Name: Transección de la médula espinal en renacuajos Xenopus laevis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Aprende el método de transección de la médula espinal en renacuajos Xenopus laevis para estudiar regeneración y recuperación funcional. Esta técnica permite identificar dianas terapéuticas para lesiones medulares en humanos.

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Este trabajo fue financiado por becas de investigación de: PG Slater: FONDECYT N° 3190820; J. Larraín: FONDECYT N° 1180429, CARE Chile UC-Centro de Envejecimiento y Regeneración (PFB 12/2007).

Este protocolo proporciona suficiente información para realizar con éxito la transección de la médula espinal. Cabe destacar que existen excelentes protocolos detallados de estas técnicas publicados en otra parte14, que pueden complementar el aquí presentado. Todos los procedimientos animales han sido aprobados por el Comité de Bioética y Bioseguridad de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Pontificia Universidad Católica de Chile.
1. Apareamiento natural de ranas
<ol><li>De tres a cinco días antes del apareamiento, preinyectan por vía subcutánea ranas macho y hembra con 50 unidades de gonadotropina coriónica humana (hCG). Use la técnica de "garra de hierro" para restringir a las ranas; como las ranas son resbaladizas, use una red para rodear a la rana si es necesario. Inserte la punta de una aguja de 26 G x 1/2" posterior a la línea lateral, empujándola dorsalmente a una profundidad de 1 cm, entre la piel y el músculo.</li>
	<li>Antes del apareamiento, inyecte al macho 300 unidades y a la hembra 700 unidades de hCG.</li>
	<li>Para que se produzca el apareamiento, coloque al macho y a la hembra en 2 L de solución de Barth 0.1x inmediatamente después de enfriar la solución a 4 ° C durante 15 minutos para que se parezca a las condiciones de primavera y deje durante la noche a 18 ° C.</li>
	<li>Dieciséis horas después, recoge cuidadosamente los embriones con la ayuda de una pipeta pasteur de plástico, con la punta cortada, y colócalos en placas de Petri de 10 cm de diámetro. Retire la capa de gelatina embrionaria incubando los embriones con 25 ml de cisteína al 2% en agua destilada (pH 7.8; asegúrese de que la solución cubra los embriones) durante 5 min con una ligera agitación. Lavar 3 veces con agua destilada y 3 veces con 0,1x solución de Barth (8,9 mM NaCl; 102 μM KCl; 238,1 μM NaHCO3; 1 mM 4-(2- hidroxietil)-1-piperazina etanosulfónico ácido (HEPES); 81,14 μM MgSO4; 33,88 μM Ca(NO3)2; 40,81 μM CaCl2, pH 7,6).</li>
	<li>Seleccione embriones sanos que tengan un color marrón y blastómeros que se dividan simétricamente. Coloque los embriones en placas de Petri de 10 cm de diámetro con 50 ml de solución de Barth 0.1x a una densidad de no más de 100 embriones por plato.</li>
</ol>2. Ganadería
<ol><li>Durante la primera semana, mantenga los embriones a 18 °C hasta que salgan del saco vitelino. Durante este tiempo, cambie la solución de Barth todos los días, y retire los embriones muertos blanquecinos y renacuajos que presenten cualquier alteración anatómica visible o renacuajos sin ningún movimiento de natación.</li>
	<li>Después de la primera semana, transfiera los renacuajos al agua libre de cloro en tanques de plástico a una densidad de 10 animales por litro. Cultive renacuajos a 20-21 ° C con un ciclo de luz de 12 h / oscuridad de 12 h, con piedras de oxígeno disponibles en cada tanque para airear el agua y alimentado una vez al día con 0,5 mg por animal. Reemplace el agua una vez a la semana y verifique diariamente si hay desechos acumulados y animales muertos24.</li>
</ol>3. Puesta en escena
<ol><li>De tres a cuatro semanas después de la fertilización, coloque a los animales en una placa de Petri; luego, uno por uno, verifique la morfología y la apariencia de las extremidades anteriores y posteriores. Si es necesario, anestesiar a los animales colocando los animales en una placa de Petri con 50 ml de mesilato de tricaína al 0,02% en solución de Barth 0,1x para una mejor manipulación. Después de no más de 2 minutos, coloque a los animales en una solución de Barth 0.1x para la recuperación de la anestesia.</li>
	<li>Busque las siguientes características anatómicas de los animales en estadio 5025: extremidades anteriores que acaban de aparecer y son esféricas (Figura 1); extremidades posteriores que sobresalen y son esféricas (Figura 1). NOTA: Los animales de las etapas 49 a 51 pueden ser utilizados para este procedimiento (Figura 1); para obtener más información acerca de las etapas, consulte nieuwkoop y la tabla normal de Faber de Xenopus laevis25.</li>
</ol>4. Cirugía: transección de la médula espinal y animales operados simuladamente
<ol><li>Anestesiar los renacuajos de etapa 50 colocándolos en una placa de Petri con 50 ml de mesilato de tricaína al 0,02% en solución de Barth 0,1x durante 2 min.</li>
	<li>Con la ayuda de una cucharada y fórceps, coloque el renacuajo, dorsal hacia arriba, sobre un trozo húmedo de gasa en la mitad superior de una placa de Petri de vidrio.</li>
	<li>Realice una incisión de la piel y los músculos dorsales a nivel torácico medio (Figura 2A, B) utilizando tijeras de resorte de microdisección.<ol>
<li>Para los animales simulados de control, asegúrese de que el tamaño de la incisión sea de solo ~ 0.2 mm (Figura 2C); no dañan la médula espinal (Figura 2D,D').</li>
		<li>Para los animales transectados, realice una segunda incisión de ~0,2 mm (Figura 2C) para transectar completamente la médula espinal (Figura 2E, E').</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Cuidados postquirúrgicos
<ol><li>Después de la cirugía, transfiera los renacuajos a un tanque que contenga 0.5 L de 0.1x solución de Barth con 1x Penicilina-estreptomicina, a una densidad de 10-12 animales por tanque. Mantenga los animales transectados y controle a los animales simulados en tanques separados. NOTA: Los renacuajos se recuperarán de la anestesia en un par de minutos.</li>
	<li>Mantenga los renacuajos con aireación a una temperatura de 20-21 °C.</li>
	<li>Cambie la solución de Barth con antibióticos cada dos días hasta el final del experimento.</li>
	<li>Comience a alimentar a los animales un día después de la cirugía, una vez al día.</li>
	<li>Eliminar animales muertos.</li>
</ol>6. Ensayo de natación
<ol><li>Obtenga una caja con iluminación LED desde el interior, cubierta con una lámina de poliestireno transparente, que permita el paso de la luz.</li>
	<li>Instale una cámara sobre la caja LED.</li>
	<li>Coloque una placa de Petri de 15 cm de diámetro encima de la caja, llena con 100 ml de solución de Barth 0.1x.</li>
	<li>Un día después de la transección, coloque un renacuajo en la placa de Petri y déjelo durante un período de adaptación de 5 minutos.</li>
	<li>Después de la adaptación, comience a rastrear en video el comportamiento de natación libre utilizando el software al que se hace referencia (consulte la Tabla de materiales) durante 5 minutos.</li>
	<li>Después de completar el video, transfiera el renacuajo de regreso a su tanque.</li>
	<li>Repita el seguimiento de vídeo 5, 10, 15 y 20 días después de la transección (Figura 3).</li>
</ol>7. Consideraciones bioéticas
NOTA: La mortalidad de los animales después de la cirugía simulada y la transección es del 13% y 30%, respectivamente. Además, se necesita un mínimo de 15-20 animales por grupo para el análisis estadístico. Por lo tanto, comience con 23 animales simulados y 26 transectados.
<ol><li>Anestesiar a los animales con mesilato de tricaína al 0,02% durante 2 min para asegurar la reducción de la actividad neuronal y motora y el dolor antes de la cirugía.</li>
	<li>Después de la cirugía, revise a los animales para que se recuperen de la anestesia. Además, alimente y revise a los animales diariamente.</li>
	<li>Después de terminar el ensayo de natación, sacrifique a los animales con una sobredosis de mesilato de tricaína (mesilato de tricaína al 1% preparado en solución de bicarbonato de sodio de 30 mM).</li>
</ol>

<ol><li>International perspectives on spinal cord injury. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/I/item/international-perspectives-on-spinal-cord-injury">https://www.who.int/publications/I/item/international-perspectives-on-spinal-cord-injury</a> (2013).</li>
<li>Quiroz, J. F. D., Echeverri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+regeneration%3A+Where+fish%2C+frogs+and+salamanders+lead+the+way%2C+can+we+follow%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Spinal cord regeneration: Where fish, frogs and salamanders lead the way, can we follow.</a> Biochemical Journal. 451 (3), 353-364 (2013).</li>
<li>Lee-Liu, D., Méndez-Olivos, E. E., Muñoz, R., Larraín, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+African+clawed+frog+Xenopus+laevis%3A+A+model+organism+to+study+regeneration+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">The African clawed frog Xenopus laevis: A model organism to study regeneration of the central nervous system.</a> Neuroscience Letters. 652, 82-93 (2017).</li>
<li>Phipps, L. S., Marshall, L., Dorey, K., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+systems+for+regeneration%3A+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Model systems for regeneration: Xenopus.</a> Development. 147 (6), (2020).</li>
<li>Lee-Liu, D., Edwards-Faret, G., Tapia, V. S., Larraín, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+regeneration%3A+Lessons+for+mammals+from+non-mammalian+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Spinal cord regeneration: Lessons for mammals from non-mammalian vertebrates.</a> Genesis. 51 (8), 529-544 (2013).</li>
<li>Beck, C. W., Christen, B., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathways+needed+for+regeneration+of+spinal+cord+and+muscle+in+a+vertebrate%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular pathways needed for regeneration of spinal cord and muscle in a vertebrate.</a> Developmental Cell. 5 (3), 429-439 (2003).</li>
<li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+gene+expression+during+Xenopus+tropicalis+tadpole+tail+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of gene expression during Xenopus tropicalis tadpole tail regeneration.</a> BMC Developmental Biology. 11, 70(2011).</li>
<li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amputation-induced+reactive+oxygen+species+are+required+for+successful+Xenopus+tadpole+tail+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration.</a> Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).</li>
<li>Gargiolo, C., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+tracing+during+Xenopus+tail+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cell lineage tracing during Xenopus tail regeneration.</a> Development. 131 (11), 2669-2679 (2004).</li>
<li>Lin, G., Chen, Y., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+neural+crest+derivatives+in+the+Xenopus+tadpole+tail%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Regeneration of neural crest derivatives in the Xenopus tadpole tail.</a> BMC Developmental Biology. 7, 56(2007).</li>
<li>Filoni, S., Bosco, L., Cioni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+spinal+cord+after+ablation+in+larval+Xenopus+laevistle%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Embryologiae+et+Morphologiae+Experimentalis%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the spinal cord after ablation in larval Xenopus laevistle.</a> Acta Embryologiae et Morphologiae Experimentalis. 5 (2), 109-129 (1984).</li>
<li>Gaete, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+regeneration+in+Xenopus+tadpoles+proceeds+through+activation+of+Sox2-positive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Spinal cord regeneration in Xenopus tadpoles proceeds through activation of Sox2-positive cells.</a> Neural Development. 7, 13(2012).</li>
<li>Muñoz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Xenopus+laevis+spinal+cord+requires+Sox2%2F3+expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells.</a> Developmental Biology. 408 (2), 229-243 (2015).</li>
<li>Edwards-Faret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+regeneration+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Spinal cord regeneration in Xenopus laevis.</a> Nature Protocols. 12 (2), 372-389 (2017).</li>
<li>Méndez-Olivos, E. E., Larraín, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+transplantation+as+a+method+to+investigate+spinal+cord+regeneration+in+regenerative+and+nonregenerative+xenopus+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cell transplantation as a method to investigate spinal cord regeneration in regenerative and nonregenerative xenopus stages.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (12), 943-947 (2018).</li>
<li>Méndez-Olivos, E. E., Muñoz, R., Larraín, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+cord+cells+from+pre-metamorphic+stages+differentiate+into+neurons+and+promote+axon+growth+and+regeneration+after+transplantation+into+the+injured+spinal+cord+of+non-regenerative+Xenopus+laevis+froglets%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spinal cord cells from pre-metamorphic stages differentiate into neurons and promote axon growth and regeneration after transplantation into the injured spinal cord of non-regenerative Xenopus laevis froglets.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 398(2017).</li>
<li>de Vidts, S., Méndez-Olivos, E., Palacios, M., Larraın, J., Mery, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+spinal+cord+damage+based+on+automatic+video+analysis+of+froglet+swimming%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Characterization of spinal cord damage based on automatic video analysis of froglet swimming.</a> Biology Open. 8 (12), 2-11 (2019).</li>
<li>Slater, P. G., Palacios, M., Larraín, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus%2C+a+model+to+study+wound+healing+and+regeneration%3A+Experimental+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Xenopus, a model to study wound healing and regeneration: Experimental approaches.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (8), 100966(2021).</li>
<li>Lee-Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+profile+of+the+response+to+spinal+cord+injury+in+Xenopus+laevis+reveals+extensive+differences+between+regenerative+and+non-regenerative+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression profile of the response to spinal cord injury in Xenopus laevis reveals extensive differences between regenerative and non-regenerative stages.</a> Neural Development. 9, 12(2014).</li>
<li>Lee-Liu, D., Sun, L., Dovichi, N. J., Larraín, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+after+spinal+cord+injury+%28SCI%29+in+a+regenerative+and+a+nonregenerative+stage+in+the+frog+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics after spinal cord injury (SCI) in a regenerative and a nonregenerative stage in the frog Xenopus laevis.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (4), 592-606 (2018).</li>
<li>Peñailillo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+early+response+to+spinal+cord+injury+identi+fi+ed+a+key+role+for+mTORC1+signaling+in+the+activation+of+neural+stem+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Analysis of the early response to spinal cord injury identi fi ed a key role for mTORC1 signaling in the activation of neural stem progenitor cells.</a> NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 68(2021).</li>
<li>Edwards-Faret, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+response+to+spinal+cord+injury+in+regenerative+and+non-regenerative+stages+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Cellular response to spinal cord injury in regenerative and non-regenerative stages in Xenopus laevis.</a> Neural Development. 16 (1), 2(2021).</li>
<li>Tapia, V. S., Herrera-Rojas, M., Larrain, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK-STAT+pathway+activation+in+response+to+spinal+cord+injury+in+regenerative+and+non-regenerative+stages+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">JAK-STAT pathway activation in response to spinal cord injury in regenerative and non-regenerative stages of Xenopus laevis.</a> Regeneration. 4 (1), 21-35 (2017).</li>
<li>Ishibashi, S., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+grow+Xenopus+laevis+tadpole+stages+to+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">How to grow Xenopus laevis tadpole stages to adult.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (3), (2021).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Normal+table+of+Xenopus+laevis+%28Daudin%29.%3A+A+systematical+and+chronological+survey+of+the+development+from+the+fertilized+egg+till+the+end+of+metamorphosis%22">Normal table of Xenopus laevis (Daudin).: A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis</a>. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. (1994).</li>
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<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Xenopus%3A+Methods+and+protocols%22">Xenopus: Methods and protocols</a>. Vleminckx, K. , Humana Press. New York, NY. (2018).</li>
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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

El protocolo descrito en este documento es un excelente método para realizar SCI y evaluar la recuperación funcional. Para la reproducibilidad, es esencial cultivar renacuajos sanos y elegir animales que sean similares en tamaño. La falta de una alimentación adecuada genera estrés nutricional, lo que se traduce en escasas capacidades regenerativas26; por lo tanto, se debe prestar especial atención a la alimentación con renacuajos. A medida que los renacuajos alcanzan la etapa 50 después de 3-4 semanas, pueden criarse a temperaturas más altas para acelerar el proceso de crecimiento, siendo óptimo 18-25 °C27. La calidad del agua es importante, ya que los animales son sensibles a las condiciones del agua y a los productos químicos. Las condiciones óptimas del agua incluyen el uso de agua filtrada con carbón y libre de cloro con los siguientes parámetros: pH (6.5-7.5), cloruro (<0.02 mg / L), conductividad del agua (1.0 mS / cm ± 0.1 unidades), cobre (<0.3 mg / L); dureza del carbonato (KH: 5-10 dKH); dureza general (GH: 6-16 dGH); nitrato (NO3: <20 mg/L); y nitrito (NO2: <0,1 mg/L)14,27,28. Además, para evitar la contaminación, los tanques de plástico deben limpiarse una vez a la semana para criar animales o cada dos días después de la cirugía lavándose bien con agua sin cloruro y una esponja; debe evitarse el detergente.
Para una mejor tasa de supervivencia después de la cirugía, los renacuajos no deben exponerse a la anestesia durante largos períodos (no más de 2 min). Además, se recomienda anestesiar un renacuajo a la vez. Como los animales necesitan mantenerse hidratados, mantenga a los animales inmersos en solución todo el tiempo antes y después de la cirugía, y vierta la solución con una cuchara sobre el renacuajo antes de comenzar la cirugía. Asegúrese de que el daño sea lo suficientemente extenso como para cubrir toda la médula espinal, pero no demasiado extenso, ya que puede inducir una recuperación funcional deficiente o la muerte. Si la notocorda está dañada, el animal se doblará y la recuperación funcional se verá afectada. Si el daño se extiende más allá de la notocorda, la probabilidad de muerte aumenta14. Durante el ensayo de natación, la grabación se considera correcta si el software identifica a cada animal con una sombra azul; de lo contrario, la grabación debe repetirse. Es importante evitar el movimiento y los cambios de aire o luz durante el proceso de grabación para evitar errores de grabación.
Todavía hay muchas preguntas abiertas sobre los mecanismos celulares y moleculares subyacentes al daño y la regeneración de la médula espinal. El protocolo descrito en este trabajo se puede utilizar para estudiar la contribución de diferentes eventos celulares, expresión génica y tratamientos sobre la recuperación funcional, determinados mediante la medición de las capacidades de natación. Además, se pueden aplicar muchas otras técnicas a los animales operados. La médula espinal puede aislarse para realizar extracción de proteínas y/o ARNm14 para estudiar perfiles de expresión proteica y génica tras daño y tratamiento19,20. Esta cirugía también ha sido la base para estudiar la respuesta celular de la médula espinal22 y el comportamiento de las células progenitoras madre neurales12,13,22 después de una lesión medular. Las cascadas de señalización implicadas en la regeneración de la médula espinal también se han estudiado utilizando el paradigma del daño medular descrito en este documento23. En resumen, el protocolo aquí descrito es un excelente modelo para estudiar la lesión y regeneración de la médula espinal y se ha utilizado para muchos estudios que han contribuido al conocimiento existente sobre el tema.

La lesión de la médula espinal (LME) es una aflicción que afecta aproximadamente a 250,000-500,000 personas en todo el mundo cada año1. Además de esta alta prevalencia, la LME afecta a los nervios sensoriales y motores, generando parálisis debajo del sitio de la lesión y desconexión de algunos órganos internos del control del SNC. La médula espinal, una parte del SNC, no puede regenerarse, y debido a la complejidad de la aflicción y la falta de comprensión completa de todos los procesos involucrados, todavía no hay terapias eficientes que permitan la recuperación funcional.
Los organismos no mamíferos, como los peces teleósteos, los anfibios urodele y las etapas larvales de los anfibios anuros, que pueden regenerar la médula espinal después de una SCI2 grave,3,4, son excelentes organismos modelo para estudiar los procesos que gobiernan un evento regenerativo exitoso y comprender el fracaso de la regeneración de los mamíferos. Esta comprensión es de gran interés, ya que podría proporcionar información original para desarrollar nuevas dianas terapéuticas y posibles terapias para la LME.
La rana anuro, Xenopus laevis, es un excelente organismo modelo para estudiar la LME. Tiene excelentes capacidades regenerativas durante las etapas de renacuajo, que se pierden progresivamente durante la metamorfosis, permitiendo la experimentación en las etapas regenerativa y no regenerativa3,5. El método de lesión establecido para el estudio de la LME en renacuajos Xenopus laevis consiste en la amputación de la cola, donde se extirpa toda la cola, incluyendo tejidos como el músculo, la notocorda y la médula espinal6. Este enfoque ha sido fundamental en la comprensión de los mecanismos generales de los procesos regenerativos4,7,8,9,10.
Como la amputación de la cola involucra múltiples tejidos además de la médula espinal, que es diferente de lo que sucede después de la LME humana, se necesita un paradigma de lesión más relevante para el estudio de la LME. Nos hemos basado en estudios utilizados en el pasado11 para generar descripciones exhaustivas de paradigmas de lesión5,12,13,14 y diferentes métodos para el estudio de SCI12,13,14,15,16,17,18 . Después de la transección de la médula espinal, la porción caudal de la médula espinal se puede aislar para la expresión de ARN y proteínas y análisis de alto rendimiento14,19,20,21. Adicionalmente, las inyecciones intracelómicas de fármacos y moléculas pequeñas, así como la electroporación de ADNc, ARN o morfolinos, antes o después de la transección medular, permiten estudiar los efectos de estas moléculas en la prevención o tratamiento de la LME o de eventos específicos ocurridos después de la LME y la regeneración de la médula espinal13,14 . Además, la evolución de la lesión y los procesos regenerativos se pueden estudiar en diferentes momentos después de la lesión utilizando enfoques bioquímicos, moleculares, histológicos y funcionales12,13,14,17,19,20,21,22,23.
Por último, todas las técnicas mencionadas pueden ser utilizadas en etapas no regenerativas, destacando una de las ventajas más importantes de utilizar Xenopus laevis como organismo modelo para estudiar sci, los estudios comparativos de mecanismos regenerativos y no regenerativos en una misma especie13,19,20,21,22. Este artículo presenta un protocolo para la transección de la médula espinal del renacuajo Xenopus laevis, comenzando con la estadificación y selección de los renacuajos regenerativos de Nieuwkoop y Faber (NF) etapa 50. Esto es seguido por la descripción de los procedimientos para la cirugía de la médula espinal para producir animales simulados y transectados, la atención postquirúrgica y, finalmente, el análisis de la recuperación funcional mediante la medición de la distancia de natación del renacuajo libre.

<table><tbody><tr><td>Bomba de aire</td><td>Regent CALM</td><td>RC-006</td><td>Para difusor de oxígeno Función</td></tr><tr><td>de piedras ANY-maze software</td><td>Stoelting</td><td></td><td>Prueba de comportamiento de natación</td></tr><tr><td>Ca(NO3)2&middot; 4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>237124</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Cámara</td><td>Stoelting</td><td>60528</td><td>Test de comportamiento de natación</td></tr><tr><td>Ordenador</td><td></td><td></td><td>Test de comportamiento de natación (especificaciones mínimas recomendadas: PC, Windows 7, Intel Core i3, 2 GB de RAM, 10 GB de disco de unidad 1 puerto USB disponible, monitor de 1.366 y 768 veces)</td></tr><tr><td>Cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico de disección</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td>Cirugía / puesta en escena</td></tr><tr>Placas <td></td><td></td> de<td>Petri de vidrio</td><td>100 x 20 mm</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>11344-041</td><td></td></tr><tr><td>Gonadotropina</td><td></td><td></td> coriónica humana <td>Se puede encontrar en diferentes formatos en la farmacia</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck Millipore</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>Caja de luz LED</td><td>personalizada caja de madera fabricada</td><td></td><td>: 55 cm de largo, 34 cm de ancho, 9 cm de altura, luces LED, lámina de poliestireno transparente)</td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Merck Millipore</td><td>105886</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de microdisección para la transección</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td>Tijeras de resorte para cirugía</td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Anestésico; mesilato de tricaína</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck Millipore</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Rana Nasco Quebradiza para renacuajo Xenopus</td><td>Nasco</td><td>SB09480(LM)MX</td><td>Alimento para renacuajos Xenopus etapa&nbsp; 44 a 60</td></tr><tr><td>Piedras difusoras de oxígeno</td><td>Pentair</td><td>AA1</td><td>Mantenimiento de animales</td></tr><tr><td>Par de pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>Dumont n&deg; 5 SF pinzas</td><td>Para cirugía</td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7794</td><td></td></tr><tr><td>Medidor</td><td></td><td></td><td></td>de pH</tr><tr><td>Pipeta Pasteur de plástico</td><td>Sigma-Aldrich Z331740</td><td></td><td>Para la recolección de embriones después del apareamiento</td></tr><tr><td>Placas de Petri de plástico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5981</td><td>150 x 15 mm</td></tr><tr><td>Tanque/caja de plástico con tapa</td><td></td><td></td><td>4,5 litros de capacidad; 20 cm y veces; 17 cm y veces; 15 cm o similar</td></tr><tr><td>Gasa</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>esterilizadaEstreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1277</td><td></td></tr><tr><td>cucharada</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xenopus laevis cepas y líneas especializadas</td><td>National Xenopus Resource Centro Europeo de Recursos sobre Xenopus Centro</td><td></td> <td>de Recursos para la Investigación de Xenopus laevishttp://www.mbl.edu/xenopus https://xenopusresource.org/ https://www.urmc.rochester.edu/microbiology-immunology/xenopus-laevis.aspx</td></tr><tr><td>Xenopus laevis tipo salvaje</td><td>Xenopus 1 Xenopus Express</td><td></td><td>https://xenopus1.com http://www.xenopus.com</td></tr></tbody></table>

transección de la médula espinal en renacuajos xenopus laevis

Spinal Cord Transection In Xenopus laevis Tadpoles

La lesión de la médula espinal (LME) es una aflicción permanente, que afecta los nervios motores y sensoriales del sistema nervioso central (SNC), lo que resulta en parálisis debajo del sitio de la lesión. Hasta la fecha, no existe una terapia de recuperación funcional para la LME, y hay una falta de claridad con respecto a los muchos complejos y eventos dinámicos que ocurren después de la LME. Muchos organismos no mamíferos pueden regenerarse después de una LME grave, como los peces teleósteos, los anfibios urodele y las etapas larvales de los anfibios anuros, incluidos los renacuajos Xenopus laevis . Estos son organismos modelo de buena fe para estudiar y comprender la respuesta a la LME y los mecanismos subyacentes a los procesos regenerativos exitosos. Este tipo de investigación puede conducir a la identificación de posibles dianas para la intervención terapéutica de LME. Este artículo describe cómo realizar la transección de la médula espinal del renacuajo Xenopus laevis , incluida la cría, la cirugía, la atención posterior a la cirugía y la evaluación de pruebas funcionales. Este método de lesión se puede aplicar para dilucidar los diferentes pasos de la regeneración de la médula espinal mediante el estudio de los mecanismos celulares, moleculares y genéticos, así como la evolución histológica y funcional después de la LME y durante la regeneración de la médula espinal.

El protocolo aquí descrito permite el estudio de la regeneración de la médula espinal en Xenopus laevis. Los efectos de tratamientos farmacológicos específicos y la contribución de la expresión génica específica en la regeneración de la médula espinal se pueden evaluar midiendo sus efectos sobre la recuperación de la natación. La distancia total de natación se traza contra los días posteriores a la lesión para comparar los animales de control y tratados en un punto de tiempo específico o durante un período específico. La recuperación de la función motora a través del tiempo se ejemplifica en la Figura 3, que muestra la distancia de natación a los 5, 10, 15 y 20 días después de la transección. A los 5 días después de la transección, los animales nadaron un promedio de 0,7 m en 5 min, mostrando una capacidad de natación reducida. Esta capacidad aumentó con el paso de los días, ya que se observó un promedio de 2,1 y 3,1 m/5 min después de 10 y 15 días después de la transección, respectivamente, y se observó una recuperación completa de las capacidades de natación a los 20 días después de la transección, con un promedio de 5,7 m/5 min.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63276/63276fig01.jpg"> Figura 1: Puesta en escena del renacuajo Xenopus. Imágenes representativas de las etapas 49-51, mostrando las extremidades delanteras y traseras para referencia de estadificación animal. Barras de escala = 2 mm. Las ampliaciones de la región en caja se muestran en la parte inferior derecha de cada imagen. Barras de escala = 1 mm. En la etapa 49, las extremidades anteriores no se observan, mientras que las extremidades posteriores solo están apareciendo, mostrando una forma esférica. La etapa 50 presenta extremidades anteriores que acaban de aparecer, mostrando una forma esférica y extremidades posteriores que sobresalen con una forma esférica. En la etapa 51, las extremidades anteriores presentan una forma esférica sobresaliente y las extremidades posteriores una forma alargada que sobresale. Los contornos discontinuos muestran las extremidades delanteras y traseras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63276/63276fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63276/63276fig02.jpg"> Figura 2: Transección de la médula espinal. (A) Imagen representativa que muestra el posicionamiento correcto del animal, dorsal hacia arriba, para la realización de la cirugía. Barra de escala = 2 mm. (B) La ampliación de A muestra la ubicación y el alcance de la lesión. La cruz roja muestra la ubicación exacta del sitio de la lesión en el nivel torácico de la médula espinal, y la línea discontinua muestra la extensión de la lesión. Barra de escala = 1 mm. (C) Imagen representativa que muestra una vista lateral del nivel torácico de la médula espinal. Se muestra la extensión de la incisión simulada y la transección. Las líneas discontinuas delinean los límites de la médula espinal. Barra de escala = 1 mm. (D) Imagen representativa que muestra un animal simulado con la médula espinal intacta. Barras de escala = 1 mm. (E) Imagen representativa que muestra un animal transectado con una médula espinal interrumpida. Barras de escala = 1 mm. Las ampliaciones de la región en caja se muestran en la parte inferior derecha de cada imagen (D' y E'). Barras de escala = 1 mm. Abreviaturas: S = incisión simulada; T = transección. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63276/63276fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63276/63276fig03.jpg"> Figura 3: Recuperación de la función de natación a lo largo del tiempo. Diagrama de puntos representativo de la distancia de natación recorrida por los animales transectados en 5 min a los 5, 10, 15 y 20 días después de la transección. En la parte superior se muestran muestras de trayectorias de natación. Los datos presentados como media ± SEM de 10 renacuajos. Abreviaturas: dpT = días posteriores a la transección; SEM = error estándar de la media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63276/63276fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

La transección de la médula espinal del renacuajo Xenopus laevis es un método de lesión relevante para estudiar la lesión y regeneración de la médula espinal mediante la realización de un corte transversal que corta completamente la médula espinal a nivel torácico.

Transección de la médula espinal en renacuajos Xenopus laevis

Spinal cord injury (SCI) is a permanent affliction, which affects the central nervous system (CNS) motor and sensory nerves, resulting in paralysis ...

Este protocolo permite el estudio de la regeneración de la médula espinal en ranas. El conocimiento adquirido podría proporcionar nuevos conocimientos para comprender cómo responden los humanos a la lesión de la médula espinal. La principal ventaja de este protocolo es la facilidad para realizar la lesión, y también que en comparación con el paradigma de la amputación de la cola, esta técnica imita mejor lo que sucede en los humanos.Esta técnica permite desafiar el proceso regenerativo para comprender mejor la participación de diferentes genes, proteínas, moléculas y vías de señalización, identificando así nuevas dianas terapéuticas, La búsqueda del lugar adecuado para generar la lesión, así como su extensión, es difícil. Ser capaz de ver esos pasos es crucial para hacer que este procedimiento sea sencillo y reproducible. De tres a cuatro semanas después de la fertilización, coloque los renacuajos en una placa de Petri y verifique la morfología y la apariencia de las extremidades anteriores y posteriores.Busque las siguientes características anatómicas de los animales en etapa 50, extremidades anteriores que acaban de aparecer y son esféricas, y extremidades posteriores que sobresalen y son esféricas. Antes de la cirugía, anestesiar los renacuajos colocándolos en mesilato de tricaína al 0,02% en solución de Barth 0,1 veces, y comprobar que los animales no responden dándoles la vuelta. Para realizar la cirugía de transección de la médula espinal, use una cucharada y fórceps para colocar un lado dorsal anestesiado de etapa 50 hacia arriba en un trozo húmedo de gasa en la mitad superior de una placa de Petri de vidrio.Luego, usando tijeras de resorte de microdisección, haga una incisión de la piel y los músculos dorsales a nivel de la parte media. Para los animales simulados de control, asegúrese de que el tamaño de la incisión sea de solo 0,2 milímetros y no dañe la médula espinal. En los animales transectados, haga una segunda incisión de 0,2 milímetros para transectar completamente la médula espinal.Después de la cirugía, transfiera los renacuajos a un tanque que contenga 500 mililitros de solución de Barth 0.1 veces con una vez penicilina y estreptomicina a una densidad de 10 a 12 renacuajos por tanque. Mantenga el transectado y controle los renacuajos simulados en tanques separados. Mantenga los renacuajos con aireación a una temperatura de 20 a 21 grados centígrados.Cambie la solución de Barth con antibióticos cada dos días hasta el final del experimento. Comience a alimentar a los renacuajos un día después de la cirugía y elimine a los animales muertos. Para el ensayo de natación, obtenga una caja con iluminación LED desde el interior, cubierta con una lámina de poliestireno transparente que permita el paso de la luz, e instale una cámara sobre la caja LED.Luego, coloque una placa de Petri de 15 centímetros de diámetro en la parte superior de la caja llena de 100 mililitros de solución de Barth 0.1 veces. Un día después de la transección, coloque un renacuajo en la placa de Petri y déjelo durante un período de adaptación de cinco minutos. Después de la adaptación, comience a rastrear en video el comportamiento de natación libre utilizando el software de referencia durante cinco minutos.Después de completar el video, transfiera el renacuajo de regreso a su tanque. Este diagrama de puntos representativo muestra la recuperación de la función motora a través del tiempo. Cinco días después de la transección, los renacuajos nadaron un promedio de 0,7 metros en cinco minutos, mostrando una capacidad de natación reducida.Esta capacidad aumentó con los días de paso, mostrando un promedio de 2,1 metros en cinco minutos después de 10 días, y 3,1 metros en cinco minutos después de 15 días después de la transección. Se observó una recuperación completa de las capacidades de natación a los 20 días después de la transección, con un promedio de 5,7 metros en cinco minutos. El promedio de natación puede variar dependiendo de cada lote de animales.Por lo tanto, el grupo experimental siempre debe compararse con los controles respectivos y no obtener datos obtenidos previamente. Después de la cirugía, los animales se pueden utilizar para el análisis global, incluyendo transcriptómica, proteómica y metabolómica, y para detectar compuestos que inhiben o promueven la regeneración de la médula espinal, con el objetivo de desarrollar nuevos enfoques terapéuticos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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