Evaluación funcional de la quinesina-7 CENP-E en espermatocitos mediante inhibición in vivo , inmunofluorescencia y citometría de flujo

La meiosis es un evento evolutivo conservado en eucariotas, que es esencial para la gametogénesis y la reproducción sexual. Nuestro protocolo proporciona un método eficaz para estudios de división meiótica y espermatogénesis. Hemos descrito una serie de protocolos para el análisis de espermatocitarios.

Esta técnica se puede aplicar para la observación del huso meiótico, cromosomas homólogos y los orgánulos subcelulares en los espermatocitos. Este método se puede utilizar para el análisis de la división meiótica, la generación de modelos animales de edición de genes y la transfección génica en tejidos u órganos. Los experimentadores deben mantener un ambiente estéril durante la cirugía abdominal y prestar atención a la temperatura, el tiempo y las condiciones experimentales clave de este protocolo.

Demostrando el procedimiento estará la señorita Meng-Fei Xu, una posgraduada de mi laboratorio. Comience la construcción del modelo de ratón de inhibición de la proteína E del centrómero mediado por GSK923295 o CENP-E atando las extremidades de ratón anestesiadas y fijándolas en la bandeja de cera. Después de desinfectar el área quirúrgica, use un bisturí estéril para hacer una abertura de cinco milímetros en la cavidad abdominal del ratón seguido de colocar pinzas quirúrgicas estériles sobre la piel.

Luego tire de la almohadilla de grasa del epidídimo con pinzas de disección estériles para localizar los testículos con la ayuda de pinzas estériles. Después de fijar los testículos con pinzas estériles bajo un estereoscopio, inyecte lentamente 10 microlitros de GSK923295 en túbulos seminíferos a una concentración final de 10 micromolares usando 10 microlitros de yodo. Cuando haya terminado, empuje los testículos hacia la cavidad abdominal y suture el sitio quirúrgico como se describe en el texto manuscrito.

Para la deshidratación de gradiente de los testículos de ratón recolectados, incubar secuencialmente la muestra en varios medios como se describe en el manuscrito. Después de la incubación en serie, coloque el pañuelo en la parte inferior de la caja de incrustación y agregue la parafina derretida a la caja. Para la solidificación completa de la parafina, enfriar las muestras a cuatro grados centígrados durante seis horas.

Más tarde, fije la muestra en el soporte del ultra micrótomo mientras mantiene el ángulo entre la muestra y la superficie del cuchillo de 5 a 10 grados. Ajuste el grosor de la rebanada a cinco micrómetros para preparar las secciones de cinco micrómetros de espesor utilizando un ultra micrótomo. Una vez preparado, extienda el portaobjetos de muestra en un baño de agua a 40 grados centígrados antes de secar las secciones en el secador de diapositivas durante 12 horas a 37 grados centígrados.

Después de 12 horas, realice la incubación secuencial de los portaobjetos como se explicó anteriormente. A continuación, enjuague los portaobjetos en agua destilada durante cinco minutos, seguido de tinción con la solución de hematoxilina de Mayer durante seis minutos a temperatura ambiente. Luego enjuague los portaobjetos manchados en agua corriente durante cinco minutos e incube con agua destilada durante dos minutos.

Incubar los portaobjetos en clorhidrato de etanol al 1% durante tres segundos y luego enjuagar y dejar correr el agua durante dos minutos. Teñir la muestra con eosina al 1% durante 15 segundos, seguida de incubación en serie. Cuando haya terminado, selle los portaobjetos con 15 microlitros de goma neutra y un cubreobjetos de 24 por 50 milímetros.

Para la inmunofluorescencia, coloque el portaobjetos en la solución de recuperación de antígeno para hervir a alta presión en una olla a presión durante cuatro minutos para la recuperación del antígeno. Luego enfríe el portaobjetos naturalmente a temperatura ambiente antes de enjuagar dos veces con agua destilada durante cinco minutos y con PBS durante cinco minutos. Para permeabilizar las células, incubar el portaobjetos en 500 microlitros de 0,25% Triton X-100 en PBS durante 10 minutos y luego enjuague los portaobjetos con PBS durante cinco minutos tres veces.

Para el bloqueo de antígenos, incubar la muestra con 300 microlitros de albúmina sérica bovina al 3% o BSA durante una hora y con los anticuerpos primarios en BSA al 3% en PBST durante 16 horas a cuatro grados centígrados. Después de la incubación, coloque el portaobjetos en una caja humidificada para evitar que los tejidos se sequen. Vuelva a calentar los portaobjetos de forma natural a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Deseche el anticuerpo primario, seguido de enjuague el portaobjetos en PBST durante cinco minutos tres veces. Diluir anticuerpos secundarios con BSA al 3% y PBST. Luego incubar la muestra con anticuerpos secundarios diluidos durante una o dos horas a 37 grados centígrados.

Después de enjuagar la muestra en PBST durante cinco minutos cinco veces, tiñe los núcleos con 50 microlitros DAPI durante cinco minutos a temperatura ambiente. Monte el cubreobjetos con el medio de montaje antidecoloración y selle el cubreobjetos con esmalte de uñas. Para la citometría de flujo, recolecte los testículos de ratón en placas de Petri de seis centímetros y corte los testículos en trozos de un milímetro cúbico con tijeras quirúrgicas.

Luego digiera los testículos en un mililitro de colagenasa al 1% en un tubo de centrífuga de 1.5 mililitros durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Para precipitar las células espermatogénicas, centrifugar la muestra a 1.000 G durante cinco minutos y desechar el sobrenadante antes de añadir un mililitro de solución de tripsina EDTA al 0,25% en la muestra durante 20 minutos a 37 grados centígrados. Más tarde, centrifugar la muestra a 1, 000 G durante cinco minutos.

Deseche el sobrenadante para incubar las células precipitadas con un mililitro de etanol frío al 70% durante más de ocho horas a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación a 1, 000 G durante cinco minutos, recolecte sedimentos celulares y tiñe las células espermatogénicas con 500 microlitros de yoduro de propidio o solución de tinción PI a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Después de la incubación, filtre la muestra con una malla de 300 para eliminar los restos celulares y recoja las células en un tubo de flujo para almacenar las células a cuatro grados centígrados.

Detecte señales de fluorescencia y dispersión de luz en la longitud de onda de excitación a 488 nanómetros utilizando un citómetro de flujo. Analice el contenido de ADN en la muestra y la dispersión de la luz utilizando el software ModFit MF LT 32. Después de la inyección testicular de GSK923295, la onda espermatogénica se alteró en los túbulos seminíferos debido a la inhibición de CENP-E.

Sin embargo, la onda espermatogénica en los túbulos seminíferos fue regular y organizada en el grupo control. Se observó que los varios cromosomas homólogos no estaban alineados en la placa ecuatorial después de la inhibición de CENP-E. Además, la inhibición de CENP-E condujo al aumento de los espermatocitos metafásicos I en los túbulos seminíferos.

El análisis de inmunofluorescencia demostró la disminución del número de células positivas para el complejo antisinaptonémico tres o SYCP3 por túbulo seminífero después de la inhibición de CENP-E. Por otro lado, los puntos SYP3 por célula metafase y los estiramientos SYP3 por célula no se vieron afectados en los grupos GSK92395. Las distancias de los polos fusiformes en los espermatocitos metafase I aumentaron debido a la inhibición de CENP-E.

El análisis representativo demuestra que la inhibición de CENP-E resultó en la disminución de las células haploides en el grupo GSK 923295 en comparación con el control. Las proporciones de las células diploides y las células aneuploidías no se vieron significativamente influenciadas después de la inhibición de CENP-E. Por el contrario, las proporciones de las células tetraploides aumentaron en el grupo GSK923295 que en el grupo control.

El análisis de microscopía electrónica de transmisión de las células espermatogénicas mostró la organización interrumpida de las células espermatogénicas en el grupo GSK923295. El experimentador debe prestar atención a la posición de inyección, la dosis del fármaco, el método de inyección y el método de sutura durante la cirugía abdominal y la inyección testicular. Esta técnica, junto con la electroporación in vivo centrada en las proteínas objetivo y las herramientas de edición de genes, se puede utilizar en el campo de la división miótica y la espermatogénesis.