Expresión bacteriana y purificación de la metaloproteinasa-3 de matriz humana mediante cromatografía de afinidad
30 de marzo de 2022
La purificación, diálisis y activación de His-tag se emplean para aumentar los rendimientos de la expresión de proteínas del dominio catalítico soluble y activo metaloproteinasa-3 en bacterias. Las fracciones de proteínas se analizan a través de geles SDS-PAGE.
Este protocolo detallado describe un método altamente eficiente y rentable de expresión bacteriana para el dominio catalítico recombinante MMP-3 en E.Coli, que se puede aplicar a otras dianas terapéuticas MMP. E.coli carece de un complejo sistema de plegamiento de proteínas y procesamiento post-traduccional. Este método utiliza la cepa celular R2DP para mejorar la expresión de proteínas eucariotas en E. coli.
La sobreproducción de MMP específicos conduce a varias enfermedades como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y neurodegenerativas. Los MMP solubles activos son necesarios para el desarrollo de terapias inhibidoras de MMP. Inocular una sola colonia aislada de pET His-tag pro MMP-3 transformante de dominio catalítico de una placa lb resistente al cloranfenicol de ampicilina en cinco mililitros de medios resistentes al cloranfenicol de ampicilina LB a 37 grados Celsius.
Ahorre alícuotas de cada cultivo y prepare existencias de glicerol al 40%. Inocular un matraz de un litro que contenga 500 mililitros de lb de medio resistente al cloranfenicol de ampicilina LB a una densidad óptica de 0,05 a 0,1 a 600 nanómetros con el cultivo nocturno. Mida la densidad óptica a 600 nanómetros en varios puntos de tiempo, generalmente durante tres o cuatro horas hasta que caiga entre 0.4 y 0.6.
Inducir los cultivos con un stock molar de IPTG a una concentración final de un milimolar. Incubar en el agitador de 37 grados durante tres o cuatro horas adicionales. Centrifugar las células en frascos cónicos de 250 mililitros a 13.000 G y cuatro grados centígrados durante 10 minutos, repitiendo hasta que los cultivos estén completamente peletizados.
Agregue tres mililitros de tampón de lisis por gramo de pellet y resuspenda el pellet mediante vórtice o pipeteo. Añadir 1,25 mililitros de desoxicolato de sodio al 10% en peso por volumen por un litro de cultivo. Añadir 10 microlitros de DNasa I por un litro de cultivo.
Agitar a temperatura ambiente durante 30 minutos a 150 RPM. Centrifugar durante 10 minutos a 13.000 G y cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante.
Resuspend el pellet en 100 mililitros por litro de cultivo de tampón del cuerpo de inclusión mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Mantenga las muestras en hielo durante la sonicación para evitar el sobrecalentamiento. Sonicar cada muestra durante seis ciclos de 15 segundos, una salida de cinco y un pulso del 50%.
Centrifugar las muestras durante 10 minutos a 13.000 G y cuatro grados centígrados. Revisa el pellet. Si el pellet es compacto, deseche el sobrenadante.
Resuspenda cada pellet de un cultivo de un litro y cinco mililitros de tampón de solubilización. Incubar durante al menos 30 minutos en hielo para permitir que las proteínas se solubilicen. Centrifugar las células durante 10 minutos a 13.000 veces G en cuatro grados centígrados.
Si el pellet se forma después de la centrifugación, vierta el sobrenadante en un tubo cónico separado de 50 mililitros. Resuspend el pellet en otros cinco mililitros de tampón de solubilización por un litro de cultivo canalizando hacia arriba y hacia abajo. Centrifugar durante 10 minutos a 13.000 G y cuatro grados centígrados.
A continuación, tira de los sobrenadantes. Deseche el pellet o guárdelo a menos 80 grados celsius para una sonicación adicional. En blanco contra el tampón de lavado HT y registre el A280 de la primera fracción de lavado.
Repita con otras fracciones hasta que A280 se acerque a la línea de base. Eluya inmediatamente las proteínas marcadas con His agregando cinco mililitros de tampón de elución HT. Recoja el flujo a través de fracciones de 0,5 a un mililitro en tubos de microfugios etiquetados como elución HT.
Mida el A280 de la fracción de elución. Si el A280 es mayor de 0,3 miligramos por mililitro, diluya la fracción con tampón de equilibrio HT. Sumerja las fracciones de MMP eluidas en tubos de diálisis en un litro de tampón de diálisis uno y revuelva el tubo y su contenido en un agitador magnético durante al menos ocho horas a cuatro grados centígrados.
Transfiera a un litro de tampón de diálisis dos y revuelva el tubo y su contenido en un agitador magnético durante al menos ocho horas a cuatro grados centígrados. A continuación, transfiera a un litro de tampón de diálisis tres y revuelva el tubo y su contenido en un agitador magnético durante no menos de ocho horas a cuatro grados centígrados. Transfiera la muestra a un contenedor apropiado y etiquétela como MMP marcada.
Examine el tubo en busca de precipitado. Por una alícuota de mililitro de un miligramo por mililitro MMP, agregue 50 microlitros de APMA de 20 milimolares para alcanzar una concentración final de APMA de un milimolar. Si se forma un precipitado, centrímelo a velocidad máxima durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Guarde el sobrenadante en un tubo de microfuge de 1,5 mililitros etiquetado como MMP activado. Deseche el precipitado en un recipiente marcado para los residuos de APMA. SDS-PAGE se ejecutó para comparar las fracciones de elución de purificación his-tag del dominio catalítico His-tag pro MMP-3 de células BL21 DE3 en células R2DP.
Las primeras ocho fracciones de elución del dominio catalítico MMP marcado con His y las células BL21 DE3 mostraron menos proteína que las del dominio catalítico MMP marcado con His en células R2DP. Se muestran las fracciones inducidas, replegadas, concentradas, activadas y desaladas de las células MMP3 CD y R2DP. Tras la activación, el peso molecular de la banda de CD MMP-3 activada es de aproximadamente 20 kilodaltons, a diferencia del zymogen marcado con His, que permanece en alrededor de 30 kilodaltons.
Cuando se lisan las células centrífugas, los gránulos pueden no ser compactos. Cuando eso ocurra, sonicar más y centrifugar por más tiempo. Al reconcentrar la proteína, puede ocurrir precipitación.
Disolverlo en tampón de solubilización y repetir el proceso. El procedimiento descrito aquí proporciona un método detallado para la expresión soluble de MMP humanos activos que eventualmente se puede utilizar para comprender el mecanismo molecular de la actividad enzimática MMP. Se pueden realizar métodos alternativos de purificación de proteínas como FPLC a proteínas MMP purificadas.
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Descripción general
Este protocolo describe un método eficiente para la expresión del dominio catalítico recombinante de MMP-3 en E. coli, utilizando la cepa celular R2DP para aumentar los rendimientos proteicos. El proceso incluye la purificación con etiqueta His, diálisis y activación para obtener una proteína soluble y activa adecuada para aplicaciones terapéuticas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Bioquímica
- Ingeniería de proteínas
- Desarrollo de terapéuticas
Antecedentes
- Se ha implicado a las metaloproteinasas de matriz (MMP) en diversas enfermedades, incluyendo cáncer y trastornos neurodegenerativos.
- Las MMP solubles activas son esenciales para el desarrollo de inhibidores de MMP.
- Comúnmente se utiliza E. coli para la expresión proteica debido a su simplicidad y rentabilidad.
- La cepa R2DP mejora la expresión de proteínas eucariotas en sistemas bacterianos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método rentable para producir el dominio catalítico activo de MMP-3 en E. coli.
- Proporcionar un protocolo que pueda adaptarse a otros objetivos terapéuticos de MMP.
- Facilitar la investigación sobre las MMP y su papel en los mecanismos de enfermedades.
Métodos Utilizados
- Inoculación de E. coli transformada a partir de medios selectivos.
- Purificación con etiqueta His para aislar el dominio catalítico de la MMP-3.
- Dialisis para eliminar impurezas y concentrar la proteína.
- Análisis de fracciones proteicas mediante geles de SDS-PAGE.
Resultados Principales
- Expresión exitosa del dominio catalítico soluble de MMP-3 en E. coli.
- Altos rendimientos de proteína activa adecuada para aplicaciones terapéuticas.
- Métodos efectivos de purificación y análisis demostrados.
- Protocolo aplicable a otras MMP y proteínas similares.
Conclusiones
- El método descrito proporciona un enfoque confiable para producir MMP-3 en un sistema bacteriano.
- Las mejoras en el rendimiento y la solubilidad de la proteína pueden contribuir al desarrollo terapéutico.
- Este protocolo puede servir como base para estudios futuros sobre MMP.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la producción rentable y de alto rendimiento del dominio catalítico activo de la MMP-3 humana en E. coli, abordando un cuello de botella clave en la validación de dianas para terapéuticas relacionadas con MMP. Al mejorar la expresión soluble y los rendimientos de purificación, apoya las pruebas iniciales de hipótesis y la reducción del riesgo mecanicista en programas de descubrimiento de fármacos en oncología, enfermedades neurodegenerativas y cardiovasculares. El método mejora la preparación de la cartera al proporcionar acceso confiable a proteínas bioactivas para la selección de inhibidores y el desarrollo de ensayos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la comprobación de la hipótesis terapéutica de MMP-3 mediante la producción del dominio catalítico activo y soluble para ensayos funcionales.
- Valor operacional: Reduce la dependencia de sistemas mamíferos costosos al mejorar el rendimiento y la solubilidad de la expresión bacteriana mediante la cepa R2DP.
- Valor predictivo: Refuerza la confianza en el blanco al proporcionar una proteína de conformación nativa constante para la validación posterior.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera MMP-3 purificada adecuada para desarrollar ensayos bioquímicos y basados en células para evaluar la potencia y selectividad de inhibidores.
- Valor operativo: Proporciona una producción estandarizada y cuantificable de proteína mediante purificación con etiqueta His y diálisis, lo que permite cribado reproducible de compuestos.
- Escalabilidad: Utiliza pasos sencillos de inducción y lisis compatibles con el escalado de cultivos a múltiples litros para la producción de reactivos de ensayo.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Facilita la progresión desde la validación del objetivo hasta estudios preclínicos al suministrar MMP-3 activa para estudios de mecanismo de acción y biomarcadores.
- Reducción de Riesgos Mecánicos: Permite evaluar los efectos de la inhibición de MMP-3 en las vías de remodelación de la MEC asociadas a fenotipos de enfermedad.
- Confianza Predictiva: Posibilita la correlación estructura-función mediante el uso de proteína purificada para orientar la optimización del fármaco líder.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
El método se integra en la fase temprana del descubrimiento, permitiendo la validación del blanco mediante la producción de proteínas recombinantes, lo que a su vez orienta la identificación de compuestos iniciales y la evaluación preclínica de inhibidores de MMP.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis al proporcionar MMP-3 activa para aclarar su papel en las vías proteolíticas y los mecanismos de enfermedad.
- Tamizaje: Ofrece proteína purificada adecuada para ensayos bioquímicos de alto rendimiento, con el fin de identificar y clasificar candidatos inhibidores.
- Análisis: Permite la evaluación cuantitativa mediante medición de A280 y electroforesis SDS-PAGE para comparar los rendimientos de expresión y la eficiencia de purificación entre cepas.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con trabajos preclínicos al suministrar proteína para estudios de degradación tisular ex vivo e interacciones con citocinas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma escalable y adaptable para la producción de otros dominios catalíticos de MMP, reduciendo el esfuerzo de reoptimización entre distintos blancos.
Impacto Operacional y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la MMP-3 como blanco terapéutico al permitir la producción consistente de proteína activa.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y el rendimiento en comparación con BL21(DE3), reduciendo los fallos por lotes y el costo de reactivos en la producción de proteínas.
- Valor estratégico: Acelera las decisiones de avance o interrupción al proporcionar acceso confiable a la proteína diana para el perfilado temprano de inhibidores.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de programas dirigidos a MMP mediante un mayor rendimiento en la validación de dianas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en biología molecular en clonación, transformación y sistemas de expresión inducibles.
- Depende de equipos de laboratorio estándar, incluyendo agitadores, centrífugas, sonicadores y aparatos de diálisis.
- Necesita la optimización del tiempo y la temperatura de inducción para solubilidad en diferentes dianas de MMP.
- Implica el manejo de agentes desnaturalizantes y solubilizantes que requieren protocolos de seguridad adecuados.
- La eficiencia de activación puede variar y requiere monitoreo mediante tratamiento con APMA y electroforesis en gel de SDS-PAGE para confirmar el corte del zimógeno.
