Name: QPCR lista para usar para la detección de ADN de Trypanosoma cruzi u otros organismos patógenos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 50 s
Description: Aprende a preparar reacciones de qPCR listas para usar mediante un protocolo de gelificación que reduce el tiempo de preparación y minimiza errores operativos. Este método permite control de calidad visual y almacenamiento prolongado para detección de ADN.

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Los autores desean expresar su agradecimiento a Aline Burda Farias por la asistencia técnica con el horno de vacío, así como a la administración del Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brasil) por permitir el acceso a dicho equipo. Este trabajo fue financiado parcialmente por la subvención CNPq 445954/2020-5.

1. Preparación de soluciones madre y mezcla de gelificación
NOTA: Se prepararán cuatro soluciones madre (400 mg/ml de melezitosa, 400 mg/ml de trehalosa, 0,75 mg/ml de lisina y 200 mg/ml de glucógeno) y se mezclarán de acuerdo con la proporción mostrada en la Tabla 1 para producir la mezcla de gelificación. Aunque el protocolo describe 10 ml de producción de soluciones madre, se puede adaptar para volúmenes más bajos o más altos.
<ol><li>Solución de melezitosa<ol><li>Pese 4 g de melezitosa en un tubo de plástico de 15 ml, agregue 6 ml de agua libre de nucleasa y vórtice a la velocidad máxima del instrumento hasta que el polvo esté solubilizado. NOTA: Se puede agregar más agua para facilitar la solubilización, teniendo cuidado de no exceder el volumen final (ver más abajo).</li>
		<li>Enrasar el volumen final a 10 ml con agua libre de nucleasas. Etiquetar y conservar a 2-8 °C durante un máximo de 6 meses.</li>
	</ol></li>
	<li>Solución de trehalosa<ol><li>Pese 4 g de trehalosa en un tubo de plástico de 15 ml, agregue 6 ml de agua libre de nucleasa y vórtice a la velocidad máxima del instrumento hasta que el polvo esté solubilizado. NOTA: Se puede agregar más agua para facilitar la solubilización, teniendo cuidado de no exceder el volumen final (ver más abajo).</li>
		<li>Enrasar el volumen hasta 10 ml con agua libre de nucleasas y filtrar la solución a través de un filtro de 0,2 μm. Etiquetar y conservar a 2-8 °C durante un máximo de 6 meses.</li>
	</ol></li>
	<li>Solución de glucógeno<ol><li>Pese 2 g de glucógeno en un tubo de plástico de 15 ml, agregue 6 ml de agua libre de nucleasa y haga vórtice a la velocidad máxima del instrumento hasta que el polvo esté solubilizado. NOTA: Se puede agregar más agua para facilitar la solubilización, teniendo cuidado de no exceder el volumen final (ver más abajo).</li>
		<li>Mantener la solución en reposo a 2-8 °C durante 8-12 h porque la solubilización del glucógeno produce muchas burbujas (Figura 1). Enrasar el volumen hasta 10 ml con agua libre de nucleasas. Etiquetar y conservar a 2-8 °C durante un máximo de 6 meses.</li>
	</ol></li>
	<li>Solución de lisina<ol><li>Pese 7,5 mg de lisina en un tubo de plástico de 15 ml, agregue 6 ml de agua libre de nucleasa. Vórtice a la velocidad máxima del instrumento hasta que el polvo esté solubilizado. NOTA: Se puede agregar más agua para facilitar la solubilización, teniendo cuidado de no exceder el volumen final (ver más abajo).</li>
		<li>Enrasar el volumen hasta 10 ml con agua libre de nucleasas y filtrar la solución a través de un filtro de 0,2 μm. Transfiera la solución a un matraz de color ámbar o protéjala de la luz. Etiquete y guárdelo a 2-8 °C grados durante un máximo de 6 meses.</li>
	</ol></li>
	<li>Mezcla de gelificación (GM)<ol><li>En un tubo de plástico de 50 ml, mezclar los volúmenes de soluciones madre de acuerdo con la Tabla 1.</li>
		<li>Mezclar los reactivos por diez inversiones de extremo a extremo del tubo. NOTA: No hay necesidad de un paso de filtración si este paso se realiza en una campana de seguridad de flujo laminar. Si este paso no se realiza en un ambiente limpio, filtrar la solución a través de un filtro de 0,2 μm antes de transferirla a un matraz de color ámbar.</li>
		<li>Transfiera la solución a un matraz de color ámbar o protéjala de la luz. Etiquetar y conservar a 2-8 °C durante un máximo de 3 meses. NOTA: Como paso de control de calidad para preparar la mezcla de gelificación, asegúrese de que los valores de pH, conductividad y densidad medidos estén dentro de los siguientes rangos: pH 5.55-6.66; conductividad 0.630-0.757 mS/cm; y densidad 1.08-1.11 g/cm3. Todas las mediciones deben realizarse a 25 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparación de la mezcla maestra de qPCR para gelificación
NOTA: En este paso, se prepara la mezcla maestra de qPCR para gelificación. Por lo tanto, no se agrega agua a la mezcla, sino que se agrega la mezcla de gelificación (Tabla 2).
<ol><li>Descongele los reactivos en un recipiente refrigerado. Mezclar los reactivos en un tubo de 1,5 ml de acuerdo con la Tabla 2. Aquí se muestra un ejemplo de una reacción con un volumen final de 25 μL que contiene 5 μL de muestra de ADN. NOTA: La muestra de ADN no se agrega a la mezcla en este paso; aquí se utiliza únicamente para calcular los volúmenes finales de cada reactivo de la mezcla maestra de qPCR. Las muestras de ADN deben agregarse justo antes de comenzar la ejecución (consulte el paso 4 a continuación).</li>
</ol>3. Gelificación de los reactivos en los recipientes de reacción
<ol><li>Multiplique adecuadamente los volúmenes que se muestran en la Tabla 2 para la preparación de una tira de ocho tubos o una placa de 96 pocillos.</li>
	<li>Pipet 18,5 μL de la mezcla maestra de gelificación que se muestra en la Tabla 2 en cada pocillo de reacción. NOTA: Este volumen representa los volúmenes de mezcla de oligonucleótidos, tampón de PCR y mezcla de gelificación utilizados para una reacción (según la Tabla 2) y variará según la concentración de los reactivos y el volumen necesario para una reacción. El volumen final en la mezcla maestra de gelificación es diferente del volumen en una mezcla maestra regular porque no se agrega agua.</li>
	<li>Coloque los tubos/placas en el soporte conductor del calor (por ejemplo, aluminio) dentro del horno de vacío. NOTA: El soporte conductor de calor es opcional. El operador debe asegurarse de que la parte inferior de los tubos esté en contacto con el estante del horno de vacío para permitir un equilibrio térmico rápido.</li>
	<li>Coloque una bolsa de arcilla de bentonita por cada dos platos de 96 pocillos. NOTA: Las bolsas de arcilla de bentonita se utilizan para absorber el agua eliminada de la mezcla maestra de gelificación por la presión diferencial ejercida por el vacío. Se encontró que las bolsas de arcilla de bentonita eran innecesarias para menos de dos placas de 96 pocillos.</li>
	<li>Someter los tubos/placa que contiene la mezcla maestra de gelificación a tres ciclos de vacío (30 ± 5 mBar) de 30 min cada uno, alternando con liberación de vacío hasta alcanzar la presión atmosférica (900-930 mBar), a temperatura controlada (30 °C ± 1 °C) (Figura 2). NOTA: El instrumento utiliza software para controlar los parámetros, y un ejemplo del ciclo se muestra en la Figura 2. El usuario debe crear el perfil para la ejecución, indicando los parámetros elegidos.</li>
	<li>Cuando se complete el ciclo, verifique que los tubos/placas estén bien gelificados de los reactivos, asegurándose de que el volumen se reduzca visiblemente (Figura 3) y de que los líquidos no se muevan al golpear los tubos/placas con los dedos. NOTA: Si no se produce gelificación, la solución salpicaría las paredes del tubo cuando se golpean los tubos (Figura 3).</li>
	<li>Sellar y conservar los tubos/placas a 2-8 °C durante 8-12 h antes de su uso.</li>
</ol>4. Uso de una qPCR gelificada
<ol><li>Retire la tira de tubo o la placa del refrigerador y ábrala en una estación de trabajo para la manipulación de muestras. Añadir 15 μL de agua libre de nucleasas a cada recipiente de reacción. NOTA: Se considera que el volumen de reactivos gelificados es de aproximadamente 5 μL. Por lo tanto, junto con el volumen de la muestra de ADN (ver más abajo), el volumen de reacción final es de 25 μL.</li>
	<li>Añadir 5 μL de muestra de ADN. NOTA: Se puede utilizar cualquier plantilla de ADN con calidad de qPCR. En el presente trabajo, el ADN se extrajo de 10 epimastigotesde 8T. cruzi (cepa Dm28c) y se diluyó en serie en una proporción de 1:10 utilizando tampón TE.</li>
	<li>Selle los tubos/placas y diríjase al equipo de su elección. Ejecute el experimento y proceda al análisis regular de datos.</li>
</ol>

<ol><li>Lewinsohn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carlos+Chagas+%281879-1934%29%3A+the+discovery+of+Trypanosoma+cruzi+and+of+American+trypanosomiasis+%28foot-notes+to+the+history+of+Chagas%27s+disease%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease).</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).</li>
<li>Bern, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+treatment+of+Chagas+disease+in+the+United+States%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review.</a> The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).</li>
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<li>Kamau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample-ready+multiplex+qPCR+assay+for+detection+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria.</a> Malaria Journal. 13, 158(2014).</li>
<li>Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+and+further+challenges+in+lyophilization%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Recent advances and further challenges in lyophilization.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).</li>
<li>Rosado, P. M. F. S., López, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+preparing+stabilised+reaction+mixtures%2C+which+are+totally+or+partially+dried%2C+comprising+at+least+one+enzyme%2C+reaction+mixtures+and+kits+containing+said+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22PubChem%22%5BJournal%5D)">Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures.</a> PubChem. , (2002).</li>
<li>Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+a+fast+and+easy+sample-to-answer+protocol+for+tuberculosis+screening+in+point-of-care+settings%3A+A+proof+of+concept+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study.</a> PLoS One. 15 (12), 0242408(2020).</li>
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<li>Iglesias, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+a+new+gelled+nested+PCR+test+for+the+diagnosis+of+imported+malaria%3A+comparison+with+microscopy%2C+rapid+diagnostic+test%2C+and+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+Research%22%5BJournal%5D)">Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR.</a> Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).</li>
<li>Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+diagnostics+for+Chagas+disease%3A+up+to+date+and+novel+methodologies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Los últimos años han puesto de relieve la necesidad de encontrar tecnologías más sensibles y específicas para ayudar a diagnosticar enfermedades tropicales y desatendidas. Aunque son importantes para el control epidemiológico, las pruebas parasitológicas (microscopía óptica) y serológicas tienen limitaciones, especialmente con respecto a la sensibilidad y la aplicabilidad en el punto de atención. Las técnicas de amplificación de ADN como la PCR, la amplificación isotérmica y las variaciones respectivas se han utilizado d...

La enfermedad de Chagas fue descubierta a principios delsiglo XX en las regiones rurales de Brasil, donde la pobreza era generalizada 1,2. Incluso hoy en día, la enfermedad sigue estando conectada a los determinantes sociales y económicos de la salud en las Américas. La enfermedad de Chagas es bifásica, comprendiendo una fase aguda y otra crónica. Es causada por infección por el parásito Trypanosoma cruzi, siendo transmitida por insectos vectores, transfusiones de sangre por vía congénita o ingestión oral de alimentos contaminados 3,4.
El diagnóstico de la enfermedad de Chagas puede realizarse mediante la observación de síntomas clínicos (especialmente el signo de Gaña), microscopía de frotis de sangre, serología y pruebas moleculares como PCR en tiempo real (qPCR) o amplificación isotérmica 4,5,6,7,8,9. Los síntomas clínicos y la microscopía de frotis de sangre se utilizan en casos sospechosos de infecciones agudas, mientras que la búsqueda de anticuerpos se utiliza como una herramienta de detección en pacientes asintomáticos. Debido a su sensibilidad y especificidad, se ha sugerido que la qPCR sea utilizada como una herramienta de monitoreo para pacientes crónicos, para pacientes agudos sometidos a tratamiento que mide la carga del parásito en la sangre y como un marcador sustituto de fracaso terapéutico 6,8,10,11,12 . Aunque más sensible y específica que las pruebas disponibles actualmente, la qPCR se evita efectivamente de ser conocida como herramientas de diagnóstico en regiones desfavorecidas de todo el mundo debido al requisito de temperaturas de congelación para el transporte y almacenamiento13,14,15.
Para sortear este obstáculo, se han explorado técnicas de conservación como la liofilización y la gelificación16,17. Mientras que la liofilización proporciona conservación durante años, requiere reactivos especialmente fabricados sin la presencia de glicerol, que es comúnmente utilizado para la estabilización/conservación de enzimas18. Si bien se ha demostrado que la gelificación proporciona conservación durante meses, permite el uso de reactivos regulares19. La solución de gelificación comprende cuatro componentes, cada uno con funciones específicas en el proceso: los azúcares trehalosa y melezitosa protegen las biomoléculas durante el proceso de desecación al reducir las moléculas de agua libre en la solución, el glucógeno produce una matriz protectora más amplia y el aminoácido lisina se utiliza como eliminador de radicales libres para inhibir las reacciones oxidantes entre el carboxilo de la biomolécula, grupos amino y fosfato. Estos componentes definen una mezcla sol-gel que evita la pérdida de la estructura terciaria o cuaternaria durante el proceso de desecación, ayudando así a mantener la actividad de las biomoléculas tras la rehidratación19. Una vez estabilizadas dentro de los tubos de reacción, las reacciones pueden almacenarse durante unos meses a 2-8 °C o unas semanas a 21-23 °C en lugar de los -20 °C habituales. Este enfoque ya ha sido incorporado en pruebas diseñadas para ayudar a diagnosticar enfermedades como la enfermedad de Chagas, la malaria, la leishmaniasis, la tuberculosis y la ciclosporiasis13,14,15,20.
El presente trabajo describe todos los pasos para preparar las soluciones requeridas para el procedimiento de gelificación, las trampas en el proceso y el aspecto final esperado de una qPCR gelificada lista para usar dentro de tiras de ocho tubos. El mismo protocolo se puede adaptar para tubos individuales o placas de 96 pocillos. Finalmente, la detección de ADN de T. cruzi se mostrará como una ejecución de control.

<table><tbody><tr><td>Bolsas de arcilla de bentonita (activadas)</td><td>Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, España)</td><td>026157/STD</td><td>No debe confundirse con los paquetes de gel de sílice</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Amersham Bioscience</td><td>Cat# US16445</td><td></td></tr><tr><td>Lysine</td><td>Acros Organic Cat</td><td># 365650250</td><td></td></tr><tr><td>Melezitoze</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 63620</td><td></td></tr><tr><td>Agua</td> <td>sin nucleasasproveedor</td><td></td><td></td>preferido</tr><tr><td>Oligonucleótidos</td><td>proveedor preferido PCR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mastermix</td><td>proveedor preferido o Instituto de Biologia Molecular do Paran&aacute; (IBMP, Curitiba, Brasil)</td><td>Kit</td><td></td>NAT</tr><tr><td>de Chagas Termociclador de PCR</td><td>software</td><td></td><td></td>de proveedor preferido</tr><tr><td>para horno de vacío</td><td>Memmert Gmbh</td><td>Celsius v10.0</td><td></td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# T9531</td><td></td></tr><tr><td>Trypanosoma cruzi ADN</td><td>de parásitos cultivados internamente, o comprado a proveedores acreditados como ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horno de vacío</td><td>Memmert Gmbh</td><td>VO-400</td><td></td></tr></tbody></table>

qpcr lista para usar para la detección de adn de trypanosoma cruzi u otros organismos patógenos

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

La PCR en tiempo real (qPCR) es una técnica notablemente sensible y precisa que permite amplificar cantidades diminutas de objetivos de ácido nucleico a partir de una multitud de muestras. Se ha utilizado ampliamente en muchas áreas de investigación y ha logrado una aplicación industrial en campos como el diagnóstico humano y la selección de rasgos en cultivos de organismos genéticamente modificados (OGM). Sin embargo, la qPCR no es una técnica a prueba de errores. La mezcla de todos los reactivos en una sola mezcla maestra distribuida posteriormente en 96 pocillos de una placa de qPCR regular podría dar lugar a errores del operador, como la mezcla incorrecta de reactivos o la dispensación inexacta en los pozos. Aquí, se presenta una técnica llamada gelificación, mediante la cual la mayor parte del agua presente en la mezcla maestra es sustituida por reactivos que forman una mezcla sol-gel cuando se somete al vacío. Como resultado, los reactivos de qPCR se conservan eficazmente durante algunas semanas a temperatura ambiente o unos pocos meses a 2-8 oC. Los detalles de la preparación de cada solución se muestran aquí junto con el aspecto esperado de una reacción gelificada diseñada para detectar ADN satélite de T. cruzi (satDNA). Se puede aplicar un procedimiento similar para detectar otros organismos. Iniciar una serie de qPCR gelificada es tan simple como sacar la placa del refrigerador, agregar las muestras a sus respectivos pocillos y comenzar la corrida, disminuyendo así el tiempo de configuración de una reacción de placa completa al tiempo que lleva cargar las muestras. Además, las reacciones de PCR gelificadas se pueden producir y controlar para determinar la calidad en lotes, ahorrando tiempo y evitando errores comunes del operador mientras se ejecutan las reacciones de PCR de rutina.

Tres de los reactivos que forman la mezcla de gelificación se solubilizan fácilmente en vórtices vigorosos. Sin embargo, el glucógeno requiere un vórtice cuidadoso para garantizar que el polvo haya sido completamente solubilizado. Desafortunadamente, el vórtice vigoroso produce muchas burbujas, lo que dificulta determinar el volumen real de la solución (Figura 1A-B). Por lo tanto, es esencial dejar reposar la solución de glucógeno en el refrigerador hasta qu...

El presente trabajo describe los pasos para producir qPCR lista para usar para la detección de ADN de T. cruzi que puede precargarse en el recipiente de reacción y almacenarse en el refrigerador durante varios meses.

QPCR lista para usar para la detección de ADN de Trypanosoma cruzi u otros organismos patógenos

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...

El protocolo de gelificación produce reacciones de qPCR listas para usar que disminuyen el tiempo y los pasos necesarios para iniciar una carrera. Este protocolo permite que las reacciones de qPCR se produzcan y controlen para determinar la calidad y grandes cantidades a la vez, disminuyendo las posibilidades de error del operador durante los cálculos de recetas o la alícuota en pozos. Este método se puede aplicar a cualquier qPCR que ya esté totalmente optimizada en el formato congelado convencional.La demostración visual de este método es importante porque dos de los principales pasos de control de calidad son visuales. Para preparar la solución de melezitosa, pese cuatro gramos de melezitosa en un tubo de plástico de 15 mililitros, agregue seis mililitros de agua libre de nucleasa y vórtice a velocidad máxima hasta que el polvo esté solubilizado. Haga el volumen final a 10 mililitros con agua libre de nucleasa, luego etiquete y almacene la solución a dos a ocho grados centígrados durante un máximo de seis meses.Para preparar la solución de trehalosa, pese cuatro gramos de trehalosa en un tubo de plástico de 15 mililitros, agregue seis mililitros de agua libre de nucleasa y vórti

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

En este video, demostramos la técnica de PCR digital dúplex (ddPCR), una modificación de la técnica de PCR tradicional que es útil para detectar dos marcadores genéticos diferentes simultáneamente. Una sola reacción de PCR se divide en gotas emulsionadas del tamaño de un nanolitro que se amplifican de forma independiente, y la detección de señales de amplificación de fluorescencia de diferentes colores a partir de la fracción de gotas se utiliza para calcular la concentración inicial de las...

PCR digital dúplex para la cuantificación simultánea de marcadores genéticos duales

Este protocolo describe la detección por qPCR de citomegalovirus en tejido de biopsia fijado en formol e incluido en parafina, que es rápido, sensible, específico y útil para interpretar patrones equívocos de tinción de hematoxilina y eosina o inmunohistoquímicos.

qPCR es un método sensible y rápido para la detección de ADN de citomegalovirus en fija en formol, biopsia de tejido embebido en parafina

Provided es un protocolo para desarrollar un ensayo de amplificación de polimerasa recombinasa en tiempo real para cuantificar la concentración inicial de muestras de ADN utilizando un termociclador o un microscopio y calentador de etapa. También se describe el desarrollo de un control positivo interno. Se proporcionan scripts para procesar datos de fluorescencia sin procesar en tiempo real.

Desarrollo de una polimerasa de amplificación ensayo cuantitativo recombinasa con un control positivo interno

La adición de una etiqueta a una proteína es una forma poderosa de obtener información sobre su función. Aquí, describimos un protocolo para marcar endógenamente cientos de proteínas de Trypanosoma brucei en paralelo, de modo que se pueda lograr el marcaje a escala del genoma.

De Alto Rendimiento de genes de marcado en las<em&gt; Trypanosoma brucei</em

El agente Trypanosoma cruzi enfermedad de Chagas produce infecciones asintomáticas de larga duración que convertirse abruptamente en patología clínicamente reconocida. El siguiente protocolo de investigación describe un estudio epidemiológico de corto plazo basado en la familia para desentrañar la infección de T. cruzi transmitida sexual de los padres a la progenie.

Transmisión sexual de tripanosomas americanos de machos y hembras a compañeros de ingenua

Describimos un ensayo colorimétrico de alto rendimiento que mide la actividad de la β-galactosidasa en tres etapas del ciclo de vida de Trypanosoma cruzi, el agente causal de la enfermedad de Chagas. Este ensayo se puede utilizar para identificar compuestos tripanocidas de una manera fácil, rápida y reproducible.

In vitro Detección de drogas contra todas las etapas del ciclo de vida de Trypanosoma cruzi utilizando parásitos que expresan β-galactosidasa

Este protocolo describe los pasos para generar un modelo 3D de distribución de metabolitos durante la infección por tripanosomátidos, incluida la recolección de muestras, la extracción de metabolitos, una descripción general de la cromatografía líquida-adquisición de datos de espectrometría de masas en tándem, generación de modelos 3D y, finalmente, visualización de datos.

Enfoques de cartografía química para estudiar la infección por tripanosomátidos

Para facilitar la detección rápida y precisa de Acinetobacter baumannii, presentamos un protocolo que emplea la amplificación de la polimerasa recombinasa (RPA) junto con la endonucleasa LbaCas12a para identificar infecciones por A. baumannii .

Detección rápida y específica de infecciones por Acinetobacter baumannii mediante un sistema de amplificación de polimerasa recombinasa/Cas12A

Aquí, describimos un procedimiento simple y rápido para detectar ADN de patógenos de abejas, como Lotmaria passim y Nosema ceranae, utilizando una lisis celular lista para la amplificación, amplificación de polimerasa recombinasa y ensayos CRISPR/Cas12a.

Detección in situ de ADN de parásitos tripanosomátidos y Nosema ceranae mediante lisis alcalina acoplada al sistema RPA/CRISPR/Cas12a

Aquí se demuestra cómo se puede usar el Ensayo de Ligación de Proximidad in situ (PLA) para detectar y visualizar las interacciones directas proteína-proteína entre ATM y p53 en cultivos de células en suspensión expuestos al estrés genotóxico.

Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

Aprende a preparar reacciones de qPCR listas para usar mediante un protocolo de gelificación que reduce el tiempo de preparación y minimiza errores operativos. Este método permite control de calidad visual y almacenamiento prolongado para detección de ADN.

QPCR lista para usar para la detección de ADN de Trypanosoma cruzi u otros organismos patógenos

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