce a una digestión incompleta durante el trabajo actual. Por último, algunos protocolos proceden directamente al aislamiento de inmunoperlas inmediatamente después de la digestión enzimática13,16. Hemos encontrado que cultivar las células del pulmón disociado en el medio durante uno o dos días antes de hacer la selección de inmunoperlas aumenta sustancialmente el rendimiento de células endoteliales viables y altamente puras. Esto puede estar relacionado con la velocidad de obtener células aisladas en el medio de cultivo de tejidos, lo que conduce a una menor muerte celular en las primeras etapas después de la eliminación de los ratones, una mayor densidad de siembra inicial y el tiempo para que las células endoteliales se adhieran y proliferen antes del primer aislamiento de inmunoperlas.
Las limitaciones de la preparación y análisis de las células endoteliales de ratón son las siguientes. Cada ratón solo proporciona un número limitado de celdas que deben usarse dentro de unos pocos pasajes. Este problema se puede superar agrupando la digestión pulmonar de varios ratones. Desafortunadamente, no tenemos éxito en nuestros esfuerzos por criopreservar y descongelar las células para su uso futuro. A pesar de estas limitaciones, las células endoteliales del ratón tienen algunas ventajas. Pueden ser útiles, particularmente en situaciones en las que las células endoteliales humanas no se pueden usar (por ejemplo, eliminación de genes), cuando se requieren estudios complementarios para corroborar los resultados con células humanas, o cuando la heterogeneidad de las respuestas de las células endoteliales de diferentes donantes humanos hace que la reproducibilidad entre experimentos sea problemática6. La población homogénea de células endoteliales de ratones genéticamente idénticos permite la reproducibilidad entre experimentos y el estudio de genes y vías específicas en condiciones de fondo estables.
Las células endoteliales de ratón se pueden utilizar para múltiples aplicaciones para proporcionar información sobre la activación endotelial y la disfunción en diferentes procesos de enfermedad. Por ejemplo, las células endoteliales desempeñan un papel integral en la sepsis, contribuyendo a las respuestas beneficiosas y patológicas a través de sus funciones en la activación de la inflamación localizada y sistémica, la promoción del tráfico de leucocitos y la activación en los tejidos, la regulación de la coagulación y la modulación de la permeabilidad endotelial 2,22,23 . Este protocolo simple proporciona células endoteliales viables y funcionales que se pueden usar en ensayos para cada uno de estos procesos endoteliales.

El interés en el estudio del endotelio vascular ha crecido recientemente, ya que la disfunción de las células endoteliales microvasculares ocurre en múltiples enfermedades humanas, como accidentes cerebrovasculares, enfermedades cardiovasculares, diabetes, lesión pulmonar aguda, sepsis y lesiones no infecciosas 1,2,3,4,5. Para definir la patogénesis de estas condiciones y comprender los roles de genes específicos en las respuestas de células endoteliales protectoras y desreguladas, existe la necesidad de métodos confiables para aislar y cultivar células endoteliales microvasculares de alta pureza de ratones. Si bien muchos estudios utilizan células endoteliales humanas como las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) o las células endoteliales microvasculares de pulmón humano (HMVEC), existen múltiples razones para usar células endoteliales de ratón para estudiar la función y disfunción endotelial. En primer lugar, existe una heterogeneidad considerable en las respuestas de las células endoteliales de diferentes donantes humanos, lo que conduce a la variabilidad en los resultados entre los experimentos individuales 6,7,8. En segundo lugar, el silenciamiento de las dianas génicas en líneas celulares humanas primarias también puede conducir a niveles variables de expresión de proteínas 9,10. En contraste, existe una heterogeneidad mínima en las respuestas de las células endoteliales de ratón11, asumiendo que el fondo genético es el mismo entre los grupos de estudio. Además, se puede preparar un gran número de células endoteliales de ratón agrupando pulmones de varios ratones neonatos. Estos factores permiten resultados más consistentes y reproducibles entre experimentos. Finalmente, la disponibilidad de ratones knockout o transgénicos también permite el aislamiento de tipos celulares que carecen de proteínas de interés.
Los considerables desafíos con el aislamiento de poblaciones sanas y puras de células endoteliales pulmonares de ratón utilizando métodos publicados 12,13,14,15,16 llevaron al desarrollo de un método más confiable y directo para aislar células endoteliales microvasculares de pulmón de ratón de alta calidad. Las ventajas del protocolo actual incluyen el uso de ratones neonatos, que están fácilmente disponibles, lo que limita los costos de cría de animales y alojamiento. Además, en nuestra experiencia, la viabilidad de las células endoteliales de ratones neonatos es sustancialmente mayor que las células endoteliales preparadas a partir de ratones adultos. Debido a que los ratones neonatos tienen tejido pulmonar pequeño, las células endoteliales se pueden recolectar digiriendo los pulmones extirpados en colagenasa en lugar de usar la instilación traqueal de colagenasa, que se recomienda para la recolección de ratones adultos16. Esto también reduce el tiempo entre la eutanasia de ratones y la obtención de sus células endoteliales en medios de cultivo celular y la incubadora sin afectar la pureza o el rendimiento o la reproducibilidad de las respuestas endoteliales. Por último, las poblaciones de células puras fueron aisladas sin citometría de flujo, lo que puede dañar o conducir a menores rendimientos de las células endoteliales14,15,17.
El protocolo modificado actual conduce consistentemente a células endoteliales viables y de alta pureza en 7-10 días que pueden usarse inmediatamente para experimentos in vitro . Aislar células directamente de animales knockout también minimiza la manipulación de las células antes de la experimentación. Estos métodos podrían usarse para investigar el papel de varias proteínas en la función endotelial para descubrir objetivos terapéuticos basados en endotelios para múltiples enfermedades.

<table><tbody><tr><td>50 mL cónicos</td><td>Corning Life Sciences</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Desprendimiento de Células Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies, Inc</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>BD Aguja PrecisionGlide 25 G x 5/8"</td> <td>Becton Disckinson</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>BioRender.com</td><td>Cánula roma BioRender</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 G x 1-1/2"</td> <td>Covidien</td><td>8881202314</td><td></td></tr><tr><td>CD-102 Rata anti-ratón (3C4 (MIC2/4)</td><td>BD Biosciences</td><td>553326</td><td></td></tr><tr><td>CD-31 Rata anti-ratón (MEC 13.3)</td><td>BD Biosciences</td><td>557355</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa, Tipo 1</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>LS004194</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alta glucosa</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG</td><td>Invitrogen</td><td>11035</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de crecimiento de células endoteliales</td><td>EMD Millipore Corp</td><td>02-102</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de células de halcón (70 y micro; m)</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino fetal, inactivado por calor</td><td>Gibco</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras finas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Vidrio de borosilicato desechable Pasteur Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rata Anti-ratón CD102 (3C4)</td><td>BD Biosciences</td><td>557444</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rata IgG2a,&nbsp; &kappa; Control de isotipo (R35-95)</td><td>BD Biosciences</td><td>553929</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Graefe</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, sin calcio, sin magnesio, sin rojo fenol</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>Heparina Inyecciones de Heparina Sódica (1,000 Unidades/mL)</td><td>Medline</td><td>0409-2720-02</td><td></td></tr><tr><td>Heparina sal sódica de la mucosa intestinal porcina</td><td>Sigma</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Rata PE Anti-ratón CD31 (MEC 13.3)</td><td>BD Biosciences</td><td>553373</td><td></td></tr><tr><td>Rata PE IgG2a,&nbsp; &kappa; &nbsp; Control de isotipo R35-95)</td><td>BD Biosciences</td><td>553930</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina (10,000 U/mL, 10,000 y micro; g/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>recombinante murino IFN-&gamma;</td><td>Peprotech</td><td>315-05</td><td></td></tr><tr><td>Murine recombinante IL-1 y beta;</td><td>Peprotech</td><td>211-11B</td><td></td></tr><tr><td>TNF-y alfa murino recombinante;</td><td>Peprotech</td><td>315-01A</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ensayo de poliestireno de fondo redondo</td><td>Pinzas de</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>Semken de</td> Corning Life Sciences <td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio (100 mM)</td>Sistema de filtración al vacío estéril <td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Stericup Quick Release-GP, 250 mL</td><td>Millipore</td><td>S2GPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP Unidad de filtro superior de tubo de centrífuga estéril</td><td>Milipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa estéril (10 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-459</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa estéril (20 mL)Matraz</td> de cultivo celular <td>Fisher Scientific</td><td>14-955-460</td><td></td></tr><tr><td>T-75 con tapa de ventilación, tratado con CellBIND</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3290</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de células endoteliales pulmonares primarias de ratón

Isolation of Primary Mouse Lung Endothelial Cells

Las células endoteliales desempeñan un papel crítico en la regulación del tono vascular, la inmunidad, la coagulación y la permeabilidad. La disfunción endotelial ocurre en afecciones médicas que incluyen diabetes, aterosclerosis, sepsis y lesión pulmonar aguda. Se necesita un método confiable y reproducible para aislar células endoteliales puras de ratones para investigar el papel de las células endoteliales en la patogénesis de estas y otras afecciones. En este protocolo, se prepararon células endoteliales microvasculares pulmonares a partir de cachorros de ratón neonatales de 5-7 días de edad. Los pulmones se cosechan, se pican y se digieren enzimáticamente con colagenasa I, y las células liberadas se cultivan durante la noche. Las células endoteliales se seleccionan utilizando IgG anti-PECAM1 (CD-31) conjugada con perlas magnéticas, y las células nuevamente se cultivan para confluir. Luego se produce una selección celular secundaria con IgG anti-ICAM2 (CD-102) conjugada a perlas magnéticas para aumentar la pureza de las células endoteliales, y las células nuevamente se cultivan para confluencia. Todo el proceso toma aproximadamente 7-10 días antes de que las células puedan ser utilizadas para la experimentación. Este protocolo simple produce células endoteliales altamente puras (pureza >92%) que pueden usarse inmediatamente para estudios in vitro , incluidos los estudios centrados en la producción de citoquinas y quimiocinas endoteliales, interacciones leucocitos-endoteliales, vías de coagulación endotelial y permeabilidad endotelial. Con muchos knockouts y líneas de ratones transgénicos disponibles, este procedimiento también se presta para comprender la función de genes específicos expresados por las células endoteliales en respuestas sanas y patológicas a lesiones, infecciones e inflamación.

Este protocolo simple permite aislar, cultivar y caracterizar células endoteliales microvasculares de ratón durante 7-10 días (Figura 1). Brevemente, los pulmones se extirpan y se digieren enzimáticamente antes de la chapa. Inmediatamente después del recubrimiento, las células endoteliales y otras células flotarán en medios de cultivo celular. Al día siguiente, las células endoteliales y las células contaminantes se adherirán a la placa, y se necesita una técnica de lavado vigorosa para eliminar los desechos y las células flotantes. Una vez que las células alcanzan la confluencia, se realiza la primera selección de inmunoperlas. Las células CD-31-positivas comienzan a crecer en una formación de adoquines (Figura 2). Las células que no tienen morfología de adoquines o crecen demasiado son contaminantes y no células endoteliales13,14,15,16.
Luego se realiza una segunda selección de inmunoperlas utilizando perlas recubiertas anti-CD-102 para aumentar la pureza de las células endoteliales, similar a otros protocolos13,16. Las células que han crecido hasta la confluencia después de la segunda selección de inmunoperlas se pueden usar para la experimentación. La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) se utiliza para confirmar que la población celular es positiva para CD-31 y CD-102 (Figura 3).
Estas células endoteliales se pueden utilizar para muchas aplicaciones, como el estudio de las vías inflamatorias endoteliales y la función de barrera endotelial. Por ejemplo, se observó que el tratamiento con citomix murino (IFNg, TNFa e IL1b, cada uno a 10 ng/mL) indujo la producción de IL-6 por las células endoteliales (Figura 4A). Luego se utilizó la detección de impedancia de sustrato celular eléctrico (ECIS)18 para medir la resistencia transendotelial (TER) al flujo de corriente eléctrica a través de monocapas de células endoteliales pulmonares murinas. Se observó que las células tratadas con cytomix condujeron a una disminución del TER (Figura 4B), lo que es consistente con una mayor permeabilidad endotelial. Estos ejemplos ilustran cómo las células endoteliales preparadas utilizando este protocolo pueden estudiar diversos procesos endoteliales. Esto permite a los investigadores estudiar más fácilmente los genes de interés en las células endoteliales, dado el número cada vez mayor de ratones knockout y transgénicos disponibles.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63253/63253fig01.jpg"> Figura 1: Esquema para el aislamiento de células endoteliales pulmonares murinas. Los pulmones de los cachorros neonatales de 5-7 días de edad se cosechan y pican. El tejido picado se digiere enzimáticamente con colagenasa I. La suspensión celular se platea y se cultiva durante 2-3 días. Luego, las células se someten a aislamiento primario de inmunoperlas con perlas recubiertas de CD-31 y se cultivan durante otros 3-4 días. Segundo aislamiento de inmunoperlas con perlas recubiertas de CD-102 antes de cultivar otros 2-3 días. Las células ahora están listas para la experimentación funcional. La imagen fue creada por una herramienta de ilustración basada en la web, Biorender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63253/63253fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63253/63253fig02.jpg"> Figura 2: Morfología de las células endoteliales pulmonares murinas. Las células endoteliales pulmonares murinas cultivadas muestran una morfología de adoquines. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63253/63253fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63253/63253fig03v2.jpg"> Figura 3: Análisis de células endoteliales por citometría de flujo. (A) Todos los eventos se visualizan en un diagrama de puntos de la dispersión hacia adelante (FSC) y la dispersión lateral (SSC). (B) Confirmación del diagrama de dispersión de que las células endoteliales pulmonares murinas son positivas para los antígenos de superficie celular endotelial específicos CD-31 y CD-102. (C) Histograma de la muestra isotipo y muestra teñida con el anticuerpo específico CD-31/CD-102. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63253/63253fig03largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63253/63253fig04.jpg"> Figura 4: Cytomix induce la producción de IL-6 de células endoteliales pulmonares murinas y la permeabilidad de las células endoteliales. Las células endoteliales microvasculares de pulmón murino de ratones C57BL / 6 se trataron con citomix (IFNg, TNFa e IL1b, cada uno a 10 ng / ml). (A) Los niveles de IL-6 se cuantificaron en sobrenadantes de cultivo a las 15 h (**p&lt;0,01, n = 4 pocillos/condición). (B) Se utilizó la detección de impedancia de sustrato celular eléctrico para medir la resistencia transendotelial (TER) repetidamente durante 15 h. Los datos se normalizaron a la resistencia inmediatamente antes de la adición de la citomezcla designada y se analizaron mediante análisis bidireccional de varianza (ANOVA) seguido de la prueba posterior de Tukey19 (**p&lt;0,01, n = 4 pocillos/condición). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63253/63253fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

En este artículo, las células endoteliales pulmonares primarias se aislaron y cultivaron de ratones neonatos.

Aislamiento de células endoteliales pulmonares primarias de ratón

Endothelial cells play critical roles in the regulation of vascular tone, immunity, coagulation, and permeability. Endothelial dysfunction occurs in ...

El protocolo demuestra un método confiable y reproducible para aislar y cultivar células endoteliales de alta pureza de ratones que podrían tener múltiples aplicaciones. Esta técnica es un método más sencillo que preserva el rendimiento y la pureza de las células endoteliales. Demostrando el procedimiento estará Nina Nguyen, una investigadora asociada de mi laboratorio.Para comenzar, vórtice las cuentas magnéticas durante unos segundos. Pipetear 50 microlitros de las perlas en dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros para CD31 y CD102. Agregue un mililitro de tampón de lavado de perlas y mezcle bien.Coloque los tubos en un separador magnético y retire el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur. Vuelva a suspender las perlas en 50 microlitros de tampón de lavado de perlas. Luego agregue cinco microlitros o 2.5 microgramos de anticuerpos CD31 o CD102 a cada 50 microlitros de perlas.Incubar la suspensión de perlas con una rotación suave en un rotador de extremo a extremo durante la noche a cuatro grados centígrados o durante tres horas a temperatura ambiente. Lave las inmunoperlas cuatro veces y luego vuelva a suspender las inmunoperlas en 50 microlitros de tampón de lavado de perlas. En el día del aislamiento, agregue 25 mililitros de HBSS a 25 miligramos de colagenasa tipo uno e incube con una rotación suave.Luego filtre usando un filtro de 22 micrómetros. Después de sacrificar a un cachorro de ratón de cinco a siete días de edad, rocíe el cadáver con etanol al 70%. A continuación, corte el diafragma superiormente hacia arriba a lo largo de todas las paredes laterales del tórax para exponer la cavidad torácica.Inyecte cinco mililitros de DMEM frío en el ventrículo derecho del corazón hasta que los pulmones se vuelvan blancos. Luego corte los lóbulos distales a los bronquios correspondientes uno por uno para extirpar los pulmones. Tire de los lóbulos pulmonares en un tubo cónico de 50 mililitros precargado con 20 mililitros de medio basal helado.Agite suavemente el tubo con la mano durante 10 a 15 segundos para lavar cualquier exceso de glóbulos rojos. Retire los pulmones de los medios con un colador de células y pique con tijeras esterilizadas. Transfiera el tejido picado al tubo cónico de 50 mililitros con 25 mililitros de solución de colagenasa precalentada.Agitar suavemente en una batidora giratoria. Conecte una jeringa de 20 mililitros a una cánula roma de calibre 15 y triture la suspensión vigorosamente sin espumar de 10 a 15 veces en una suspensión celular. Filtre la suspensión a través de un filtro de celda de 70 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros.Luego enjuague el tubo cónico utilizado para la digestión y el colador celular con 15 mililitros de medio basal. Centrifugar la suspensión celular a 400 veces G durante ocho minutos a cuatro grados centígrados. Resuspender el pellet en dos mililitros de medio completo.Añadir ocho mililitros de medio completo e incubarlo. Al día siguiente, lavar los frascos dos veces con 10 mililitros de HBSS sin calcio y magnesio y añadir 10 mililitros de medio completo. Una vez que las células son 90 a 95% confluentes, están listas para el aislamiento primario de inmunoperlas.Lave las células endoteliales adherentes dos veces con 10 mililitros de HBSS sin calcio y magnesio. Añadir dos mililitros de solución de desprendimiento celular libre de tripsina e incubarla para asegurar la elevación de todas las células del matraz. Añadir ocho mililitros de medio basal.A continuación, gire las células a 400 veces G durante cuatro minutos a temperatura ambiente y vuelva a suspenderlas en dos mililitros del medio basal. Perlas recubiertas anti-CD31 Vortex durante unos segundos para resuspender las perlas. Agregue 30 microlitros de perlas por cada dos mililitros de suspensión celular y asegure la tapa.Incubar el tubo durante 10 minutos a temperatura ambiente en un rotador de extremo sobre extremo. Luego coloque los tubos en un separador magnético durante dos minutos. Aspire el sobrenadante y retire el tubo del imán.Vuelva a suspender el pellet de células de perla agregando tres mililitros de medio basal al tubo y pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Reemplace el tubo del separador magnético durante dos minutos. A continuación, aspire cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta de vidrio Pasteur.Después del lavado final, cuando el sobrenadante se vuelva claro, resuspender el pellet de células de perla en tres mililitros de medio de crecimiento completo y transferirlo a un matraz T75. Agregue siete mililitros del medio de crecimiento completo e incubarlo. Al día siguiente, vuelva a lavar las células con HBSS sin calcio ni magnesio.Luego agregue 10 mililitros de medio completo. Una vez que las células son 90 a 95% confluentes, están listas para el aislamiento secundario de inmunoperlas. La primera selección de inmunoperlas identifica las células CD31 positivas, que crecen en una formación de adoquines.Una segunda selección de inmunoperlas con perlas recubiertas anti-CD102 aumenta la pureza de las células endoteliales y se utiliza la clasificación celular activada por fluorescencia para confirmar que la población celular es CD31 positiva y CD102 positiva. Para estudiar las vías inflamatorias endoteliales y la función de barrera endotelial, se utilizó el tratamiento con Cytomix murino para inducir una producción significativa de IL-6 por parte de las células endoteliales con un valor de p inferior a 0,01. Además, la resistencia transendotelial disminuyó mostrando una mayor permeabilidad endotelial.Las células endoteliales aisladas se pueden utilizar en estimulaciones de células endoteliales o ensayos de función de barrera para descubrir objetivos terapéuticos basados en el endotelio para los trastornos de disfunción endotelial.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aquí se describe un protocolo para el aislamiento y cultivo de las células endoteliales murinas pulmonar. Este método consiste en la disociación mecánica y enzimática del tejido pulmonar, así como un proceso de purificación de 2 pasos con anti-PECAM-1 y anti-ICAM-2 anticuerpos conjugados a perlas magnéticas, lo que produce una población pura de células endoteliales microvasculares su mayoría de origen.

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Una preparación altamente purificada de células dendríticas del pulmón del ratón se describe. Especial énfasis se da al aislamiento de subgrupo de células dendríticas convencionales.

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Las células endoteliales microvasculares cerebrales (BMEC) están interconectadas por proteínas de unión específicas que forman una barrera altamente regulada que separa la sangre y el sistema nervioso central (SNC), la llamada barrera hematoencefálica (BBB). El aislamiento de las células endoteliales microvasculares primarias del cerebro murino, como se discute en este protocolo, permite estudios detallados in vitro de la BHE.

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Las células endoteliales vasculares desempeñan un papel importante en muchos trastornos cardiovasculares importantes. Este artículo describe un método simple para aislar y expandir las células endoteliales de la aorta del ratón sin usar ningún equipo especial. Nuestro protocolo proporciona un medio eficaz para identificar mecanismos en la fisiopatología de las células endoteliales.

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Este protocolo está preparado para compartir nuestro método de aislamiento de células endoteliales coronarias de ratón con fines de obtención de imágenes o para realizar experimentos de biología molecular.

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Las células endoteliales microvasculares de los músculos esqueléticos (MMEC) forma la pared interna de los capilares musculares y regulan ambos, intercambio de moléculas de líquidos y migración de las células (inmunes) entre sangre y tejido muscular. Aislamiento de MMEC murino primario, como se describe aquí, permite completa investigaciones in vitro de la "unidad myovascular".

Aislamiento de las células endoteliales microvasculares primaria murinas músculo esquelético

Aquí describimos y demostramos un protocolo para el aislamiento primario de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas (LSEC) del ratón. El protocolo se basa en la perfusión de colagenasa hepática, la purificación de células no parentales por centrifugación de baja velocidad y la selección de perlas magnéticas CD146. También fenotipo y caracterizamos estos LSEC aislados mediante citometría de flujo y microscopía electrónica de barrido.

Aislamiento y caracterización de células endoteliales sinusoidales sinusoidales hepáticas primarias de ratón

Aunque es un desafío, el aislamiento de las células endoteliales pulmonares es esencial para los estudios sobre la inflamación pulmonar. El presente protocolo describe un procedimiento para el aislamiento de alto rendimiento y alta pureza de células endoteliales macrovasculares y microvasculares.

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Este protocolo describe el aislamiento de células endoteliales de ratón de páncreas completo.

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Este protocolo detalla el aislamiento de poblaciones vivas inmunes y no inmunes del pulmón de ratón en un estado estacionario y después de la infección por influenza. También proporciona estrategias de activación para identificar subconjuntos de células epiteliales y mieloides.

Aislamiento de poblaciones vivas de células mieloides y epiteliales del pulmón de ratón

Aprende a aislar células endoteliales pulmonares primarias de ratón con alta pureza usando selección con inmunoperlas magnéticas. Este protocolo permite obtener cultivos viables para estudios de biología vascular y funciones endoteliales.

Aislamiento de células endoteliales pulmonares primarias de ratón

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