Name: Diferenciación robusta de iPSCs humanas en una población pura de adipocitos para estudiar trastornos asociados a adipocitos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Aprende a diferenciar iPSCs humanas en adipocitos puros mediante ácido retinoico y tinción con Nile red. Este protocolo mejora la eficiencia y pureza para estudiar trastornos metabólicos.

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Este trabajo fue financiado por una subvención del Fondo Nacional de Investigación de Qatar (QNRF) (Subvención No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi fue apoyada por la beca GSRA del Fondo Nacional de Investigación de Qatar (QNRF).

El estudio ha sido aprobado por el comité ético de investigación institucional apropiado y realizado siguiendo los estándares éticos establecidos en la Declaración de Helsinki de 1964 y sus enmiendas posteriores o estándares éticos comparables. El protocolo fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de HMC (no. 16260/16) y QBRI (no. 2016-003). Este trabajo también está optimizado para hESCs como H1 y H9. Se obtuvieron muestras de sangre de individuos sanos con pleno consentimiento informado. Las iPSCs se generan a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de individuos sanos.
1. Cultivo y mantenimiento de iPSCs
<ol><li>Preparar las placas recubiertas de matriz de membrana basal reconstituyendo la matriz de recubrimiento en DMEM knockout en una proporción de 1:80 y almacenar a 4 °C.</li>
	<li>Prepare medios de cultivo iPSCs agregando 50 ml de 10x medios de suplemento de células madre a 500 ml de medios basales de células madre, junto con 5 ml de 100x penicilina-estreptomicina (P/S) y guárdelos a 4 °C para uso a corto plazo o a -20 °C para uso a largo plazo.</li>
	<li>Forrar las placas con matriz de recubrimiento (1 ml para una placa de 6 pocillos, 500 μL para una placa de 12 pocillos, 250 μL para una placa de 24 pocillos) e incubar la placa a 37 °C durante 1-2 h.</li>
	<li>Retire una alícuota de medios de cultivo iPSCs y precaliente a temperatura ambiente antes de usar.</li>
	<li>Descongele un vial de iPSCs (ESCs o iPSCs) en un baño maría a 37 °C y transfiéralo a un tubo cónico de 15 mL que contenga 2-3 mL de medios de cultivo.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 120 x g durante 4 min a temperatura ambiente (RT-23 °C).</li>
	<li>Retire el sobrenadante y agregue 2 ml de medios de cultivo frescos suplementados con un inhibidor ROCK de 10 μM (Y-27632). Colocar las células en un pocillo de una placa de 6 pocillos recubierta de matriz y colocar la placa a 37 °C.</li>
	<li>Después de 24 h, retire el medio y reemplácelo con medios de cultivo frescos.</li>
	<li>Cambie los medios todos los días hasta que las células alcancen el 80% -90% de confluencia.</li>
	<li>Al llegar a la confluencia, pase las celdas siguiendo los pasos que se describen a continuación.<ol><li>Retire el medio y lave las células con solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco.</li>
		<li>Añadir reactivo de disociación iPSCs (ver Tabla de materiales) -500 μL para un pocillo de una placa de 6 pocillos, 250 μL para un pocillo de una placa de 24 pocillos e incubar durante 1 min a 37 °C.</li>
		<li>Retirar el reactivo de disociación e incubar las células secas durante 1 min a 37 °C.</li>
		<li>Recolectar las células usando medios de cultivo -1 ml para un pocillo de una placa de 6 pocillos y 250 μL para un pocillo de una placa de 24 pocillos- en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 120 x g durante 4 min.</li>
		<li>Resuspender células en medios de cultivo-2 mL para un pocillo de una placa de 6 pocillos y 500 μL para un pocillo de una placa de 24 pocillos suplementada con un inhibidor ROCK de 10 μM y placarlas en placas recubiertas de matriz fresca al 40% de confluencia.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Diferenciación de iPSC en MSCs
<ol><li>Preparar medios de diferenciación MSC añadiendo 15% de suero fetal bovino (FBS) y 1% P/S a DMEM + piruvato bajo en glucosa y almacenar a 4 °C.</li>
	<li>Al alcanzar el 80% de confluencia, use iPSC para la formación del cuerpo embrioide (EB) siguiendo los pasos que se describen a continuación.<ol><li>Lave las células con DPBS e incubarlas con medio de disociación/EDTA-500 μL para un pocillo de una placa de 6 pocillos, 250 μL para un pocillo de una placa de 24 pocillos.</li>
		<li>Incubar a 37 °C durante 1 min, aspirar el reactivo de disociación y mantener las células a 37 °C durante 1 min adicional. Para iniciar la diferenciación MSC, se requieren ~10-12 x 106 celdas.</li>
		<li>Recolectar las células en un tubo cónico de 15 ml utilizando medios de cultivo. Asegúrese de ser muy suave durante la recolección para evitar que las células se vuelvan solteras y permitir la formación de EB. Centrifugar las células a 120 x g durante 4 min.</li>
		<li>Resuspender las células en 3 ml de medios de diferenciación MSC que contengan 10 μM inhibidor de ROCK.</li>
		<li>Mezcle y distribuya 0,5 ml/pocillo en una placa de fijación ultra baja de 24 pocillos. NOTA: El uso de una placa de fijación ultra baja fomentaría la agregación celular en EB en lugar de su fijación en la superficie.</li>
		<li>Colocar la placa en la incubadora a 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Después de 24 h, inducir los EB alcanzados con un tratamiento con ácido retinoico (AR) alto siguiendo los pasos que se describen a continuación.<ol><li>Añadir 10 μM RA a 3 ml de medios de diferenciación MSC. Recoja los EB en un tubo de 15 ml y déjelos asentarse durante 15 minutos.</li>
		<li>Retire el sobrenadante de los EB y agregue medios de diferenciación MSC suplementados con 10 μM RA.</li>
		<li>Resuspenda suavemente y distribuya 0,5 ml/pocillo en la misma placa de fijación ultra baja de 24 pocillos.</li>
		<li>Colocar la placa en la incubadora a 37 °C. No molestar a los EB durante las próximas 48 h.</li>
		<li>Después de 48 h, recoja los EB en un tubo de 15 ml y déjelos asentarse durante 15 minutos.</li>
		<li>Retire el sobrenadante de los EB y agregue medios de diferenciación MSC suplementados con 0.1 μM RA.</li>
		<li>Resuspenda suavemente y distribuya 0,5 ml/pocillo en la misma placa de fijación ultra baja de 24 pocillos.</li>
		<li>Colocar la placa en la incubadora a 37 °C. No molestar a los EB durante las próximas 48 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Elimine el RA agregado a las celdas siguiendo los pasos que se describen a continuación.<ol><li>Después de 48 h del último tratamiento de AR, recoger los EB y dejar que se asienten durante 15 min.</li>
		<li>Retire el sobrenadante y agregue DMEM medios de glucosa baja sin citoquinas.</li>
		<li>Resuspenda suavemente y distribuya 0,5 ml/pocillo en una placa de fijación ultrabaja de 24 pocillos. Colocar la placa en la incubadora a 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque los EB derivados de iPSC siguiendo los pasos que se describen a continuación.<ol><li>Después de 48 h del paso anterior (paso 2.4), recoja los EB en un tubo de 15 ml y déjelos reposar durante 15 minutos.</li>
		<li>Retire el sobrenadante y vuelva a suspender en 2 ml de medios de diferenciación MSC frescos.</li>
		<li>Transferencia a dos pocillos de una placa de 6 pocillos recubierta de matriz de membrana basal.</li>
		<li>Cambie los medios cada dos días durante 5 días adicionales.</li>
		<li>Después de 5 días, retire el medio gastado y reemplácelo con un nuevo medio de diferenciación MSC que contenga 2,5 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF).</li>
	</ol></li>
	<li>Pase los EB plateados cuando alcancen la confluencia del 80% -90%, siguiendo los pasos que se describen a continuación.<ol><li>Lavar las células con DPBS, añadir tripsina -EDTA-500 μL para un pocillo de una placa de 6 pocillos e incubar las células a 37 °C durante 3 min.</li>
		<li>Recolectar las células usando medios de diferenciación MSC en un tubo cónico de 15 ml y girar a 750 x g durante 4 min.</li>
		<li>Resuspender en medios de diferenciación MSC con 2,5 ng/ml de bFGF y placar las células en placas recubiertas con matriz de membrana basal en una proporción de 1:3.</li>
		<li>Repita el pasaje cuando las células alcancen el 70%-80% de confluencia. Se espera que gane 3-6 millones de células por 2-3 pasajes.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Análisis por citometría de flujo de MSCs derivadas de iPSCs
NOTA: Al someterse a 2-3 pasajes, se debe acceder a las celdas para la eficiencia de la diferenciación de MSC. La diferenciación se considerará exitosa si las células expresan marcadores de diferenciación MSC: CD44, CD73, CD90 y CD105 con una eficiencia superior al 90%, y no expresan altos niveles de marcadores hematopoyéticos: CD14, CD19, CD34 y CD45. Se puede acceder a la eficiencia de estos marcadores siguiendo los pasos a continuación.
<ol><li>Pase las celdas siguiendo los pasos descritos anteriormente (paso 2.6) y obtenga 1 x 105 celdas en un pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en V.</li>
	<li>Centrifugar la placa a 375 x g durante 4 min a 4 °C.</li>
	<li>Resuspender 1 x 105 células en 100 μL de DPBS frío con 1 μL de anticuerpo conjugado (Ab) (ver Tabla de materiales) e incubar a 4 °C durante 30-40 min evitando la exposición a la luz.</li>
	<li>Resuspender otras 1 x 105 células en 100 μL de DPBS frío con el respectivo control de isotipo del Ab conjugado a una concentración de 1:100 ) e incubar a 4 °C durante 30-40 min evitando la exposición a la luz.</li>
	<li>Después de la incubación, centrifugar la placa a 375 x g durante 4 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante agitando el plato sobre el fregadero.</li>
	<li>Resuspender las células en 100 μL de DPBS frío.</li>
	<li>Centrifugar las células a 375 x g durante 4 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender las células en 200 μL de DPBS frío y recoger en tubos de microcentrífuga oscuros y fríos de 1,5 ml y mantenerlos en hielo hasta que se analicen mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).</li>
	<li>Para el análisis de FACS, distribuya las celdas utilizando dispersión lateral (SSC-A) versus dispersión directa (FSC-A) para excluir los desechos. Además, distribuya las celdas cerradas utilizando la altura dispersa hacia adelante (FSC-H) frente al área dispersa hacia adelante (FSC-A) para distinguir los singletes de los dobletes de la población de células vivas. NOTA: Las células se cerraron en relación con el cambio de control de isotipo para cada marcador, y se utilizó un mínimo de 10,000 eventos cerrados de cada muestra teñida para el análisis.</li>
</ol>4. Diferenciación de MSCs en adipocitos
<ol><li>Preparar los medios basales de diferenciación de adipocitos añadiendo un 10% de reemplazo sérico knockout (KOSR), 1% de glutamina, 1% de P/S, 4,5 ng/μL de glucosa a un medio esencial mínimo (MEM)-alfa y almacenar a 4 °C.</li>
	<li>Permitir que las MSC alcancen una confluencia superior al 90%. Continúe cultivándolos durante otras 48 horas para permitir que se sometan a un período de detención del crecimiento.</li>
	<li>Prepare medios completos de diferenciación de adipocitos agregando 100 μg/ml de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), 1 μM de dexametasona, 0,2 U/ml de insulina, 100 μM de indometacina y 10 μM de rosiglitazona a los medios basales.</li>
	<li>Retire los medios de diferenciación MSC y lave las células con DPBS.</li>
	<li>Añadir medios completos de diferenciación de adipocitos -2 ml para un pocillo de una placa de 6 pocillos y 1 ml para un pocillo de una placa de 12 pocillos- e incubar las células a 37 °C. Cambie los medios de diferenciación completa cada dos días durante 14 días.</li>
</ol>5. Evaluación de la eficiencia de diferenciación de los adipocitos
<ol><li>En el día 14 de diferenciación, verifique la eficiencia de la diferenciación teñiendo las células para marcadores de maduración de adipocitos, FABP4 y adiponectina.</li>
	<li>Retire el medio y lave las células con DPBS.</li>
	<li>Fijar las células con paraformaldehído al 4% (PFA) - 200 μL a un pocillo de una placa de 24 pocillos - e incubar a temperatura ambiente durante 15 min.</li>
	<li>Deseche el PFA y lávelo con solución salina tamponada con tris con tween al 0,5% (TBST) y colóquelo en una coctelera a temperatura ambiente durante 15 min. Repita el proceso dos veces.</li>
	<li>Permeabilice las células fijas con solución salina tamponada con fosfato con Triton X-100 (PBST) al 0,5% y colóquela en un agitador a temperatura ambiente durante 15-20 min.</li>
	<li>Desechar el PBST y añadir el tampón de bloqueo (albúmina sérica bovina (BSA) al 5% -6% en PBST)-500 μL para un pocillo de una placa de 6 pocillos y 250 μL para un pocillo de una placa de 12 pocillos- e incubar a temperatura ambiente en el agitador durante 40-60 min.</li>
	<li>Diluir los anticuerpos primarios contra FABP4, adiponectina en 2% -3% BSA, a una concentración de 1:500 (ver Tabla de materiales). Añadir estos anticuerpos juntos sólo si se crían en diferentes animales y colocar la placa en el agitador a 4 °C, durante la noche.</li>
	<li>Retire los anticuerpos primarios y lave las células tres veces con TBST (15 minutos cada una) y colóquelo en un agitador a temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare anticuerpos secundarios de Alexa Fluor en PBST (1:500). Incubar las células en las combinaciones de anticuerpos secundarios (según la especie en la que se eleva el anticuerpo primario) durante 60 minutos a temperatura ambiente y cubrir la placa con papel de aluminio para protegerla de la luz.</li>
	<li>Deseche los anticuerpos secundarios, lávese con TBST tres veces y coloque la placa en el agitador.</li>
	<li>Para teñir los núcleos, añadir 1 μg/ml de Hoechst 33342-200 μL para un pocillo de una placa de 24 pocillos diluida en PBS e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Deseche la solución de Hoechst y agregue PBS-500 μL para un pocillo de una placa de 24 pocillos a las células. Mantenga las placas cubiertas de luz hasta que se visualicen con un microscopio de fluorescencia invertida.</li>
</ol>6. Clasificación de adipocitos usando rojo del Nilo
<ol><li>Preparar la solución de trabajo de rojo del Nilo añadiendo 1 mg/ml de solución madre roja del Nilo en DMSO y almacenar a -20 °C. Justo antes de su uso, descongele la cepa roja del Nilo y reconstituya en DPBS para alcanzar una concentración de solución de trabajo de 300 nM.</li>
	<li>En o después del día 14 de diferenciación de adipocitos, deseche los medios de las células y lave con DPBS.</li>
	<li>Añadir la solución de trabajo rojo del Nilo -1 ml en un pocillo de una placa de 6 pocillos- e incubar a 37 °C durante 15 min.</li>
	<li>Retirar la solución roja del Nilo y añadir tripsina-EDTA -500 μL en un pocillo de una placa de 6 pocillos- e incubar a 37 °C durante 4 min.</li>
	<li>Recoja las células usando DMEM que contiene 5% de FBS en un tubo cónico de 15 ml. Centrifugadora a 750 x g durante 4 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y vuelva a suspenderlo en DPBS-1 ml para 1 x 106 células. Centrifugadora a 750 x g durante 4 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y vuelva a suspenderlo en DPBS-1 ml para 1 x 106 células. Utilice un clasificador FACS para aislar los glóbulos rojos positivos del Nilo utilizando el canal FL1.</li>
	<li>Vuelva a cultivar las células clasificadas en medios de diferenciación de adipocitos o recolecte las células clasificadas para el aislamiento de ARN y proteínas.</li>
	<li>Extraiga ARN de las células clasificadas y realice un análisis cuantitativo relativo de los marcadores de diferenciación de adipocitos, incluidos FABP4, PPARG y C / EBPA. Las células rojas positivas del Nilo muestran una regulación positiva significativa en la expresión génica de al menos dos pliegues en comparación con las células no clasificadas.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Este protocolo tiene una importancia primordial debido a su capacidad para proporcionar MSC en alto rendimiento y eficiencia. Esta producción a gran escala de MSC fue posible gracias a la incubación transitoria de EB derivadas de iPSCs con 10 μM de RA14,15. El tratamiento transitorio con 10 μM de AR mejoró el rendimiento de MSC de 11,2 a 1542 veces14,15, siendo este protocolo aplicable tanto en iPSCs como...

Las células madre mesenquimales (MSC) actúan como un recurso transitorio eficaz para producir células de origen mesodérmico como adipocitos, osteocitos y condrocitos, que podrían usarse para modelar sus respectivos trastornos genéticos. Sin embargo, los enfoques anteriores se basaron en la obtención de estas MSC a partir de tejidos adultos 1, lo que impuso el desafío de obtenerlas en grandes cantidades de los donantes, y la limitación de mantenerlas funcionalmente viables en condiciones de cultivo in vitro subóptimas 1,2. Estos obstáculos han producido una gran demanda de contar con un protocolo para generar MSCs in vitro. Las células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs) pueden ser utilizadas como una valiosa fuente de MSCs, exhibiendo características MSC 3,4,5. Las MSC derivadas de iPSCs se pueden utilizar como una opción terapéutica en varias enfermedades. Además, la capacidad de las MSC derivadas de iPSCs para generar adipocitos, las convierte en un valioso modelo humano in vitro para estudiar la adipogénesis humana, la obesidad y los trastornos asociados a los adipocitos.
Los protocolos actuales de diferenciación de los adipocitos se pueden clasificar en dos grupos, uno que implica la diferenciación de los adipocitos utilizando cócteles químicos o basados en proteínas que dan un rendimiento resultante de 30%-60%6,7,8,9, mientras que el otro implica la manipulación genética para la inducción robusta de factores de transcripción clave que rigen el desarrollo de los adipocitos para dar un rendimiento del 80%-90%10, 11. Sin embargo, la manipulación genética no recapitula el proceso natural de diferenciación de los adipocitos, y a menudo enmascara los paradigmas sutiles que llegan durante la adipogénesis, haciéndola ineficaz para fines de modelado de enfermedades12,13. Por lo tanto, presentamos una forma de clasificar los adipocitos maduros derivados químicamente de los inmaduros marcando fluorescentemente los adipocitos que contienen lípidos utilizando rojo del Nilo.
Aquí presentamos un protocolo que involucra la incubación transitoria de cuerpos embrioides (EB) derivados de iPSCs con ácido todo-trans retinoico para producir un alto número de MSCs de rápida proliferación, que podrían ser utilizados para generar adipocitos14. También presentamos una forma de clasificar los adipocitos maduros derivados químicamente del grupo de diferenciación heterogénea marcando fluorescentemente sus gotas de lípidos utilizando un colorante lipofílico; Rojo del Nilo. Esto permitiría la generación de una población pura de adipocitos maduros con funcionalidad mejorada para modelar con precisión los trastornos metabólicos asociados a los adipocitos.

<table><tbody><tr><td>Adiponectina</td><td>Abcam</td><td>ab22554</td><td>Marcador de maduración de adipocitos</td></tr><tr><td>anti-CD105</td><td>BD Pharmingen</td><td>560839</td><td>Marcador de diferenciación MSC</td></tr><tr><td>anti-CD14</td><td>BD Pharmingen</td><td>561712</td><td>Marcador de diferenciación MSC</td></tr><tr><td>anti-CD19</td><td>BD Pharmingen</td><td>555415</td><td>Marcador de diferenciación MSC</td></tr><tr><td>anti-CD34</td><td>BD Pharmingen</td><td>555824</td><td>Marcador de diferenciación MSC</td></tr><tr><td>anti-CD44</td><td></td><td>abcam ab93758</td><td>Marcador de diferenciación MSC</td></tr><tr><td>anti-CD45</td><td>BD Pharmingen</td><td> 560975</td><td>Marcador de diferenciación MSC</td></tr><tr><td>anti-CD73</td><td>BD Pharmingen</td><td>550256</td><td>Marcador de diferenciación MSC</td></tr><tr><td>anti-CD90</td><td>BD Pharmingen</td><td>555596</td><td>Marcador de diferenciación MSC</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D</td><td>233-FP</td><td>Suplemento de medios de cultivo MSC</td></tr><tr><td>C/EBPA</td><td>Abcam</td><td>ab40761</td><td>Marcador de maduración de adipocitos</td></tr><tr><td>Dexametasona</td><td>Torics</td><td>1126</td><td>Suplemento de medios de diferenciación de adipocitos</td></tr><tr><td>FABP4</td><td>Abcam</td><td>ab93945</td><td>Marcador de maduración de adipocitos</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>ThermoFisher</td><td>10082147</td><td>MSC suplemento de medios de cultivo</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>ThermoFisher</td><td>35050-061</td><td>MSC suplemento de medios de cultivo</td></tr><tr><td>IBMX</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5879</td><td>Suplemento de medios de diferenciación de adipocitos</td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I7378</td><td>Suplemento de medios de diferenciación de adipocitos</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>91077C</td><td>Suplemento de medios de diferenciación de adipocitos</td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>12660012</td><td>Medios basales para la preparación de matrigel</td></tr><tr><td>DMEM de baja glucosa</td><td>ThermoFisher</td><td>11885084</td><td>MSC Medios de cultivo</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Matriz</td></tr><tr><td>de recubrimiento MEM-alpha</td><td>ThermoFisher</td><td>12561056</td><td>Medios de diferenciación de adipocitos</td></tr><tr><td>Nilered</td><td>Sigma Aldrich</td><td>19123</td><td>Marcador de clasificación para adipocitos</td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>MSC/Suplemento de medios de adipocitos</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Tampón de lavado</td><td>ThermoFisher</td><td>14190144</td></tr><tr><td>Pierce&trade; Tampón 20X TBS Tampón de</td><td>lavado</td><td>Thermo Fisher</td><td>28358</td></tr><tr>Tecnología <td>de señalización celular</td><td>PPARG</td><td>2443</td><td>Marcador de maduración de adipocitos</td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>Stem Cell Tecnologías</td><td>5872</td><td>Reactivo de disociación</td></tr><tr><td>Ácido retinoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625</td><td>MSC suplemento de medios de diferenciación</td></tr><tr><td>Inhibidor</td><td>de rocas Tocris</td><td>1254/10</td><td>hPSC suplemento de medios de cultivo</td></tr><tr><td>Roziglitazone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2408</td><td>Suplemento de medios de diferenciación de adipocitos</td></tr><tr><td>StemFlex</td><td>ThermoFisher</td><td>A334901</td><td>hPSC medio de cultivo</td></tr><tr><td>Triton</td><td>Thermo Fisher</td><td>28314</td><td>Reactivo de permeabialización</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>ThermoFisher</td><td>25200072</td><td>Reactivo de disociación</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7942</td><td>Tampón de lavado</td></tr></tbody></table>

diferenciación robusta de ipscs humanas en una población pura de adipocitos para estudiar trastornos asociados a adipocitos

Robust Differentiation of Human iPSCs into a Pure Population of Adipocytes to Study Adipocyte-Associated Disorders

Los avances recientes en la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) han permitido la generación de diferentes tipos de células, incluidos los adipocitos. Sin embargo, los métodos de diferenciación actuales tienen baja eficiencia y no producen una población homogénea de adipocitos. Aquí, evitamos este problema mediante el uso de un método basado en retinoico totalmente trans para producir células madre mesenquimales (MSC) en alto rendimiento. Al regular las vías que gobiernan la proliferación, supervivencia y adhesión celular, nuestra estrategia de diferenciación permite la generación eficiente de cuerpos embrionarios (EB) que se diferencian en una población pura de MSC multipotentes. El alto número de MSCs generadas por este método proporciona una fuente ideal para generar adipocitos. Sin embargo, la heterogeneidad de la muestra resultante de la diferenciación de los adipocitos sigue siendo un desafío. Por lo tanto, utilizamos un método basado en rojo del Nilo para purificar los adipocitos maduros que contienen lípidos mediante FACS. Esta estrategia de clasificación nos permitió establecer una forma confiable de modelar los trastornos metabólicos asociados a los adipocitos utilizando un grupo de adipocitos con heterogeneidad reducida de la muestra y funcionalidad celular mejorada.

Esquema y morfología de las células durante la diferenciación mesenquimal: La diferenciación de iPSCs en MSCs implica varias etapas de desarrollo que abarcan la formación de EB, la diferenciación de MSC y la expansión de MSC (Figura 1). Durante estas etapas de desarrollo, las células adquieren una morfología diversa debido a los diferentes productos químicos estimulantes a los que están sometidas. Al iniciar la diferenciación, las células están en suspensión y se espera que sean redondas, co...

El protocolo permite la generación de una población de adipocitos puros a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). El ácido retinoico se utiliza para diferenciar las iPSC en células madre mesenquimales (MSC) que se utilizan para producir adipocitos. Luego, se utiliza un enfoque de clasificación basado en la tinción de rojo del Nilo para obtener adipocitos puros.

Diferenciación robusta de iPSCs humanas en una población pura de adipocitos para estudiar trastornos asociados a adipocitos

Recent advances in induced pluripotent stem cell (iPSC) technology have allowed the generation of different cell types, including adipocytes. However, the ...

Los enfoques anteriores se basaban en métodos altamente invasivos para obtener células madre mesenquimales in vitro, pero esas células madre mesenquimales tenían la limitación de producir un grupo heterogéneo del 30% con una eficiencia que oscilaba entre el 30 y el 60%. Cuando las iPSCs hayan alcanzado el 80% de confluencia, lavar las células con DPBS y añadir medio de disociación que contenga EDTA. Incubar las células a 37 grados centígrados durante un minuto.Después de un minuto, aspire el reactivo de disociación y coloque las células a 37 grados centígrados durante un minuto adicional. A continuación, retire la placa de la incubadora. Agregue un mililitro de medios StemFlex por pocillo y recoja cuidadosamente las células en un tubo cónico de 15 mililitros.Centrifugar las células. Retire el sobrenadante y vuelva a suspenderlo suavemente en tres mililitros de medios de diferenciación MSC que contengan 10 micromoles de un inhibidor de roca. Mezcle la suspensión celular y distribuya 500 microlitros por pocillo en una placa de fijación ultra baja de 24 pocillos.Luego coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados. Después de 24 horas, para inducir los cuerpos embrionarios alcanzados, recójalos en un tubo de 15 mililitros y deje que se asienten. Después de 15 minutos, retire el sobrenadante y agregue el medio de diferenciación MSC suplementado con 10 ácido retinoico micromolar.Resuspenda suavemente los cuerpos embrionarios y distribuya 500 microlitros por pocillo en la misma placa de fijación ultra baja de 24 pocillos. Luego coloque la placa en la incubadora. Después de 48 horas, recoja los cuerpos embrionarios en un tubo de 15 mililitros y déjelos asentarse durante 15 minutos.A continuación, retire el sobrenadante y agregue el medio de diferenciación MSC suplementado con ácido retinoico micromolar 0.1. Después de resuspender los cuerpos embrionarios, distribuir 500 microlitros por pocillo en la misma placa de 24 pocillos y colocar la placa en la incubadora. Cuarenta y ocho horas después del último tratamiento con ácido retinoico, recolecte los cuerpos embrionarios, retire el sobrenadante y agregue DMEM medio bajo en glucosa sin citoquinas.Resuspenda suavemente y distribuya 500 microlitros de la suspensión celular por pocillo en la misma placa de fijación ultra baja de 24 pocillos, luego incube la placa a 37 grados centígrados. Después de 48 horas, para emplatar los cuerpos embrionarios derivados de iPSC, recolecte los cuerpos embrionarios en un tubo de 15 mililitros, déjelos asentar, luego retire el sobrenadante y vuelva a suspender en dos mililitros de medio de diferenciación MSC fresco. A continuación, transfiera la suspensión a dos pocillos de una placa de seis pocillos recubierta con matriz de membrana basal e incube las células a 37 grados centígrados.Después de cinco días, reemplace el medio gastado con un nuevo medio de diferenciación MSC que contenga 2,5 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento de fibroblastos básico y continúe la diferenciación de MCS durante un máximo de 11 y 15 días. Cuando los cuerpos embrionarios en placas hayan alcanzado el 80 al 90% de confluencia, pasarlos lavándolos con DPBS, agregando tripsina-EDTA e incubando a 37 grados centígrados durante un minuto. Retire la tripsina-EDTA de la placa e incube de nuevo a 37 grados centígrados durante un minuto.A continuación, agregue un mililitro de medios por pozo. Después de tres minutos, recolecte las células usando medios de diferenciación MSC en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue las células. Luego resuspenda las células en un medio de diferenciación MSC que contenga factor de crecimiento de fibroblastos básico y coloque las células en placas recubiertas de matriz de membrana basal en una proporción de uno a tres.Después de que las MSC hayan alcanzado el 90% de confluencia, continúe cultivándolas durante otras 48 horas para permitir que se sometan a un período de detención del crecimiento. Luego retire el medio y lave las células con DBPS. Después del lavado, agregue un medio de diferenciación adipocitaria completa a la placa e incube las células a 37 grados centígrados.Cambie el medio cada dos días durante 14 días. Diferenciar las MSC derivadas de iPSC en adipocitos. Para clasificar los adipocitos usando rojo del Nilo, prepare la solución de trabajo del rojo del Nilo en DMSO como se describe en el texto manuscrito.Antes de su uso, descongele la solución madre y reconstituya en DPBS para alcanzar una concentración de solución de trabajo de 300 nanomolares. En o después del día 14 de diferenciación de adipocitos, deseche el medio de las células y lave con DPBS. Luego agregue la solución de trabajo rojo del Nilo.Cubra el plato e incube las células a 37 grados centígrados. Después de 15 minutos, reemplace la solución roja del Nilo con tripsina-EDTA e incube las células a 37 grados centígrados durante cuatro minutos. Luego recolecte las células usando DMEM que contiene 5% FBS en un tubo cónico de 15 mililitros y centrifugue las células.Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en DPBS a una densidad de 1 millón de células por mililitro. Luego, utilizando el clasificador FACS, aísle las células rojas positivas del Nilo utilizando el canal FL-1. Recolectar las células clasificadas y recultivarlas en medios de diferenciación de adipocitos o proceder a la extracción de ARN seguida de un análisis cuantitativo de los marcadores de diferenciación de adipocitos.Al iniciar la diferenciación, las células chapadas en suspensión son redondas con bordes celulares definidos y son de tamaño pequeño a mediano en diámetro. La viabilidad de los cuerpos embrionarios se observa por el comportamiento de rápida proliferación que da lugar a más MSC. Este comportamiento de rápida proliferación, junto con su morfología peculiar y alargada, se conserva incluso después de pasar las MSC a placas recubiertas de matriz fresca.Una buena diferenciación produce MSC confiables con una eficiencia de expresión superior al 90% de los marcadores de superficie mesenquimales CD73, CD44 y CD90. Además, la evaluación de las células para la ausencia de marcadores de superficie que representan el fenotipo hematopoyético CD14, CD34 y CD19 mostró menos del 1% de eficiencia de expresión, La alta expresión en la distribución citoplasmática de FABP4, un marcador para adipocitos terminalmente diferenciados, indica su madurez de desarrollo. Además, la alta expresión de adiponectina, otro marcador de madurez de los adipocitos, indica que los adipocitos son lo suficientemente funcionales como para someterse al almacenamiento de lípidos y la adipogénesis en respuesta a la señalización de la glucosa.Tras la tinción, el rojo del Nilo se une exclusivamente a los adipocitos maduros que contienen lípidos, lo que lo convierte en una herramienta efectiva para clasificar los adipocitos maduros utilizando citometría de flujo activada por fluorescencia. Las células rojas positivas del Nilo muestran una regulación positiva significativa de los marcadores de maduración en al menos el doble en comparación con las células no clasificadas. Debe ser muy cuidadoso al recolectar células durante la formación del cuerpo embrionario y la disociación de células mesenquimales, ya que eso tendría un gran impacto en la eficiencia de supervivencia posterior a la disociación de las células madre mesenquimales.La población pura de adipocitos obtenida de pacientes portadores de mutaciones puede someterse a la secuenciación funcional y del transcriptoma completo para determinar las vías reguladoras y de señalización afectadas por una mutación particular sin que los datos se vean afectados por la heterogeneidad de la muestra. Esta técnica permitirá la generación escalable de células madre mesenquimales in vitro, eliminando la necesidad de cosecharlas de donantes humanos para diferenciarlas fácilmente en adipocitos, condrocitos y osteocitos para comprender la patogénesis de la enfermedad relacionada con los tejidos.

robust-differentiation-human-ipscs-into-pure-population-adipocytes-to

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Los adipocitos maduros pueden representar una fuente abundante de células madre a través de la desdiferenciación, lo que conduce a una población homogénea de células similares a los fibroblastos. La digestión de la colagenasa se utiliza para aislar los adipocitos maduros de la grasa humana. El objetivo de nuestro protocolo es obtener células grasas multipotentes y desdiferenciadas a partir de adipocitos maduros humanos.

Generación de células madre adiposas Humano a través Desdiferenciación de adipocitos maduros en culturas de techo

Este protocolo describe el aislamiento de células madre derivadas del tejido adiposo de cerdo (pADSC) de tejidos adiposos subcutáneos con examen de multipotencia. Los pADSC multipotentes se utilizan para delinear procesos de diferenciación de adipocitos y estudiar la transdiferenciación en múltiples linajes celulares de mesénquima mesodérmico o linajes adicionales de ectodermo y endodermo para estudios regenerativos.

El aislamiento y la diferenciación de células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo de la especie porcina tejidos adiposos

Este protocolo describe el enfoque técnico para aislar subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos murinos de tejido adiposo blanco intraabdominal (WAT) mediante clasificación celular activada por fluorescencia o separación inmunomagnética de perlas.

Aislamiento de subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos adiposos intraabdominales murinos

Presentamos un método simple para aislar células progenitoras adiposas altamente viables de las almohadillas de grasa epidídmica del ratón usando clasificación celular activada por fluorescencia.

Preparación de células progenitoras adiposas de tejidos adiposos epidídicos del ratón

Este informe describe un protocolo para el aislamiento simultáneo de preadipocytes marrones y blancos primarios de ratones recién nacidos. Las células aisladas se pueden cultivar en cultivo e inducir a diferenciarse en adipocitos blancos y marrones completamente maduros. El método permite la caracterización genética, molecular y funcional de las células de grasa primarias en cultivo.

Aislamiento Y Diferenciación De Preadipocitos Blancos Y Marrones Primarios De Ratones Recién Nacidos

Este protocolo describe el aislamiento de preadipocitos de ratón de la grasa subcutánea, su diferenciación en adipocitos maduros y la inducción de resistencia a la insulina. La acción de la insulina se evalúa mediante la fosforilación/activación de los miembros de la vía de señalización de la insulina a través del western blot. Este método permite la determinación directa de la resistencia/sensibilidad a la insulina en adipocitos primarios.

Adipocitos diferenciados de ratón en cultivo primario: un modelo de resistencia a la insulina

Los preadipocitos se aíslan de la fracción vascular estromal del tejido adiposo marrón interescapular de ratones recién nacidos y se diferencian en células que acumulan gotas de lípidos, expresan marcadores moleculares y muestran la morfología mitocondrial de los adipocitos marrones maduros. Estas células se analizan posteriormente mediante inmunofluorescencia y microscopía electrónica de transmisión.

Diferenciación e imagen de adipocitos marrones de la fracción vascular estromal de tejido adiposo interescapular de ratones recién nacidos

Este protocolo describe el aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo murino para obtener preadipocitos y lograr la diferenciación de los adipocitos in vitro. El uso de un disociador de tejidos para la digestión de la colagenasa reduce la variación experimental y aumenta la reproducibilidad.

Aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal del tejido adiposo blanco murino utilizando un disociador tisular

El tamaño y la fragilidad de los adipocitos maduros han limitado las técnicas y herramientas disponibles para su estudio y aislamiento. En este trabajo se describe un protocolo para el aislamiento de adipocitos murinos maduros, que puede adaptarse fácilmente a diferentes depósitos de adiposo y dietas de ratones.

Aislamiento y cultivo de adipocitos murinos primarios de ratones delgados y obesos

Aquí presentamos un método estándar para aislar de forma eficiente células madre y adipocitos derivados del adiposo, caracterizado por una reducción del &gt; del 90% en el tiempo de procesamiento, alta viabilidad celular y amplia compatibilidad.

Aislamiento eficiente de células madre y adipocitos derivados del adiposo a partir de tejido adiposo porcino

Aprende a diferenciar iPSCs humanas en adipocitos puros mediante ácido retinoico y tinción con Nile red. Este protocolo mejora la eficiencia y pureza para estudiar trastornos metabólicos.

Diferenciación robusta de iPSCs humanas en una población pura de adipocitos para estudiar trastornos asociados a adipocitos

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