Name: Aislamiento rápido de nematodos silvestres por Baermann Funnel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Aprende a aislar nematodos silvestres mediante el método de embudo de Baermann para estudios de ecología y genética poblacional. Esta técnica permite extraer Caenorhabditis de sustratos naturales y establecer cultivos limpios.

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones R35GM141906 y R21ES031364 de los NIH y la beca Damon Runyon DRG-2371-19.

1. Preparación de placas NGM sembradas en el campo
<ol><li>Antes de viajar, pesar 23.005 g de nematodo growth medium (NGM) (ver Tabla de materiales) en polvo y pre-empacar en una bolsa de plástico sellable. Haga una bolsa por cada litro de medio deseado. NOTA: El embalaje previo antes del viaje evita la necesidad de un equilibrio funcional en el campo.</li>
	<li>Antes de viajar, prepare 1 ml de 1M MgSO4, 1 ml de 1 M de CaCl2 y 25 ml de tampón de fosfato de potasio 1M por cada litro de medio deseado. Para hacer 1 L de tampón de fosfato de potasio, disuelva 108.3 g de KH2PO4 y 35.6 g de K2HPO4 en agua, como se describe en WormBook20.</li>
	<li>Antes de viajar, haga un cultivo nocturno de OP50 (ver Tabla de Materiales) cultivado en LB a 37 °C, como se describe en WormBook20. Alícuota el cultivo en tubos cónicos de 50 ml y envuelva las tapas con película de parafina para evitar fugas.</li>
	<li>En el campo, disuelva el contenido del paquete NGM en 973 ml de agua de doble destilación (ddH20) o el agua más pura y estéril disponible en un matraz o botella de 1 L.</li>
	<li>Coloque el matraz o botella de medios, con una tapa suelta o una cubierta de papel de aluminio, en un baño de agua caliente hirviendo en una placa o estufa caliente. Revuelva ocasionalmente hasta que todo el polvo se disuelva y esté claro (esto toma ~ 30 min). NOTA: Si hay una placa magnética disponible, una barra de agitación es una excelente opción para limitar la cantidad de agitación manual.</li>
	<li>Retire el medio del baño de agua y enfríelo a ~ 58 ° C con agitación ocasional o con una barra de agitación. Una vez que el medio se enfríe a 58 ° C, use pipetas serológicas o estándar para agregar 25 ml de tampón de fosfato de potasio 1M, 1 ml de MgSO4 de 1 M y 1 ml de CaCl2 de 1 M, mezclando bien entre cada paso.</li>
	<li>En el ambiente más estéril disponible, pipetee o vierta el medio en placas del tamaño deseado y deje enfriar y solidificar durante la noche. Vierta una placa de 60 mm (~10 ml) para cada muestra de sustrato. Vierta una placa de 35 mm (~3.5 mL) para cada línea isofemale; el número de placas pequeñas necesarias es difícil de predecir de antemano.</li>
	<li>Pipetear 50 μL de cultivo OP50 en cada placa y dejar que se seque y crezca durante la noche antes de su uso.</li>
</ol>2. Colección de los sustratos de nematodos
<ol><li>Identifique un sustrato rico en bacterias en el campo. Algunos ejemplos incluyen frutas podridas, flores, hongos y tallos de plantas herbáceas. El suelo y la hojarasca también son adecuados, aunque rara vez contienen Caenorhabditis.</li>
	<li>Con una mano enguantada, coloque una muestra de este sustrato (1-15 cm3) en una bolsa de plástico sellable (consulte la Tabla de materiales) etiquetada con una identificación de muestra única (Figura 1A).</li>
	<li>Registre la identificación de la muestra, la latitud, la longitud, la fecha, la descripción del sustrato y cualquier otra medición ambiental local relevante para el experimento, incluida la temperatura ambiente y del sustrato, el momento de la recolección, la condición del sustrato, la presencia de macroinvertebrados asociados al sustrato, etc. Hay disponible una aplicación para teléfonos inteligentes para agilizar este proceso21.</li>
</ol>3. Preparación de una matriz de embudos de Baermann
<ol><li>Para cada embudo, use tijeras para cortar un segmento de tubo de goma (consulte la Tabla de materiales) de ~ 3 cm de largo.</li>
	<li>Ajuste el segmento de tubería sobre el extremo de un embudo de plástico (consulte la Tabla de materiales). Esto puede requerir un poco de esfuerzo ya que el ajuste es muy ajustado.</li>
	<li>Deslice una abrazadera de tubo sobre el tubo de goma y colóquelo.</li>
	<li>Para hacer un soporte de embudo, use un bisturí para cortar agujeros circulares de 35 mm de diámetro en la parte inferior de una bandeja de cartón para frascos de mosca (consulte la Tabla de materiales) que no se haya doblado desde su orientación de envío plano. Una bandeja estándar puede acomodar 12 de estos orificios en una matriz de 3 x 4.</li>
	<li>Invierta el cartón, doble los lados una vez (no dos veces, como lo haría uno para hacer una bandeja de vial de mosca) y pegue los lados juntos para elevar la bandeja de cartón invertido (Figura 2).</li>
	<li>Coloque embudos en los orificios, primero asegurándose de que las abrazaderas de los tubos estén en la posición cerrada.</li>
</ol><img alt="Configuración de secado por goteo de cartón para vasos de plástico invertidos en un laboratorio; proceso de secado, uso de equipos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Bandejas de viales de mosca de cartón reutilizadas, dobladas y cortadas para soportar 12 embudos baermann cada una. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
4. Transferencia de muestras a los embudos
<ol><li>Vierta agua (tan estéril como esté disponible) en cada embudo, llenándolo unos 3 cm por debajo del borde. Si las burbujas de aire están atrapadas en el tubo, toque el embudo para liberarlas.</li>
	<li>Con las manos enguantadas, coloque una toallita sin pelusa o específicamente un Kimwipe (doblado por la mitad para hacer un cuadrado) sobre el embudo, y presione hacia abajo en el centro para que se sumerja en el agua.</li>
	<li>Rompa manualmente grandes trozos sólidos de sustratos naturales (fruta, flor, suelo, hojarasca, etc.) en fragmentos más pequeños para minimizar la distancia que los gusanos deben viajar para caerse del sustrato. NOTA: La hojarasca y las muestras de formas incómodas se pueden preprocesar en un procesador de alimentos o licuadora.</li>
	<li>Coloque suavemente una muestra del sustrato natural (1-15 cm3) sobre la toallita sin tejido / pelusa en un embudo sin perforar el tejido y sin que la muestra sobresalga por encima del borde.</li>
	<li>Etiquete el embudo, o el cartón junto al embudo, con el ID de muestra correspondiente a las notas de recolección de campo.</li>
	<li>Doble las esquinas de la toallita sin pañuelos sobre la muestra (Figura 1B). Tenga cuidado de mantener la muestra contenida dentro de la toallita sin pañuelos / pelusas para que no pueda pasar tierra o escombros al fondo del embudo. NOTA: Este paso es para evitar que las esquinas cubran el borde del embudo, donde absorberían el agua del embudo sobre los lados.</li>
	<li>Con las manos, una espátula o la punta de una pipeta, seleccione cualquier insecto activo, milpiés u otros animales que puedan viajar de embudo a embudo, contaminando muestras cruzadas. Envuelva el pañuelo / toallita sin pelusa completamente alrededor de la muestra o coloque un segundo tejido en la parte superior de la muestra para evitar la contaminación cruzada.</li>
	<li>Agregue más agua a los embudos para que toda la muestra quede sumergida (Figura 3).</li>
</ol><img alt="Experimento de muestra de té con técnicas de infusión, análisis del tiempo de remojo y configuración de degustación." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Embudos de Baermann ensamblados. Cada muestra se envuelve en una toallita sin pañuelos de papel / pelusa y se sumerge bajo el agua en el embudo, que se cierra con sujeción. Durante un período de ~ 12 h, los nematodos migrarán a través del tejido y al fondo del embudo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
5. Extracción de nematodos de los embudos
<ol><li>Espere ~ 12 h o durante la noche. Durante este tiempo, los gusanos activos se retorcerán fuera del sustrato, a través de la limpieza sin tejido / pelusa y hasta la parte inferior del embudo sujeto. NOTA: Esperar mucho más de 12 h corre el riesgo de mortalidad por gusanos debido a hipoxia o infección patógena, lo que también puede ser un riesgo a duraciones más cortas para muestras que están particularmente llenas de gusanos y bacterias.</li>
	<li>Escriba la identificación de la muestra de un embudo en la parte inferior de una placa de gusano NGM de 60 mm sembrada con una mancha de bacteria OP50 E. coli . Retire la tapa del plato.</li>
	<li>Retire el embudo que contiene esa muestra del soporte del embudo. Usando una mano para sostener el embudo en posición vertical sobre la placa de gusano abierta, use la otra mano para liberar presión sobre la abrazadera del tubo, permitiendo que una gota de agua caiga desde el tubo sobre la placa de gusano (Figura 1C). Tan pronto como el agua caiga del embudo, vuelva a cerrarlo rápidamente para evitar que se inunde la placa NGM. NOTA: Para seleccionar gusanos atraídos por OP50, incluidas las especies de Caenorhabditis , libere la gota lejos del césped bacteriano. Cuando el agua se empapa en el plato o se evapora, los nematodos caenorhabditis se arrastrarán hacia el césped bacteriano.</li>
	<li>Limpiar: Tirar el contenido de los embudos. Lavar los embudos con agua caliente para su posterior reutilización.</li>
</ol>6. Establecimiento de las culturas
<ol><li>Observe los nematodos aislados bajo el estereomicroscopio a un aumento de 5x-50x. Las placas deben incluir nematodos, y a frecuencias mucho más bajas, pequeños anélidos oligoquetos, tardígrados, rotíferos y pequeños crustáceos (Figura 4). NOTA: Si el embudo se ha configurado correctamente, ningún ácaro, insecto o material no vivo visible habrá pasado por el embudo.</li>
</ol><img alt="Imagen de microscopio de nematodos que muestra la densidad de población; Útil para el análisis de estudios biológicos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Contenido de la primera gota liberada de un embudo de Baermann en una placa NGM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<ol start="2"><li>Para establecer líneas isohermafroditas o isofemales, use un pico de gusano para transferir cada hembra adulta hermafrodita L4 o apareada (reconocible por su mayor tamaño corporal y la falta de la cola masculina distinta22) a una placa NGM separada de 35 mm sembrada con OP50 (Figura 1D). Use un encendedor para esterilizar el pico de gusanos antes y después de transferir gusanos.</li>
	<li>Use una película de parafina para envolver las placas a fondo para viajar.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

El principio central de este método es que los nematodos pasarán a través del tejido sumergido en agua, mientras que su sustrato y los contaminantes de invertebrados más grandes no lo harán. Los pasos críticos del protocolo son (1) recolectar un sustrato apropiado, (2) sumergir el sustrato, envuelto en un material filtrante, en agua, (3) recolectar gusanos que han pasado a través del filtro y se han hundido hasta el fondo del agua, y (4) aislar gusanos individuales para crear líneas isofemale o isohermafroditas. Todas las demás partes del método son susceptibles de modificación según sea necesario de acuerdo con los recursos disponibles, la naturaleza de los sustratos o los objetivos del trabajo de campo. Algunas modificaciones que vale la pena considerar son las siguientes.
Cebar a los gusanos plantando fruta Si no hay un amplio suministro de material de podredumbre rico en bacterias que se encuentre en el sitio de campo, es posible que desee traer una muestra, como un trozo de manzana o tomate, para dejar que se pudra. Fije bien el cebo con unas pocas estacas para que los animales más grandes no los retiren y para que se pueda encontrar fácilmente más tarde para su recolección. Evite la luz solar directa, donde el cebo podría secarse antes de que se pudra.
Construcción de aparatos de embudo a partir de cualquier material disponible Cualquier estructura con orificios lo suficientemente grandes como para acomodar la abrazadera del tubo y lo suficientemente estable como para soportar un embudo pesado superior funcionará. Para un solo embudo, un vaso para beber es un soporte adecuado. Se puede usar cualquier tipo de pañuelo de papel (pañuelo facial, papel higiénico o toallas de papel).
Poner menos material en los embudos, o ajustar el tiempo de espera, para prevenir la hipoxia o la infección Si la muestra tiene una concentración muy alta de gusanos o bacterias, los nematodos pueden comenzar a morir de hipoxia o infección antes de que se complete la incubación de 12 h. Si esto es una preocupación, el investigador puede verificar los embudos antes o preparar un embudo adicional con una submuestra muy pequeña del sustrato altamente poblado.
Ajuste de la preparación de la placa NGM a las necesidades y restricciones experimentales Las placas NGM se pueden preparar con cualquier medio y fuente de alimento que sea apropiado para el experimento. El protocolo de campo descrito anteriormente está diseñado para minimizar el peso del equipaje. Dependiendo de las limitaciones de equipaje y el tiempo de trabajo de campo, puede ser preferible traer placas NGM ya vertidas, ya sea preparadas en el laboratorio o compradas comercialmente, en lugar de verter placas en el campo.
Realización de los aislamientos de embudo en el laboratorio El protocolo describe la realización del procedimiento completo en condiciones de campo para capturar la población de nematodos tal como ocurre en la naturaleza. Para algunos objetivos de investigación, puede ser suficiente aislar los nematodos más tarde, después de viajar de regreso al laboratorio con muestras en bolsas selladas. Incluso entonces, el método del embudo de Baermann proporciona una muestra más limpia y completa de los nematodos supervivientes que otros métodos de aislamiento. Sin embargo, las muestras en bolsas selladas pueden experimentar selección durante el viaje, ya que están expuestas a posibles extremos de temperatura e hipoxia. Esto se puede minimizar realizando aislamientos tan pronto como sea posible después de la recolección de muestras.
Un método alternativo común al embudo de Baermann consiste en colocar el sustrato directamente sobre una placa NGM y esperar a que los gusanos se arrastren, lo que es altamente laborioso o resulta en la recolección incompleta de la población. También produce placas contaminadas con ácaros y larvas de insectos. El método de embudo de Baermann es una estrategia de bajo costo, baja tecnología y baja mano de obra para separar rápidamente a toda la población de gusanos activos de su sustrato.
El método del embudo de Baermann no es universalmente aplicable para la recolección de todos los tipos de nematodos silvestres. Algunos nematodos que habitan en las plantas tardan mucho más de 12 h en emerger de su sustrato y estarán ausentes de una gota liberada demasiado pronto, mientras que algunos parásitos de insectos se arrastrarán hasta la parte superior del embudo en lugar de la parte inferior, evadiendo también la recolección14. Las alternativas al embudo de Baermann requieren equipos más especializados o más mano de obra para recuperar los gusanos. Sin embargo, aún pueden ser preferidos si las advertencias anteriores son un problema para el experimento. Las opciones alternativas, revisadas por van Bezooijen14, incluyen el método de pulverización de embudo, que proporciona una niebla constante de agua a los embudos, agregando oxígeno y permitiendo el desbordamiento de bacterias en suspensión. Esto permite un período de extracción más prolongado de nematodos de las plantas. El método de flotación centrífuga de la licuadora recupera nematodos de movimiento lento, inactivos o que se arrastran hacia arriba separándolos por su gravedad específica, elutriador Oostenbrink aplica una corriente subterránea para separar el sedimento de sedimentación de los nematodos suspendidos, y el método de Cobb utiliza una serie de tamices para aislar a los nematodos por su tamaño, forma y velocidad de sedimentación14. Sin embargo, para recolectar rabdítidos, el embudo de Baermann produce muestras limpias de manera efectiva rápidamente y con un esfuerzo mínimo.

Están surgiendo valiosos conocimientos biológicos a medida que los investigadores que estudian C. elegans en el laboratorio amplían su enfoque a C. elegans y nematodos rabdítidos relacionados en la naturaleza. Los estudios de nematodos silvestres sitúan los genes y genomas en su contexto natural, revelando funciones potencialmente oscurecidas por las condiciones de laboratorio1,2,3,4,5. Estos estudios generan información sobre el requisito previo para la evolución misma, la variación genética6,7,8,9,10. La variación genética natural capturada por muestras silvestres también proporciona incursiones en la base genética de muchos rasgos complejos11,12,13.
Al diseñar estudios que requieren el aislamiento de poblaciones naturales de nematodos, particularmente cuando se realiza trabajo de campo remoto, las consideraciones prácticas pasan a primer plano. Este protocolo tiene como objetivo aislar limpiamente poblaciones enteras de nematodos activos que se pueden cultivar en OP50 a partir de cebos o sustratos silvestres. El método es muy adecuado para extraer nematodos rabdíidos y diplogasteridos de vida libre, incluidos Caenorhabditis, Oscheius y Pristionchus.
Existen muchas técnicas para aislar nematodos de sus sustratos14,15. El enfoque más básico es colocar el sustrato directamente sobre una placa de nematodo medio, recogiendo animales a medida que se arrastran8,15. Este método requiere grandes cantidades de tiempo y trabajo si el objetivo es aislar todos los nematodos de una muestra. Las técnicas más sofisticadas aprovechan el peso, el tamaño, la movilidad o alguna combinación de estos de los animales14. Cada método tiene sus ventajas y desventajas en términos de configuración y rendimiento. También difieren en sus sesgos de muestreo y pueden seleccionar ciertos nematodos si los animales de la muestra varían a lo largo del eje del principio de separación del método.
El método del embudo de Baermann fue descrito por primera vez en 1917 por el médico holandés G. K. T. F. Baermann, quien inventó el dispositivo en Java mientras estudiaba los nematodos que habitan en el suelo, incluido el anquilostoma parásito16. El embudo de Baermann funciona basado en el principio de movilidad. El sustrato se coloca en un embudo forrado con un filtro de tela o papel (se utiliza un "Kimwipe" para este estudio, conocido como "toallita sin pelusa" en el protocolo actual) y se cierra sellado en la parte inferior. El embudo se llena con agua, sumergiendo la muestra mientras el filtro la separa de la salida sellada. Los nematodos activos en la muestra se liberan en el agua y nadan a través del filtro, finalmente se asientan en el fondo del embudo. Se abre la salida del embudo y se expulsa una gota de nematodos a una placa (Figura 1).
<img alt="Proceso de descomposición, extracción en embudo de Berlese, diagrama de aislamiento de insectos, configuración del estudio entomológico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Resumen de la técnica del embudo de Baermann. (A) Recolección de una muestra rica en bacterias de un sitio de interés. (B) Sumergir la muestra en un embudo de Baermann y esperar a que los gusanos se retuerzan y se hundan. (C) Liberar una sola gota del embudo. (D) Mover hermafroditas individuales o hembras apareadas a placas separadas. Ilustración creada por Ramin Rahni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
El embudo de Baermann no funcionará para todos los tipos de nematodos (consulte la sección Discusión para alternativas específicas) y es más adecuado para aquellos que son formas activas en el rango de tamaño de Caenorhabditis o más pequeñas14. Sin embargo, si un estudio puede usar el embudo de Baermann, hay muchas ventajas. El método es práctico en el campo, ya que requiere una configuración limitada, tiempo práctico y costo. El investigador se queda con una muestra limpia sin la obstrucción del sustrato en la placa, lo que facilita la recolección. El uso de un filtro también evita la contaminación de la placa por larvas de insectos o ácaros, que mastican placas o se alimentan de nematodos en la muestra. Lo más importante es que el embudo de Baermann extrae eficientemente casi toda la población del sustrato14, lo que puede ser necesario dependiendo del diseño del estudio. Por ejemplo, los investigadores interesados en contar la etapa o la distribución por sexo de las poblaciones silvestres, encontrar genotipos raros o de crecimiento lento, o muestrear nematodos no atraídos por OP50 podrían beneficiarse de este método. Esto es apropiado para los investigadores que estudian preguntas ecológicas17, genéticas de poblaciones18 o metagenéticas19, ya que el esquema de muestreo toma una instantánea de la población en el momento del muestreo.
El presente manuscrito describe un protocolo completo para aislar poblaciones de nematodos utilizando el embudo de Baermann y establecer líneas isofemale e isohermafroditas en el campo, utilizando equipos elegidos para facilitar el transporte. Para los investigadores que realizan trabajo de campo cerca de sus laboratorios, muchos de estos pasos pueden omitirse o simplificarse.

<table><tbody><tr><td>Botella de vidrio de 1 L</td><td>NA</td><td>NA Paso</td><td>1 - recipiente para hacer medios de placa</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta de 1 mL</td><td>cualquier</td><td>NA</td><td>Paso 1 - dispensar aditivos de medios de gusano y placas de semillas</td></tr><tr><td>1 mL pipeteo</td><td>cualquier</td><td>NA</td><td>Paso 1 - dispensar aditivos de medios de gusano y placas de semillas</td></tr><tr><td>Placas de tornillo sin fin de 35 mm</td><td>Tritech</td><td>T3500</td><td>Paso 1 - placas de tornillo sin fin Tubo</td></tr><tr><td>de goma de 4 mm de diámetro interior</td><td>Fisher</td><td>14178A</td><td>Paso 3 - parte del embudo Placas helicoidales de</td></tr><tr><td>60 mm</td><td>Greiner</td><td>628161</td><td>Paso 1 - placas helicoidales de</td></tr><tr><td>65 mm Embudo</td><td>Fisher</td><td>22170156</td><td>Paso 3 - parte del embudo</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Paso 1 - placa de gusano mediana</td></tr><tr><td>Olla de cocción</td><td>NA</td><td>NA Paso</td><td>1: un baño de agua para derretir el agar para verter placas</td></tr><tr><td>E. coli cepa OP50</td><td>Centro de Genética de Caenorhabditis</td><td>OP50</td><td>Paso 1 - alimento para lombrices</td></tr><tr><td>Microscopio de campo</td><td>OMAX</td><td>G223CS</td><td>Paso 6 - para ver gusanos en el campo</td></tr><tr><td>Bandeja de almacenamiento de viales Fly</td><td>Azer Scientific</td><td>ES-260T</td><td>Paso 3: para construir una plataforma para sostener 12 embudos</td></tr><tr><td>Placa calefactora o estufa</td><td>NA</td><td>NA Paso</td><td>1 - para calentar el baño de agua</td></tr><tr><td>Toallitas Kimwipes</td><td>KimberlyClark</td><td>34120</td><td>Paso 4 - filtro para los embudos</td></tr><tr><td>LB media</td><td>Gibco</td><td>10855021</td><td>Paso 1 - para el cultivo OP50</td></tr><tr><td>Lighter</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Paso 6 - esterilizar el pico de gusano</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td><td>Paso 1 - medio de placa helicoidal</td></tr><tr><td>NGM-lite</td><td>agar USBiological</td><td>N1000</td><td>Paso 1 - medio</td></tr> <tr><td>de placa helicoidalPelícula de envoltura Parafilm M</td><td>Fisher</td><td>13-374-10</td><td>Paso 6 - empaque placas helicoidales para viajes</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio dibásico</td><td>Fisher</td><td>BP363-500</td><td>Paso 1 - placa helicoidal medio</td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Fisher</td><td>P285-3</td><td>Paso 1 - placa helicoidal</td></tr><tr><td>bisturí</td> medio <td>NA</td><td>NA Paso</td><td>3 - corte agujeros para las</td></tr><tr><td>tijeras de</td> los embudos <td>NA</td><td>NA</td><td>Paso 3: corte el tubo de goma</td></tr><tr><td>Cinta</td><td>NA</td><td>NA Paso</td><td>3: pegue con cinta adhesiva el soporte del embudo</td></tr><tr><td>Abrazaderas de tubo</td><td>Fisher</td><td>5869</td><td>Paso 3 - parte del embudo</td></tr><tr><td>Pico de gusano</td><td>NA</td><td>NA Paso</td><td>6: para aislar gusanos individuales</td></tr><tr><td>Bolsas de almacenamiento tipo ziplock</td><td>NA</td><td>NA Paso</td><td>2: para embolsar una muestra de sustrato</td></tr></tbody></table>

aislamiento rápido de nematodos silvestres por baermann funnel

Rapid Isolation of Wild Nematodes by Baermann Funnel

Más allá de ser organismos modelo experimentales robustos, Caenorhabditis elegans y sus parientes también son animales reales que viven en la naturaleza. Los estudios de nematodos silvestres en sus entornos naturales son valiosos para comprender muchos aspectos de la biología, incluidos los regímenes selectivos en los que evolucionan los caracteres genómicos y fenotípicos distintivos, la base genética para la variación de rasgos complejos y la diversidad genética natural fundamental para todas las poblaciones animales. Este manuscrito describe un método simple y eficiente para extraer nematodos de sus sustratos naturales, incluyendo frutas podridas, flores, hongos, hojarasca y suelo. El método del embudo de Baermann, una técnica clásica de nematología, aísla selectivamente los nematodos activos de sus sustratos. Debido a que recupera casi todos los gusanos activos de la muestra, la técnica del embudo de Baermann permite la recuperación de genotipos raros y de crecimiento lento que coexisten con genotipos abundantes y de rápido crecimiento, que podrían perderse en los métodos de extracción que involucran múltiples generaciones de reproducción. La técnica también es muy adecuada para abordar cuestiones metagenéticas, genéticas de poblaciones y ecológicas. Captura a toda la población en una muestra simultáneamente, lo que permite una visión imparcial de la distribución natural de edades, sexos y genotipos. El protocolo permite el despliegue a escala en el campo, convirtiendo rápidamente los sustratos en placas de gusano, y los autores lo han validado a través del trabajo de campo en múltiples continentes.

Este protocolo se utilizó para aislar nematodos de frutas, flores, hongos, suelo y tallos en la isla de Barro Colorado, Panamá, en la estación de campo del Instituto Smithsonian de Investigaciones Tropicales en agosto de 2018. De los 131 sustratos procesados por un solo investigador durante cuatro días, 130 sustratos (99,2%) produjeron nematodos. Cuarenta y cuatro de los sustratos (33,6%) produjeron nematodos Caenorhabditis (Figura 5). El análisis posterior de los cultivos establecidos a partir de estos cuarenta y cuatro sustratos, mediante PCR y pruebas de apareamiento23, reveló la presencia de seis especies diferentes de Caenorhabditis : C. becei, C. tropicalis, C. briggsae, C. sp. 24, C. sp. 57 y C. panamensis.
Este protocolo se utilizó nuevamente para aislar nematodos de varios sustratos en la Zona de Exclusión de Chernobyl, Ucrania, durante cuatro días en agosto de 2019. Se recuperaron gusanos vivos de 62 de 63 muestras de suelo, 1 de cada 17 muestras de invertebrados, 31 de 75 muestras de frutas, 1 de cada 12 muestras de cebo (ver sección Discusión), y no se recuperaron gusanos de muestras de hongos, juncos de río o heces de lobo (una muestra recolectada de cada una). La secuenciación posterior del ADN ribosómico 18S15 identificó estos nematodos como Oscheius, Panagrolaimus, Acrobeloides, Mesorhabditis, Panagrellus, Pristionchus y Pelodera, pero no se identificó Caenorhabditis (Figura 5).
<img alt="Gráfico de barras de muestras de nematodos y Caenorhabditis en Panamá, Ucrania por ubicación y porcentaje recolectado." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: Tasas de éxito de dos viajes de recogida. Panamá en 2018 (izquierda) y Ucrania en 2019 (derecha). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo describe un método para extraer eficientemente nematodos vivos de sustratos naturales en el campo.

Aislamiento rápido de nematodos silvestres por Baermann Funnel

Beyond being robust experimental model organisms, Caenorhabditis elegans and its relatives are also real animals that live in nature. Studies of wild ...

Los nematodos Caenorhabditis son animales reales, que viven en la naturaleza. La recolección de nematodos silvestres, nos permite estudiar genes, y genomas en su contexto natural revelando funciones, que pueden ser oscurecidas por las condiciones artificiales del laboratorio. Esta técnica, extrae gusanos, de sustratos orgánicos ricos en bacterias en el campo, y crea cultivos limpios en placas de Petri, capturando una instantánea de cada población, en el momento en que se recolectó.Estas poblaciones son muy adecuadas para la ecología, la genética de poblaciones o las cuestiones de metagenética. Los cultivos de cepas silvestres también son valiosos para estudios genéticos cuantitativos. Esta técnica es simple y fácil de ejecutar, incluso para un novato en investigación de campo.Sin embargo, un viaje de recolección exitoso requiere una preparación cuidadosa de los materiales, antes de viajar. Identifique un sustrato rico en bacterias en el campo, como frutas podridas, flores, hongos, tallos de plantas herbáceas, suelo o hojarasca. Coloque un pequeño volumen del sustrato en una bolsa de plástico etiquetada.Si el material podrido es raro en el lado del campo de interés, coloque un poco de fruta como cebo. Déjelo rockear, luego recupérelo y cualquier gusano que lo haya colonizado. Registre el ID de la muestra, la latitud, la longitud, la fecha y la descripción del sustrato.Registre cualquier otra medición ambiental local, relevante para el experimento, como la temperatura ambiente y del sustrato, la condición del sustrato, el tiempo de recolección y la presencia de macro invertebrados asociados al sustrato. Use tijeras para cortar un segmento de tres centímetros, de tubos de goma de cada embudo. Coloque el tubo sobre el extremo de un embudo de plástico.Deslice una abrazadera de tubo sobre el tubo de goma y colóquelo. Para hacer un soporte de embudo, corte agujeros circulares, en el centro de una bandeja de cartón desplegada para moscas viles. Invierta el cartón, doble los lados una vez y péguelos con cinta adhesiva.Esto creará piernas, que elevan los agujeros por encima del banco. Asegúrese de que las abrazaderas de los tubos estén en la posición cerrada y coloque embudos en los orificios. Vierta agua estéril en cada embudo, llenándolo unos tres centímetros por debajo del borde.Toque el embudo para liberar cualquier burbuja de aire atrapada en el tubo. Dobla una toallita sin pelusa por la mitad, para hacer un cuadrado, y colócala sobre el embudo. Luego, presione la toallita hacia abajo, para sumergirla en el agua.Rompa manualmente cualquier pieza sólida grande, del sustrato natural. Coloque suavemente parte de la muestra en la toallita en el embudo. Asegúrese de no perforar la toallita ni dejar ninguna muestra que sobresalga por encima del borde.Doble con cuidado las esquinas de la toallita, sobre la muestra, para evitar que el agua se absorba, sobre el borde del embudo. Etiquete el embudo con el ID de ejemplo, correspondiente a las notas de colección de campos. Elija cualquier insecto activo, u otros animales, que puedan viajar y contaminar muestras cruzadas.Agregue más agua a cada embudo, para sumergir toda la muestra. Mientras se incuban a temperatura ambiente durante la noche, los nematodos activos se moverán a través del tejido y se hundirán hasta el fondo del embudo. Escriba la identificación de muestra de un embudo, en la parte inferior de una placa de gusano NGM de seis centímetros, asentada con una mancha de bacteria OP50 E.coli.Retire la tapa de la placa, retire el embudo, que contiene la muestra del soporte del embudo, y manténgala en posición vertical, por encima de la placa de gusano abierta, con una mano. Libere la presión sobre la abrazadera del tubo con la otra mano y permita que una o dos gotas de agua caigan del tubo sobre la placa de gusano junto al césped bacteriano. Tan pronto como el agua caiga del embudo, vuelva a cerrarla rápidamente para evitar que se inunde la placa NGM.Para limpiar, deseche el contenido de los embudos y lávelos con agua caliente, para su posterior reutilización. Observe los nematodos aislados bajo el microscopio estereoscópico. Además de los nematodos, ocasionalmente habrá pequeños anélidos Oligo kit, Tardígrados, rotíferos y pequeños crustáceos.Para establecer líneas hermafroditas ISO, o iso femeninas, transfiera cada hermafrodita L4 o hembra adulta acoplada, a una placa NGM separada de 3,5 centímetros, asentada con OP50. Esterilizar el pico del gusano, antes y después de cada transferencia. Finalmente, envuelva las placas a fondo para viajar, con una película de parafina.En la isla de Barro Colorado Panamá, en 2018, se procesaron 131 sustratos por este método. El 99% de los cuales produjeron nematodos. El 34% produjo nematodos Caenorhabditis.En la Zona de Exclusión de Chernobyl Ucrania, en 2019, se procesaron 170 sustratos por este método. El 56% de los cuales produjeron nematodos, ninguno de los cuales era Caenorhabditis. Este método funciona porque los nematodos nadan a través de la toallita.pero el sustrato y otros animales se mantienen en la cima. Muchos aspectos de un protocolo pueden ser modificados, para hacer uso de cualquier recurso disponible en el campo. Las muestras recolectadas utilizando este método, permiten a los investigadores abordar una amplia gama de preguntas de biología de poblaciones en cultivos establecidos para estudios de laboratorio posteriores.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Visualización de las bacterias en los nematodos mediante microscopía de fluorescencia

Fuente: Morgan, E., et al. Limpieza selectiva de nematodos silvestres Caenorhabditis para enriquecer bacterias del microbioma intestinal. J. Vis. Exp. (2021)Este vídeo demuestra un protocolo para aislar bacterias intestinales de interés de gusanos silvestres de Caenorhabditis . Primero se muere de hambre y lava a los gusanos para eliminar bacterias residuales de su superficie e intestino, preservando al mismo tiempo los microbios objetivo. Tras la limpieza superficial y varios pasos de...

Limpieza selectiva de gusanos de Caenorhabditis para el enriquecimiento de la microbiota intestinal

Los animales salvajes suelen ser parasitados por una amplia gama de helmintos. Los cuatro tipos principales de helmintos son los "gusanos redondos" (nematodos), los "gusanos de cabeza espinosa" (acantocéfalos), los "trematodos" y las "tenias" (cestodos). Aquí describimos cómo se recolectan los helmintos de un animal vertebrado y cómo se conservan e identifican taxonómicamente.

Recolección e identificación de helmintos de la vida silvestre

Nematodos entomopatógenos son gusanos redondos habitan en el suelo que parasitan una amplia gama de insectos. Demostramos métodos de muestreo utilizados para el aislamiento de estos nematodos del suelo mediante dos técnicas: la de cebado de insectos y la trampa de Blanco modificada, para la recuperación de nematodos de muestras de suelo y cadáveres de insecto infectadas, respectivamente.

Muestreo de suelos y aislamiento de nematodos entomopatógenos (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

El objetivo de esta presentación es demostrar en vivo y en técnicas in vitro para la crianza de los nematodos entomopatógenos. Métodos in vivo consideran la crianza de estos nematodos con un insecto huésped, mientras que los métodos in vitro utilizan rich media agar.

In vivo e in vitro Crianza de nematodos entomopatógenos (Steinernematidae y Heterorhabditidae)

Heligmosomoides polygyrus es un nematodo murino con potentes capacidades inmunomoduladoras que se asemejan mucho a los de la infección por helmintos humano altamente prevalente. Aquí se describe un protocolo para el mantenimiento a largo plazo de la H. ciclo de vida polygyrus.

El cultivo de<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Un inmunomodulador nematodo parásito y sus productos secretados

Se presenta un protocolo para investigar el comportamiento de apareamiento del nematodo del pino, Bursaphelenchus xylophilus. Las características de comportamiento de B. xylophilus se describen en el proceso de apareamiento.

La observación y cuantificación de la conducta de apareamiento en el nematodo del pino, Bursaphelenchus xylophilus

Los nematodos de Caenorhabditis silvestre están asociados con muchos microbios, a menudo en la luz intestinal o infectando el intestino. Este protocolo detalla un método para enriquecer microbios inculturables que colonizan el intestino, aprovechando la resistencia de la cutícula dauer.

Limpieza selectiva de nematodos silvestres de Caenorhabditis para enriquecer las bacterias del microbioma intestinal

El kit de herramientas genómicas funcionales para los nematodos parásitos Strongyloides stercoralis y Strongyloides ratti incluye transgénesis, mutagénesis mediada por CRISPR / Cas9 y ARNi. Este protocolo demostrará cómo utilizar la microinyección intragonadal para introducir transgenes y componentes CRISPR en S. stercoralis y S. ratti.

Generación de transgénicos y knockouts en especies de Strongyloides por microinyección

Este protocolo se puede utilizar para realizar estudios ecológicos a gran escala de los nematodos Caenorhabditis . La principal ventaja de este método es la organización y el análisis eficientes de los datos ecológicos y moleculares asociados con los nematodos recogidos de la naturaleza.

Un enfoque altamente escalable para realizar estudios ecológicos de los nematodos de Caenorhabditis Selfing

Caenorhabditis elegans es una de las principales especies modelo en biología, sin embargo, casi todas las investigaciones se realizan en ausencia de sus microbios naturalmente asociados. Los métodos descritos aquí ayudarán a mejorar nuestra comprensión de la diversidad de microbios asociados como base para futuras investigaciones funcionales de C. elegans.

Aislamiento y caracterización de la microbiota natural del nematodo modelo Caenorhabditis elegans

Aprende a aislar nematodos silvestres mediante el método de embudo de Baermann para estudios de ecología y genética poblacional. Esta técnica permite extraer Caenorhabditis de sustratos naturales y establecer cultivos limpios.

Aislamiento rápido de nematodos silvestres por Baermann Funnel

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