Name: Purificación de los canales potenciales del receptor transitorio de Drosophila endógeno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprende a purificar canales TRP de Drosophila mediante purificación por afinidad con perlas de níquel de bajo costo. Este protocolo permite obtener canales de longitud completa para estudios electrofisiológicos y análisis estructural.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong, China (No. 2021A1515010796) a W. L. Agradecemos a LetPub (www.letpub.com) por su asistencia lingüística durante la preparación de este manuscrito.

1. Purificación de fragmentos de TRP etiquetados con GST y NORPA con su etiqueta
<ol><li>Purificar el fragmento TRP 1261-1275 etiquetado con GST<ol>
<li>Transformar el plásmido pGEX 4T-1 TRP 1261-127510 en células de Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) utilizando el método de transformación de choque térmico CaCl2 21. Inocular una sola colonia en 10 mL de Luria Bertani (LB) mediana y crecer durante la noche a 37 °C. Luego, amplifique los 10 ml de cultivo de siembra en 1 L de LB medio a 37 ° C.</li>
		<li>Después de que la densidad óptica (OD600) de las células alcance 0.5, enfríe las células a 16 ° C y agregue 0.1 mM de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG; concentración final) para inducir la sobreexpresión de la proteína objetivo e incube a 16 ° C durante 18 h.</li>
		<li>Después de la sobreexpresión, pellet 1 L de células cultivadas por centrifugación a 3.993 × g durante 20 min y resuspend en 40 mL de tampón salino tamponado con fosfato (PBS).</li>
		<li>Cargue las celdas resuspendidas en un homogeneizador de alta presión preenfriado a 4 °C. Aumente lentamente la presión del homogeneizador a 800 bar. Abra el grifo de entrada y deje que las celdas resuspendidas pasen circularmente a través de una válvula con ranuras muy estrechas. NOTA: Las células están homogeneizadas por las altas fuerzas de cizallamiento causadas por una gran caída de presión y cavitación.</li>
		<li>Cargue 5 ml de perlas de glutatión en una columna de flujo por gravedad y lave las perlas con 50 ml de tampón PBS para un total de tres veces.</li>
		<li>Centrifugar el lisado celular del homogeneizador de alta presión a 48.384 x g. Añadir el sobrenadante del lisado centrifugado de células (40 ml) a las perlas de glutatión equilibradas en la columna de flujo de gravedad e incubar durante 30 min a 4 °C. Resuspend las cuentas de glutatión cada 10 min.</li>
		<li>Después de 30 minutos de incubación, abra el grifo de salida de la columna para separar las perlas y la fracción de flujo. Descarte la fracción de flujo continuo. Enjuague las perlas de glutatión restantes dos veces con 50 ml de tampón PBS.</li>
		<li>Agregue 15 ml de tampón de elución a las cuentas de glutatión e incube durante 30 min. Resuspendir las cuentas cada 10 min.</li>
		<li>Después de 30 min de incubación, eluya el fragmento TRP 1261-1275 marcado con GST en un tubo cónico de 50 ml y cargue en una columna de exclusión de tamaño (grado de preparación), que se equilibra utilizando un tampón Tris de 50 mM (pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM TDT).</li>
		<li>Mantenga el caudal de elución de la columna de exclusión de tamaño a 3 ml/min. Recoger las proteínas eluidas a razón de 5 ml/tubo.</li>
		<li>Identificar el pico de la proteína diana en la columna de exclusión de tamaño analizando las señales de absorción UV a 280 nm y verificar mediante análisis de gel SDS-PAGE (parámetros de electroforesis: 150 V para el gel de apilamiento; 200 V para el gel de resolución). Mancha el gel con Coomassie azul R250.</li>
		<li>Concentre el fragmento purificado de TRP 1261-1275 marcado con GST de la columna de exclusión de tamaño a 1 ml utilizando una columna de espín de ultrafiltración de 15 ml centrifugada a 3.000 x g a 4 °C en una centrífuga refrigerada de escritorio.</li>
		<li>Determinar la concentración de proteína concentrada utilizando la Ley de Beer-Lambert. Mida la absorción UV del fragmento TRP 1261-1275 marcado con GST a 280 nm utilizando un espectrofotómetro.</li>
		<li>Obtener el coeficiente de extinción a 280 nm importando las secuencias de proteínas en el programa Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Típicamente, el cultivo de 1 L de TRP 1261-1275 marcado con GST produce 1 mL de 600 μM de proteína (6 x 10-7 mol). Consulte la Tabla 1 para los materiales necesarios.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificación del fragmento NORPA 863-1095 etiquetado con His<ol>
<li>Transformar el plásmido pETM.3C NORPA 863-109520 en células de E. coli BL21 (DE3) utilizando el método de transformación de choque térmico CaCl2 21. Inocular una sola colonia en 10 mL de LB medio y crecer durante la noche a 37 °C. Luego, amplifique el cultivo de siembra de 10 ml en 1 L de LB medio a 37 ° C.</li>
		<li>Después de que el OD600 de las células alcance 0.5, enfríe las células a 16 ° C y agregue 0.1 mM IPTG (concentración final) para inducir la sobreexpresión de la proteína objetivo e incubar a 16 ° C durante 18 h.</li>
		<li>Después de la sobreexpresión, pellet 1 L de células cultivadas por centrifugación a 3.993 x g durante 20 min y resuspend en 40 mL de tampón de unión. A continuación, lise las células resuspendidas en un homogeneizador de alta presión a 4 °C como se describe en el paso 1.1.4.</li>
		<li>Cargue 5 ml de perlas de Ni en una columna de flujo por gravedad y lave tres veces con 50 ml de tampón de unión.</li>
		<li>Centrifugar el lisado celular del homogeneizador de alta presión a 48.384 x g. Añadir el sobrenadante del lisado centrifugado a las perlas de Ni equilibradas en la columna de flujo de gravedad e incubar durante 30 min a 4 °C. Resuspend las cuentas de Ni cada 10 min.</li>
		<li>Después de 30 minutos de incubación, abra el grifo de salida de la columna para separar las perlas y la fracción de flujo. Deseche la fracción de flujo continuo y lave las perlas de Ni restantes dos veces con 50 ml de tampón de lavado.</li>
		<li>Agregue 15 ml de tampón de elución a las perlas de Ni e incube durante 30 min. Resuspend las cuentas de Ni cada 10 min.</li>
		<li>Después de 30 min de incubación, recoja el fragmento NORPA 863-1095 eluido con etiqueta His en un tubo cónico de 50 ml y cárguelo en una columna de exclusión de tamaño (grado de preparación), que se equilibra utilizando 50 mM Tris (pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM TDT).</li>
		<li>Mantenga el caudal de elución de la columna de exclusión de tamaño a 3 ml/min. Recoger la proteína eluida a razón de 5 ml/tubo.</li>
		<li>Identificar el pico de la proteína diana en la columna de exclusión de tamaño analizando las señales de absorción UV a 280 nm y verificar mediante análisis de gel SDS-PAGE (parámetros de electroforesis: 150 V para el gel de apilamiento; 200 V para el gel de resolución). Mancha el gel usando Coomassie blue R250.</li>
		<li>Concentre el fragmento norpa 863-1095 purificado de la columna de exclusión de tamaño a 1 ml utilizando una columna de espín de ultrafiltración de 15 ml centrifugada a 3.000 x g a 4 °C en una centrífuga refrigerada de escritorio.</li>
		<li>Determinar la concentración de proteína concentrada utilizando la Ley de Beer-Lambert. Mida la absorción UV del fragmento NORPA 863-1095 marcado con His a 280 nm utilizando un espectrofotómetro.</li>
		<li>Obtener el coeficiente de extinción a 280 nm importando las secuencias de proteínas en el programa Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Típicamente, 1 L de cultivo de fragmento NORPA 863-1095 marcado con His produce 1 mL de 600 μM de proteína (6 x 10-7 mol). Consulte la Tabla 2 para los materiales necesarios.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparación de cabezas de Drosophila
<ol><li>Recolectar moscas adultas en tubos de centrifugación cónica de 50 ml utilizando el método de anestesia de CO2 22,23; congelar inmediatamente en nitrógeno líquido durante 10 min y almacenar en un congelador de -80°C.</li>
	<li>Después de recolectar un número suficiente de moscas, agite vigorosamente los tubos cónicos congelados de 50 ml a mano para separar las patas, cabezas, alas y cuerpos de las moscas. Transfiera la mezcla a tres tamices de acero inoxidable preenfriados apilados secuencialmente (tamaño de malla 20/30/40, respectivamente) y agite los tamices.</li>
	<li>A continuación, dado que las cabezas no pueden pasar a través del tamiz de 40 mallas, use un cepillo para barrer las cabezas de las moscas del tamiz de 40 mallas, transfiéralas a tubos cónicos de 50 ml y guárdelas a -80 ° C.</li>
	<li>Recoger continuamente las moscas y sus cabezas y almacenarlas en un congelador de -80 °C hasta que alcancen la cantidad requerida necesaria para la experimentación (0,5 g). Por lo general, para recolectar 0,5 g de cabezas, se necesitan 35 ml de moscas en un tubo cónico de 50 ml. Consulte la Tabla 3 para los materiales necesarios.</li>
</ol>3. Purificación del canal TRP de Drosophila
<ol><li>Pesar un total de 0,5 g de cabezales y homogeneizar completamente en nitrógeno líquido utilizando un mortero preenfriado. Disolver los cabezales homogeneizados en tampón de lisis 10x v/w (5 mL), incubar en un agitador a 4 °C durante 20 min, y luego centrifugar a 20.817 x g durante 20 min a 4 °C.</li>
	<li>Recoge el sobrenadante spin-down ("20817 g S", Figura 4) y centrífugalo aún más a 100.000 x g durante 60 min a 4 °C. Utilice el sobrenadante spin-down ("100.000 g S", Figura 4) para el siguiente ensayo desplegable.</li>
	<li>Agregue 1 ml de perlas de Ni en la columna de flujo de gravedad y lave las perlas con 10 ml de H2O (ddH 2 O) de doble destilación a 4° C para un total de tres veces. Equilibre las cuentas con 10 volúmenes de columna de tampón de lisis tres veces a 4 °C.</li>
	<li>Añadir 500 μL de proteína NORPA 863-1095 purificada con 600 μM (3 x 10-7 mol) en la columna de Ni e incubar durante 30 min a 4 °C. Resuspendir las cuentas cada 10 min.</li>
	<li>Abra el grifo de salida de la columna para separar las perlas y la fracción de flujo. Tome la fracción de flujo continuo para el análisis SDS-PAGE (NORPA F, Figura 4). En esta sección, las proteínas de cebo se inmovilizan en las perlas de Ni.</li>
	<li>Lave las perlas de Ni con 10 volúmenes de columna de tampón de lisis (10 ml) a 4 °C y mantenga la fracción de lavado para el análisis SDS-PAGE (Lavado 1, Figura 4A). Repita los pasos anteriores y guarde la muestra para el análisis SDS-PAGE (Lavado 2, Figura 4A). En esta sección, se eliminan las proteínas de cebo excesivas en las perlas de Ni.</li>
	<li>Añadir el sobrenadante del homogeneizado de cabeza de Drosophila después de una centrifugación de 100.000 x g en la columna de Ni a 4 °C, donde se ha inmovilizado el fragmento NORPA 863-1095 marcado con His.</li>
	<li>Incubar el sobrenadante con las perlas de Ni a 4 °C durante 30 min. Resuspendir las cuentas cada 10 min. Luego, abra el grifo de salida de la columna para separar las cuentas y la fracción de flujo.</li>
	<li>Recoger el sobrenadante para el análisis SDS-PAGE (Lisis F de la cabeza de Dro, Figura 4A). En esta sección, los complejos de proteínas INAD (INAD/TRP/ePKC) en los homogeneizados de la cabeza son capturados por los fragmentos inmovilizados de NORPA 863-1095 en las perlas de Ni.</li>
	<li>Lave las perlas de Ni con 10 volúmenes de columna de tampón de lisis (10 ml) a 4 °C y mantenga el sobrenadante de la precipitación por gravedad para el análisis SDS-PAGE (Lavado 3, Figura 4A). Repita los pasos anteriores y recoja el sobrenadante para el análisis SDS-PAGE (Lavado 4, Figura 4A). En esta sección, se eliminan las proteínas no unidas en las perlas de Ni.</li>
	<li>Añadir 500 μL de 600 μM de proteína TRP 1261-1275 marcada con GST (3 x 10-7 mol) en las perlas de Ni e incubar durante 20 min a 4 °C. Resuspendir las cuentas cada 10 min.</li>
	<li>Recoja la fracción eluida de la columna de gravedad (TRP E1, Figura 4B), que contiene el canal endógeno Drosophila TRP. Repita los pasos anteriores y recoja la fracción de elución (PRT E2, Figura 4B). En este paso, al utilizar los fragmentos TRP 1261-1275 etiquetados con GST como competidor, los canales TRP se eluyen de los complejos de proteínas INAD capturados (INAD / TRP / ePKC) en las cuentas de Ni.</li>
	<li>Lavar las perlas de Ni con 10 volúmenes de columna de tampón de unión (10 ml; Tabla 1) a 4 °C y recoger la fracción de lavado para el análisis SDS-PAGE (Lavado 5, Figura 4B).</li>
	<li>Añadir 500 μL de tampón de elución (Tabla 1) en las perlas de Ni e incubar durante 20 min a 4 °C. Recoger la fracción de elución de la columna de flujo de gravedad (NORPA E1, Figura 4B). Repita los pasos anteriores y recoja la fracción de elución (NORPA E2, Figura 4B).</li>
	<li>Usando el tampón de elución, elute el fragmento NORPA 863-1095 marcado con His acompañado de los complejos de proteínas INAD/ePKC. A continuación, resuspend las perlas de Ni en 500 μL de tampón de unión.</li>
	<li>Tome las perlas de Ni resuspendidas para ejecutar el SDS-PAGE (teñido por coomassie azul R250) para analizar la eficiencia de la elución y evaluar si el tampón eluye (perlas, Figura 4B). Consulte la Tabla 4 para los materiales necesarios.</li>
</ol>4. Purificación de la columna de exclusión de tamaño del canal TRP de Drosophila
<ol><li>Instale una columna de exclusión de tamaño (grado analítico) en el sistema de purificación de proteínas. Equilibrar la columna con el tampón de columna (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0.75 mM DDM), que se filtra mediante un filtro de 0.45 μm.</li>
	<li>Concentre la fracción TRP E1 y E2 del paso 3.14 utilizando una columna de espín de ultrafiltración de 4 ml, centrifugada a 3.000 x g a 4 °C en una centrífuga refrigerada.</li>
	<li>Enjuague el bucle de muestra con el búfer de columna y cargue la muestra en el bucle de muestra. Inyecte la muestra en la columna de exclusión de tamaño y eluya las proteínas con un caudal adecuado (0,5 ml/min).</li>
	<li>Identifique el pico de la proteína objetivo por absorción a 280 nm y ejecute un gel SDS-PAGE para detectar el canal endógeno purificado de Drosophila TRP (Figura 5). Consulte la Tabla 5 para los materiales necesarios.</li>
</ol>

<ol><li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).</li>
<li>Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyunsaturated+fatty+acids+activate+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL.</a> Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).</li>
<li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photomechanical+responses+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+binds+to+Drosophila+TRP+with+an+unexpected+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode.</a> Structure. 29 (4), 330-344 (2021).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+intracellular+Ca2%2B+chelation+on+the+light+response+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology.+A%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).</li>
<li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li>
<li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide-mediated+phototransduction+in+Drosophila+photoreceptors%3A+the+role+of+Ca2%2B+and+trp%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp.</a> Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).</li>
<li>Delgado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+opening+of+the+TRP+channel+in+isolated+membrane+patches+excised+from+photosensitive+microvilli+from+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors.</a> Neuroscience. 396, 66-72 (2019).</li>
<li>Lev, S., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activity+of+the+TRP-like+channel+depends+on+its+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">The activity of the TRP-like channel depends on its expression system.</a> Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).</li>
<li>Hardie, R. C., Raghu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+heterologously+expressed+Drosophila+TRPL+channels%3A+Ca2%2B+is+not+required+and+InsP3+is+not+sufficient%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient.</a> Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).</li>
<li>Gutorov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+transient+receptor+potential+C+channel+activity+by+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol.</a> Frontiers in Pharmacology. 10, 1487(2019).</li>
<li>Yagodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thapsigargin+and+receptor-mediated+activation+of+Drosophila+TRPL+channels+stably+expressed+in+a+Drosophila+S2+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line.</a> Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).</li>
<li>Guo, W., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+structural+studies+on+canonical+TRP+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels.</a> Cell Calcium. 83, 102075(2019).</li>
<li>Li, X., Fine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRP+channel%3A+The+structural+era%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">TRP channel: The structural era.</a> Cell Calcium. 87, 102191(2020).</li>
<li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li>
<li>Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+distinct+conformations+reveal+activation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms.</a> Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+INAD+scaffold+is+a+dynamic%2C+redox-regulated+modulator+of+signaling+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye.</a> Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).</li>
<li>Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+exquisitely+specific+PDZ%2Ftarget+recognition+revealed+by+the+structure+of+INAD+PDZ3+in+complex+with+TRP+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel.</a> Structure. 24 (3), 383-391 (2016).</li>
<li>Ye, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpected+INAD+PDZ+tandem-mediated+plc%CE%B2+binding+in+Drosophila+photo+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+heat+shock+step+on+bacterial+transformation+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency.</a> Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+A+laboratory+handbook.+Second+Edition%22">Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition</a>. 80 (2), The Quarterly Review of Biology. (2005).</li>
<li>Nicolas, G., Sillans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+and+latent+effects+of+carbon+dioxide+on+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).</li>
<li>Arachea, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent+selection+for+enhanced+extraction+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins.</a> Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).</li>
<li>Hellmich, U. A., Gaudet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+TRP+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Structural biology of TRP channels.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

INAD, que contiene cinco dominios PDZ, es el organizador central de la maquinaria de fototransducción Drosophila. Estudios previos demostraron que INAD PDZ3 se une a la cola terminal C del canal TRP con una especificidad exquisita (KD = 0,3 μM)18. El tándem INAD PDZ45 interactúa con el fragmento NORPA 863-1095 con una afinidad de unión extremadamente alta (KD = 30 nM). Estos hallazgos proporcionan una base bioquímica sólida para diseñar la estrategia de purificación ...

La fototransducción es un proceso en el que los fotones absorbidos se convierten en códigos eléctricos de las neuronas. Transmite exclusivamente opsinas y la siguiente cascada de señalización acoplada a proteína g tanto en vertebrados como en invertebrados. En Drosophila, mediante el uso de sus cinco dominios PDZ, la inactivación de la proteína de andamio-no-después del potencial D (INAD) organiza un complejo de señalización supramolecular, que consiste en un canal de potencial de receptor transitorio (TRP), potencial de receptor de fosfolipasa Cβ/No A (PLCβ/NORPA) y proteína quinasa C específica del ojo (ePKC)1. La formación de este complejo de señalización supramolecular garantiza la correcta localización subcelular, alta eficiencia y especificidad de la maquinaria de fototransducción Drosophila. En este complejo, los canales TRP sensibles a la luz actúan como efectores aguas abajo de NORPA y median la afluencia de calcio y la despolarización de los fotorreceptores. Estudios previos mostraron que la apertura del canal TRP de Drosophila está mediada por protones, interrupción del entorno lipídico local o fuerza mecánica 2,3,4. El canal TRP de Drosophila también interactúa con la calmodulina5 y es modulado por el calcio por retroalimentación positiva y negativa 6,7,8.
Hasta ahora, los estudios de electrofisiología sobre el mecanismo de cierre de los canales TRP de Drosophila y TRP-like (TRPL) se basaron en parches de membrana extirpados, registros de células enteras de fotorreceptores disociados de Drosophila de tipo silvestre y canales heteroexpresados en células S2, SF9 o HEK 2,9,10,11,12,13, pero no en canales purificados. La información estructural del canal TRP de Drosophila de longitud completa tampoco está clara. Para estudiar las propiedades electrofisiológicas de la proteína purificada en un entorno de membrana reconstituida y obtener información estructural del canal TRP de Drosophila de longitud completa, la obtención de canales TRP de longitud completa purificados es el primer paso necesario, similar a las metodologías utilizadas en los estudios de canales de TRP de mamíferos 14,15,16,17.
Recientemente, sobre la base del mecanismo de ensamblaje del complejo de proteínas INAD 18,19,20, se desarrolló por primera vez una estrategia de purificación de afinidad más competencia para purificar el canal TRP de los homogeneizados de la cabeza de Drosophila mediante perlas de estreptavidina 5. Teniendo en cuenta la baja capacidad y el costoso costo de las perlas de estreptavidina, aquí se introduce un protocolo de purificación mejorado que utiliza proteína de cebo marcada con His y las correspondientes perlas de Ni de bajo costo con una capacidad mucho mayor. El método propuesto ayudará a estudiar el mecanismo de cierre del canal TRP desde ángulos estructurales y a medir las propiedades electrofisiológicas del canal TRP con proteínas purificadas.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Cepas bacterianas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Células competentes</td><td>Novagen</td><td>69450</td><td>Sobreexpresión</td></tr> de <tr><td>proteínasModelos experimentales</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D.melanogaster: W1118 cepa</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>BDSC:3605</td><td>Drosophila < / preparación > cabeza</td></tr><tr><td><fuerte>Material< / fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20/30/40 malla tamices de acero inoxidable</td><td>Jiufeng empresa de malla metálica</td><td>GB / T6003.1</td><td>Drosophila < / preparación > cabeza</td></tr><tr><td>30% Acrilamida-N, N y prime;-Metilenebisacrilamida (29: 1)</td><td>Preparación</td> de gel de plomo <td>A3291</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Persulfato de amonio</td><td>Invitrogen</td><td>HC2005</td><td>SDS-PAGE Preparación de gel</td></tr><tr><td>Cóctel Inhibidor de la proteasa</td><td>Roche</td><td>05892953001</td><td>Inhibidor de la proteasa</td></tr><tr><td>Coomassie azul brillante R-250</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100472-0025</td><td>SDS-PAGE tinción en gel</td></tr><tr><td>DL-Ditiothreitol (DTT)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A620058-0100</td><td>Preparación</td></tr> <tr><td>de tampón de columna de exclusión por tamañoSal disódica de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500838-0500</td><td>Preparación de tampón de columna de exclusión por tamaño</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610235-0005</td><td>SDS-PAGE Preparación de tampón</td></tr><tr><td>Glutatión Sepharose 4 Fast Flow Cytiva</td><td></td><td>17513202</td><td>Cromatografía de afinidad</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500529-0001</td><td>Tampón de elución preparación para la columna de</td></tr><tr><td>Ni Isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600168-0025</td><td>Inducción de la sobreexpresión de proteínas</td></tr><tr><td>LB Caldo en polvo</td><td>Sangon Biotech</td><td>A507002-0250</td><td>E.coli. cultivo celular</td></tr><tr><td>L-Glutatión reducido (GSH)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G4251-100G</td><td>Preparación de tampón de elución para perlas</td></tr> <tr><td>de glutatiónPerlas de Ni-Sepharose excel</td><td>Cytiva 17371202</td><td></td><td>Cromatografía de afinidad</td></tr><tr><td>N-Dodecil beta-D-maltósido (DDM)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610424-001</td><td>Detergente para la purificación de proteínas</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina (TEMED)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>T9281-100ML</td><td>SDS-PAGE preparación de gel</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607008-0500</td><td>Tampón de homogeneización para células PMSF de E.coli.</td></tr><tr><td></td><td>Lablead</td><td>P0754-25G</td><td>Inhibidor de la proteasa Marcador</td></tr> de <tr><td>proteínas preteñido</td><td>Thermo Scientific</td><td>26619/26616</td><td>Escalera de proteínas preteñida</td></tr><tr><td>Columna de exclusión de tamaño (grado de preparación)</td><td>Cytiva</td><td>28989336</td><td>HiLoad 26/60 Superdex 200 Columna de</td></tr><tr><td>exclusión de tamaño (grado analítico)</td><td>Cytiva</td><td>29091596</td><td>Superose 6 Increase Columna 10/300 GL</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501218-0001</td><td>Preparación de tampón de purificación de proteínas</td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500228-0001</td><td>SDS-PAGE Preparación de gel/tampón</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-aldrich</td><td>T1503-10KG Preparación de</td><td>tampón de purificación de proteínas</td></tr><tr><td>Centrifugado de ultrafiltración columna</td><td>Millipore</td><td>UFC901096/801096</td><td>Concentración</td></tr> de <tr><td>proteínasEquipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytical Balance</td><td>DENVER</td><td>APX-60</td><td>Metage of Drosophila head</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada de sobremesa de alta velocidad para tubos de centrifugación cónicos de 15 ml y 50 ml</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Concentración de proteínas</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada de alta velocidad de sobremesa Tubos de centrifugación de 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Centrifugación de lisado de cabeza de Drosophila después de la homogeneización</td></tr><tr><td>Columna de flujo por gravedad vacía (diámetro interior = 1,0 cm)</td><td>Bio-Rad</td><td>738-0015</td><td>Purificación de proteínas TRP</td></tr><tr><td>Columna de flujo por gravedad vacía (diámetro interior = 2,5 cm)</td><td>Bio-Rad</td><td>738-0017</td><td>Purificación de cebos y proteínas de la competencia a partir de E.coli.</td></tr><tr><td>Gel Sistema</td><td>de documentación Bio-Rad</td><td>Universal Hood II Gel Doc XR Imaging</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada de alta velocidad</td><td>Beckman coulter</td><td>Avanti J-26 XP</td><td>Centrifugación de células E.coli./lisado celular</td></tr><tr><td>Homogeneizador de alta presión</td><td>UNION-BIOTECH</td><td>UH-05</td><td>Homogeneización de células E.coli.</td></tr><tr><td>Tanque de nitrógeno líquido</td><td>Taylor-Wharton</td><td>CX-100</td><td>Drosophila head Preparación Sistema de</td></tr><tr><td>purificación de proteínas</td><td>Cytiva</td><td>AKTA purificador Purificador</td> de <td>proteínas</td></tr><tr><td>(-80&deg; C)</td> <td>Thermo</td><td>900GP</td><<td>em>Drosophila head</td></tr><tr><td>Preparación Espectrofotómetro</td><td>MAPADA</td><td>UV-1200</td><td>OD600 medición de células E.coli.</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000c</td><td>Determinación de la concentración de proteínas</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima XPN-100</td><td>Ultracentrifugación</td></tr></tbody></table>

purificación de los canales potenciales del receptor transitorio de drosophila endógeno

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

La fototransducción de Drosophila es una de las vías de señalización acopladas a proteínas G más rápidas conocidas. Para asegurar la especificidad y eficiencia de esta cascada, el canal catiónico permeable al calcio (Ca2+), el potencial del receptor transitorio (TRP), se une estrechamente a la proteína del andamio, inactivación-no-post-potencial D (INAD), y forma un gran complejo proteico de señalización con proteína quinasa C específica del ojo (ePKC) y potencial del receptor de fosfolipasa Cβ/No A (PLCβ/NORPA). Sin embargo, las propiedades bioquímicas del canal TRP de Drosophila siguen sin estar claras. Basado en el mecanismo de ensamblaje del complejo de proteínas INAD, se desarrolló una estrategia modificada de purificación de afinidad más competencia para purificar el canal endógeno TRP. Primero, el fragmento NORPA 863-1095 marcado con histidina purificada (His) se unió a cuentas de Ni y se usó como cebo para derribar el complejo endógeno de proteína INAD de los homogeneizados de la cabeza de Drosophila. Luego, se agregó un fragmento excesivo de glutatión S-transferasa purificada (GST) marcado con TRP 1261-1275 a las cuentas de Ni para competir con el canal TRP. Finalmente, el canal TRP en el sobrenadante se separó del péptido TRP 1261-1275 excesivo mediante cromatografía de exclusión de tamaño. Este método permite estudiar el mecanismo de cierre del canal TRP de Drosophila desde ángulos bioquímicos y estructurales. Las propiedades electrofisiología de los canales TRP de Drosophila purificados también se pueden medir en el futuro.

En este artículo, se demuestra un método de purificación de proteínas para purificar el canal endógeno de Drosophila TRP (Figura 1).
En primer lugar, se aplica la expresión y purificación de proteínas recombinantes para obtener las proteínas de cebo y de la competencia. Luego, un fragmento de TRP 1261-1275 marcado con GST se expresa en células de E. coli BL21 (DE3) en medio LB y se purifica utilizando perlas de glutatión y una columna de exclusió...

Basado en el mecanismo de ensamblaje del complejo de proteínas INAD, en este protocolo, se desarrolló una estrategia modificada de purificación de afinidad más competencia para purificar el canal endógeno Drosophila TRP.

Purificación de los canales potenciales del receptor transitorio de Drosophila endógeno

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

En este protocolo, demostramos el proceso de purificación para obtener canales TRP purificados y de longitud completa, que es el primer paso necesario para estudiar las propiedades electrofisiológicas, y obtener información estructural del canal TRP de Drosophila de longitud completa. Sobre la base del mecanismo de muestreo del complejo de proteínas INAD y utilizando perlas de níquel de bajo costo con una capacidad mucho mayor, se puede purificar una cantidad suficiente de canales TRP de cabezas de mosca. Demostrando el procedimiento estará Yuyang Liu, un técnico de nuestro laboratorio.Para comenzar, transforme el plásmido pGEX 4T-1 TRP 1261-1265 en células E.coli BL21, utilizando el método de transformación de choque térmico de cloruro de calcio. Inocular una sola colonia en 10 mililitros de Luria Bertani medio, y crecer durante la noche a 37 grados centígrados. Agregue los 10 mililitros de cultivo de siembra en un litro de medio Luria Bertani e incube a 37 grados centígrados.Después de que la densidad óptica de las células alcance 0.5, enfríe las células a 16 grados Celsius y agregue 0.1 milimolar isopropil-beta-D-1-tiogalactopyranoside. Después de la sobreexpresión, glet un litro de células cultivadas por centrifugación y resuspend en 40 mililitros de solución salina tamponada con fosfato. Cargue las células resuspendidas en un homogeneizador de alta presión, preenfriado a cuatro grados centígrados.Aumente lentamente la presión del homogeneizador a 800 bar. Abra la pestaña de entrada y deje que las celdas resuspendidas pasen circularmente a través de una válvula con ranuras estrechas. Cargue cinco mililitros de perlas de glutatión en una columna de flujo por gravedad y lave las perlas con 50 mililitros de tampón salino tampón salino tamponado con fosfato, para un total de tres veces.Centrifugar el lisado celular del homogeneizador de alta presión a 48, 384 veces G.Agregue alrededor de 40 mililitros del sobrenadante del lisado de células centrifugadas a las perlas de glutatión equilibradas en la columna de flujo de gravedad, e incube durante 30 minutos a 4 grados Celsius. Resuspend las cuentas de glutatión cada 10 minutos. Después de 30 minutos de incubación, abra la pestaña de salida de la columna para separar las cuentas y la fracción de flujo.Deseche la fracción de flujo continuo y enjuague las perlas de glutatión restantes dos veces, con 50 mililitros de tampón salino tampón tampón de fosfato. Agregue 15 mililitros de tampón de elución a las cuentas de glutatión y vuelva a suspender las perlas cada 10 minutos. Eluya el fragmento TRP 1261-1275 etiquetado con GST en un tubo cónico de 50 ml y cárguelo en una columna de exclusión de tamaño.Recolecte cinco mililitros de las proteínas eluidas por tubo y concentre los fragmentos purificados en un mililitro por centrifugación en una columna de espín de ultrafiltración en una centrífuga refrigerada. Para purificar el fragmento NORPA 863-1095 marcado con His, siga el procedimiento previamente demostrado utilizando perlas de níquel. Recoja las moscas adultas en tubos de centrífuga cónica de 50 mililitros y congélelas en nitrógeno líquido durante 10 minutos.Agite vigorosamente los tubos congelados a mano y transfiera la mezcla a tres tamices de acero inoxidable preenfriados apilados secuencialmente. Agite los tamices y barre las cabezas de las moscas del tamiz de malla 40 con un cepillo. Transfiéralos a tubos cónicos de cinco mililitros y guárdelos a menos 80 grados centígrados.Homogeneizar 0,5 gramos de cabezales en nitrógeno líquido utilizando un mortero y mortero preenfriados. Disuelva las cabezas homogeneizadas en cinco mililitros de tampón de lisis 10X, seguido de centrifugación a 20, 817 veces G a cuatro grados Celsius durante 20 minutos. El sobrenadante de giro hacia abajo se centrifuga aún más 100, 000 veces G a cuatro grados Celsius durante 60 minutos.Agregue un mililitro de perlas de níquel en la columna de flujo de gravedad y lave las cuentas tres veces con 10 mililitros de agua destilada doble a cuatro grados centígrados. Equilibre las cuentas con 10 volúmenes de columna de tampón de lisis, tres veces a cuatro grados centígrados. Agregue 500 microlitros de 600 micromolares purificados con proteína NORPA 863-1095 en la columna de níquel e incube la columna.Vuelva a suspender las cuentas cada 10 minutos. Abra el grifo de salida de la columna para separar las perlas y la fracción de flujo, y lave las perlas de níquel con 10 mililitros de tampón de lisis en frío. Luego, agregue el sobrenadante frío del homogeneizado de cabeza de Drosophila en la columna de níquel.Después de la incubación, lave las perlas con 10 mililitros de tampón de lisis y agregue 500 microlitros de 600 micromolares de proteína TRP 1261-1275 marcada con GST en las perlas. Recoge la fracción eluida de la columna de gravedad. Lave las perlas de níquel con 10 mililitros de tampón de unión.Luego, agregue el búfer de elución y recoja la fracción de elución de la columna de flujo de gravedad. Concentre las fracciones eluidas de la purificación del canal TRP de Drosophila, utilizando una columna de espín de ultrafiltración de cuatro mililitros. Inyecte la muestra en la columna de exclusión de tamaño y eluya las proteínas con un caudal razonable.El fragmento TRP 1261-1275 marcado con GST se expresó en células de E. coli y se purificó utilizando perlas de glutatión y una columna de exclusión de tamaño. Del mismo modo, el fragmento NORPA 863-1095 marcado con His se expresó y purificó utilizando perlas de níquel y columna de exclusión de tamaño. El canal TRP eluido se separa del péptido TRP 1261-1275 marcado con GST excesivo, mediante cromatografía de exclusión de tamaño.Como subproducto, los complejos INAD, ePKC, NORPA 863-1095 se obtienen después de la competencia de péptidos TRP 1261-1275. Lo más importante a recordar al intentar este protocolo, es homogeneizar las cabezas de mosca en nitrógeno líquido y resolver el homogeneizado en tampón que contiene un detergente llamado DDM. Siguiendo este procedimiento, también podemos purificar todo el complejo de proteínas INAD que se puede utilizar para estudiar sus mecanismos de ensamblaje y regulación.Una posible aplicación futura de este método será estudiar la información estructural del canal endógeno Drosophila TRP utilizando técnicas Cryo-EM. Además, también es factible medir las propiedades electrofisiológicas de los canales endógenos purificados de Drosophila TRP en la membrana lipídica bicapa artificial.

purification-endogenous-drosophila-transient-receptor-potential

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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