Cultivo de linfocitos en microgravedad simulada utilizando un sistema de cultivo celular rotativo

Esta técnica nos permite estudiar los efectos de la microgravedad simulada en las células inmunes para ayudarnos a comprender mejor cómo los aspectos del entorno espacial afectan la fisiología humana a nivel molecular. Esta técnica es económicamente factible y es relativamente fácil de configurar y mantener en comparación con el envío de cultivos celulares al espacio u otros métodos de someter el cultivo celular a microgravedad simulada en la tierra. Se recomienda ir lentamente mientras se llenan los recipientes para evitar desbordamientos y derrames.

Después de la eliminación inicial de la burbuja, asegúrese de que los recipientes estén completamente llenos usando las jeringas. Esto minimizará las posibilidades de formación de burbujas grandes durante todo el tratamiento. Comience sacando los recipientes de cultivo del embalaje de plástico.

Etiquete cada vaso en el borde de acuerdo con el tipo de celda o línea que se utiliza, ya sea en el control o tratamiento y cualquier otra información relevante. Estabilice el recipiente y abra el puerto de llenado con cuidado sin tocar la clavija de la tapa del puerto de llenado o la junta tórica. Coloque la tapa en una almohadilla de etanol con la clavija o junta tórica hacia arriba mientras se llena el recipiente.

No retire las tapas de los puertos de la jeringa. Cargue el recipiente con 10 ml del medio completo apropiado para el cultivo celular utilizando una pipeta serológica estéril y coloque cuidadosamente la tapa en el puerto de llenado. Asegúrese de que las tapas del puerto de la jeringa y el puerto de llenado estén bien cerrados.

Luego, coloque los recipientes llenos en una incubadora mientras realiza los pasos posteriores para preparar los recipientes para el cultivo celular. Recupere los recipientes cebados con medios de la incubadora. Para el control del matraz, cargar un matraz de cultivo en suspensión T25 con 10 ml de cultivo celular del material preparado anteriormente.

Agregue 10 ml de cultivo de células madre a un tubo cónico separado de 15 ml, que se utilizará para cargar las jeringas. Desenrosque las tapas de los puertos de la jeringa para retirarlas del recipiente y asegúrese de que las llaves de paso de la culata estén en posición abierta. Estabilice el recipiente y abra el puerto de llenado con cuidado sin tocar la clavija de la tapa del puerto de llenado o la junta tórica.

Coloque la tapa en una almohadilla de etanol con la clavija o junta tórica hacia arriba mientras se llena el recipiente. Asegúrese de que las llaves de paso estén en la posición abierta. El recipiente se puede vaciar vertiendo los medios del recipiente en un contenedor de residuos utilizando una pipeta serológica.

Alternativamente, aspire el medio con un vidrio estéril más allá de su pipeta conectada a un sistema de vacío. Mientras usa una pipeta o el sistema de vacío, asegúrese de no tocar la membrana de oxigenación, ya que esto podría dañarla y dejar el recipiente inutilizable. Cierre herméticamente el tubo cónico de 50 ml que contiene el cultivo de células madre preparado e invierta suavemente varias veces para mezclar bien el contenido.

Extraiga 10 ml de material de cultivo celular del tubo de 50 ml con una pipeta serológica estéril fresca. Levante el recipiente e inclínelo, de modo que el puerto de llenado esté hacia la parte superior. Luego dispense cuidadosamente el stock de cultivo celular en el recipiente a través del puerto de llenado.

Llene el recipiente hasta la punta del puerto de llenado, mientras inclina el recipiente hacia abajo para evitar derrames. Tenga cuidado de no tocar la membrana de oxigenación con la pipeta, ya que es muy frágil. Una vez que el recipiente esté cargado, vuelva a colocar con cuidado la tapa del puerto de llenado sin tocar la junta tórica.

Retire la primera jeringa de 3 ml de su paquete y bombéela varias veces para aflojarla. Luego conecte la jeringa a uno de los puertos de la jeringa, asegurándose de que la jeringa esté completamente presionada. Cierre herméticamente el tubo cónico de 15 ml que contiene 10 ml de cultivo celular alícuota e invierta suavemente varias veces para mezclar bien el contenido.

Del mismo modo, retire la segunda jeringa de 3 ml de su paquete y bombéela varias veces. Luego, sumergió cuidadosamente esta jeringa en el cultivo celular del tubo cónico de 15 ml y elaboró un poco de cultivo. Minimice las burbujas de aire dispensando completamente la jeringa de nuevo en el tubo y extrayendo 3 ml de cultivo.

Conecte la jeringa llena al puerto de la jeringa restante y desinfecte cuidadosamente las jeringas y alrededor del puerto de llenado con una almohadilla de etanol. No obtenga etanol en la membrana de oxigenación. Repita el proceso para los recipientes restantes.

Si queda un cultivo celular ligeramente insuficiente en el tubo cónico de 50 ml para el último vaso, recupere la cantidad restante del tubo cónico de 15 ml utilizado para cargar las jeringas. Asegúrese de que las llaves de paso del puerto de la jeringa estén cerradas para limitar la migración de células y burbujas de las jeringas a los vasos. Voltee el recipiente boca abajo y golpee hacia un lado varias veces para recoger las burbujas iniciales.

Voltee rápidamente el recipiente hacia atrás para mirar hacia arriba, y luego en un ligero ángulo hacia afuera, de modo que todas las burbujas floten hacia el lado hacia arriba del recipiente. Maniobra las burbujas debajo del puerto con la jeringa vacía y observa cómo comienzan a entrar en el puerto. Abra ambas llaves de paso del puerto de la jeringa.

Golpee suavemente el recipiente para alentar a las burbujas a flotar en la jeringa vacía. Aspire lentamente las burbujas más grandes con la jeringa vacía mientras presiona cuidadosamente la jeringa llena para mantener la presión en el recipiente, de modo que la membrana de oxigenación no reviente. Repita este proceso varias veces para asegurarse de que se eliminen todas las burbujas.

Cuando las burbujas se hayan eliminado eficazmente, cierre las llaves de paso del puerto de la jeringa. Mantenga las jeringas puestas durante el tratamiento para permitir la posterior eliminación de burbujas, asegurando que el volumen en ambas jeringas sea aproximadamente igual. Limpie cuidadosamente la superficie de la base giratoria y el cable de cinta con 70% de etanol.

Asegúrese de que el cable de cinta esté conectado a la fuente de alimentación. Coloque la base giratoria en la incubadora y fije el cable de cinta a la base. Coloque la fuente de alimentación cerca, pero fuera de la incubadora.

Fije el recipiente de tratamiento SMG alineando las roscas del recipiente a la clavija giratoria y girando suavemente la clavija giratoria en la base en sentido contrario a las agujas del reloj. Asegúrese de que el recipiente esté bien sujeto. Mantenga la incubadora a aproximadamente 100% de humedad llenando la bandeja de agua con agua RO en autoclave.

Ajuste la velocidad de rotación de la incubadora para que coincida con la velocidad de sedimentación de las células, de modo que las células no caigan a través del medio. El primer día de configuración del tratamiento, verifique la formación de burbujas cada pocas horas como se describe en el manuscrito de texto. Retire las burbujas al menos una vez al día hasta el final de la duración deseada del tratamiento.

Una vez transcurrida la duración prevista del tratamiento, detener la rotación y desmontar el aparato. Retire el recipiente de tratamiento sosteniendo suavemente el recipiente estacionario mientras gira la clavija giratoria del dispositivo en el sentido de las agujas del reloj. Llevar el matraz de control, el control y el recipiente tratado a un armario de seguridad biológica estéril.

Tome cada recipiente excluyendo el matraz de control y voltéelo, de modo que mire hacia abajo. Luego golpee suavemente para poner todas las células en suspensión. Luego gire el recipiente de lado con el puerto de llenado hacia la parte inferior y vuelva a golpearlo para guiar las celdas hacia el puerto de llenado para una aspiración eficiente.

Maneje cada embarcación individualmente. Desenrosque las jeringas de los dos puertos y dispense en los residuos de riesgo biológico. Abra las llaves de paso en los puertos de la jeringa.

Retire con cuidado la tapa del puerto de llenado y extraiga el contenido con una pipeta serológica estéril de 10 ml, inclinando el recipiente a medida que se vacía. Dispensar el contenido de todos los grupos de control y tratamiento en tubos cónicos de 15 ml etiquetados individualmente. Cierre cada tubo e invierta suavemente varias veces para asegurarse de que estén bien mezclados.

Utilice el método preferido para determinar la concentración y viabilidad del cultivo celular resultante para prepararse para ensayos experimentales posteriores. La viabilidad inicial de la línea celular NK-92 y las densidades de asiento se compararon con la viabilidad final resultante y las concentraciones finales. Después de un tratamiento con SMG de 72 horas, se compararon dos casos de resultados negativos y positivos.

A modo de comparación, el rango de concentración óptimo de la línea celular NK-92 utilizada fue de entre 0,3 y 1,2 millones de células por mililitro, con un tiempo de duplicación de alrededor de dos a tres días. La proliferación en el grupo de tratamiento con SMG fue aproximadamente igual en los grupos de control y tratamiento. Estos parámetros fueron esenciales para el éxito experimental aguas abajo y las células resultantes de los dos grupos de control se desempeñaron de manera similar en los ensayos experimentales aguas abajo.

Es crucial monitorear y tener en cuenta la formación de burbujas durante todo el curso del tratamiento, especialmente en el cultivo celular sometido a microgravedad simulada. La formación de burbujas grandes puede causar la interrupción de la dinámica de fluidos dentro del recipiente, y esto esencialmente negará la condición de microgravedad simulada.