Método de electroporación eficiente y rentable para estudiar las vías de señalización primarias dependientes del cilio en el precursor de células granulares

Este protocolo demuestra un método sencillo de modificación genética in vitro para el estudio molecular de la vía de señalización primaria dependiente del cilio en los cultivos precursores de células gránulos primarias. Debido al costo, la baja viabilidad y la baja eficiencia del método de transfección actual, introducimos una técnica de electroporación simple, rentable y eficiente para investigar la vía de señalización dependiente del cilio en cultivos primarios de GCP. Para comenzar, agregue 0.5 mililitros de medio de cultivo en cada pozo de la placa de cultivo de 24 pocillos que contiene recubiertos de hojas de cubierta, y manténgala caliente a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono.

Pipetear el número requerido de células en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitros y girar a 200x G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y resuspenda el pellet celular en 200 microlitros de Opti-MEM. Repita este procedimiento dos veces para asegurarse de que no haya medio de cultivo residual presente en el tubo.

Establezca los parámetros de electroporación como se enumeran. Pipetee la reacción de electroporación suavemente para mezclar bien, y use una punta de pipeta P200 larga para transferir un volumen exacto de 100 microlitros de la mezcla a la cubeta de espacio de dos milímetros. Una vez que la cubeta esté dentro de la cámara de la cubeta, presione el botón omega del electroporador y anote el valor de impedancia adhiriéndose a un volumen preciso de 100 microlitros.

El rango de valor de impedancia debe ser de aproximadamente 30 y 35. Pulse el botón de inicio para iniciar el pulso. Registre los valores de corriente medidos en julios que se muestran en el marco de lectura.

Retire la cubeta de la cámara. Agregue inmediatamente 100 microlitros de medio de cultivo precalentado en la cubeta y vuelva a suspenderlo pipeteando hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces. Transfiera inmediatamente la suspensión celular a la placa de 24 pocillos previamente preparada.

Incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono. Observe las células bajo el microscopio de fluorescencia al día siguiente. En el presente estudio, la eficiencia de electroporación de los grupos tratados con DMSO y SAG parecía comparable.

La inmunotinción del marcador de cilio primario Arl13b demuestra que la tasa de ciliación de GCP en div-2 de cultivo tanto en el vehículo como en los grupos tratados con SAG. La tasa de ciliación ilustra el porcentaje de Pax6 que expresaN GCP con un cilio primario en la superficie de la celda en div-2 después de la electroporación. La figura muestra un aumento significativo en la localización de EGFP suavizada en el axonema primario de cilio de las células GCP de expresión pax6 a las 24 horas posteriores al tratamiento sag, lo que indica una activación profunda de la vía de señalización primaria del erizo dependiente del cilio.

Para lograr una mayor eficiencia de electroporación, se debe garantizar una alta pureza del plásmido utilizado, y no hay medios de cultivo de residuos presentes en la mezcla de electroporación de plásmidos. Este protocolo debe ser directamente aplicable y beneficioso para los experimentos de modificación genética in vitro en cultivos primarios y tipos de células que son difíciles de transfectar, incluidas las neuronas y las células madre pluripotentes inducidas por humanos.