Name: Investigación espectrométrica de masas multifacética de neuropéptidos en Callinectes sapidus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Aprende espectrometría de masas para caracterizar neuropéptidos en Callinectes sapidus. Este protocolo optimizado permite secuenciar, cuantificar y localizar péptidos endógenos con alta sensibilidad.

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Esta investigación fue apoyada por la Fundación Nacional de Ciencias (CHE-1710140 y CHE-2108223) y los Institutos Nacionales de Salud (NIH) a través de la subvención R01DK071801. A.P. fue apoyado en parte por la Beca de Capacitación de Interfaz Química-Biología de los NIH (T32 GM008505). N.V.Q. fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud, bajo el Premio del Servicio Nacional de Investigación Ruth L. Kirschstein del Instituto Nacional de Corazón, Pulmón y Sangre al Centro de Investigación Cardiovascular de la Universidad de Wisconsin-Madison (T32 HL007936). L.L. desea reconocer las subvenciones de los NIH R56 MH110215, S10RR029531 y S10OD025084, así como el apoyo financiero de una Cátedra vilas distinguished Achievement y una cátedra Charles Melbourne Johnson con fondos proporcionados por la Fundación de Investigación de Ex Alumnos de Wisconsin y la Facultad de Farmacia de la Universidad de Wisconsin-Madison.

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Los autores no tienen nada que revelar.

La identificación, cuantificación y localización precisas de los neuropéptidos y péptidos endógenos que se encuentran en el sistema nervioso son cruciales para comprender su función23,24. La espectrometría de masas es una técnica poderosa que puede permitir que todo esto se logre, incluso en organismos sin un genoma completamente secuenciado. Se demuestra la capacidad de este protocolo para detectar, cuantificar y localizar neuropéptidos a partir de tejido recole...

El sistema nervioso es complejo y requiere una red de neuronas para transmitir señales a través de un organismo. El sistema nervioso coordina la información sensorial y la respuesta biológica. Las interacciones intrincadas y enrevesadas involucradas en la transmisión de señales requieren muchas moléculas de señalización diferentes, como neurotransmisores, esteroides y neuropéptidos. Como los neuropéptidos son las moléculas de señalización más diversas y potentes que desempeñan un papel clave en la activación de las respuestas fisiológicas al estrés y otros estímulos, es de interés determinar su papel específico en estos procesos fisiológicos. La función neuropeptídica está relacionada con su estructura de aminoácidos, que determina la movilidad, la interacción del receptor y la afinidad1. Técnicas como la histoquímica, que es importante porque los neuropéptidos se pueden sintetizar, almacenar y liberar en diferentes regiones del tejido, y la electrofisiología se han empleado para investigar la estructura y función de los neuropéptidos 2,3,4, pero estos métodos están limitados por el rendimiento y la especificidad para resolver la vasta diversidad de secuencias de los neuropéptidos.
La espectrometría de masas (EM) permite el análisis de alto rendimiento de la estructura y abundancia de neuropéptidos. Esto se puede realizar a través de diferentes técnicas de EM, más comúnmente cromatografía líquida-ionización electrospray MS (LC-ESI-MS)5 y MS de desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI-MS)6. Utilizando mediciones de masa de alta precisión y fragmentación de EM, la EM proporciona la capacidad de asignar la secuencia de aminoácidos y el estado de modificación post-traduccional (PTM) a neuropéptidos de mezclas complejas sin conocimiento a priori para ayudar a determinar su función 7,8. Además de la información cualitativa, la EM permite la información cuantitativa de neuropéptidos a través de la cuantificación sin etiquetas (LFQ) o métodos basados en etiquetas, como el etiquetado isotópico o isobárico9. Las principales ventajas de LFQ incluyen su simplicidad, bajo costo de análisis y disminución de los pasos de preparación de la muestra que pueden minimizar la pérdida de muestras. Sin embargo, las desventajas de LFQ incluyen un aumento de los costos de tiempo del instrumento, ya que requiere múltiples réplicas técnicas para abordar el error cuantitativo de la variabilidad de ejecución a ejecución. Esto también conduce a una disminución de la capacidad de cuantificar con precisión pequeñas variaciones. Los métodos basados en etiquetas se someten a una variación menos sistemática, ya que múltiples muestras pueden etiquetarse diferencialmente utilizando una variedad de isótopos estables, combinados en una muestra y analizados a través de espectrometría de masas simultáneamente. Esto también aumenta el rendimiento, aunque las etiquetas isotópicas pueden llevar mucho tiempo y ser costosas de sintetizar o comprar. La complejidad espectral de los espectros de masas de exploración completa (MS1) también aumenta a medida que aumenta la multiplexación, lo que disminuye el número de neuropéptidos únicos capaces de fragmentarse y, por lo tanto, identificarse. Por el contrario, el etiquetado isobárico no aumenta la complejidad espectral a nivel de MS1, aunque introduce desafíos para los analitos de baja abundancia, como los neuropéptidos. Como la cuantificación isobárica se realiza a nivel de espectros de masas de iones de fragmento (MS2), los neuropéptidos de baja abundancia pueden no poder cuantificarse, ya que se pueden seleccionar componentes de matriz más abundantes para la fragmentación y los seleccionados pueden no tener una abundancia lo suficientemente alta como para ser cuantificados. Con el etiquetado isotópico, la cuantificación se puede realizar en cada péptido identificado.
Además de la identificación y cuantificación, la información de localización puede ser obtenida por MS a través de imágenes MALDI-MS (MALDI-MSI)10. Al rasterizar un láser a través de una superficie de muestra, los espectros MS se pueden compilar en una imagen de mapa de calor para cada valor m / z . El mapeo de la intensidad de la señal neuropeptídica transitoria en diferentes regiones a través de las condiciones puede proporcionar información valiosa para la determinación de la función11. La localización de neuropéptidos es especialmente importante porque la función del neuropéptido puede diferir dependiendo de la ubicación12.
Los neuropéptidos se encuentran en menor abundancia in vivo que otras moléculas de señalización, como los neurotransmisores, y por lo tanto requieren métodos sensibles para la detección13. Esto se puede lograr mediante la eliminación de componentes de la matriz de mayor abundancia, como los lípidos11,14. Es necesario realizar consideraciones adicionales para el análisis de neuropéptidos en comparación con los flujos de trabajo proteómicos comunes, principalmente porque la mayoría de los análisis neuropeptidómicos omiten la digestión enzimática. Esto limita las opciones de software para el análisis de datos de neuropéptidos, ya que la mayoría se construyeron con algoritmos basados en datos de proteómica y coincidencias de proteínas informadas por la detección de péptidos. Sin embargo, muchos programas como PEAKS15 son más adecuados para el análisis de neuropéptidos debido a sus capacidades de secuenciación de novo. Se deben considerar varios factores para el análisis de neuropéptidos desde el método de extracción hasta el análisis de datos de EM.
Los protocolos descritos aquí incluyen métodos para la preparación de muestras y el etiquetado isotópico de dimetilo, adquisición de datos y análisis de datos de neuropéptidos por LC-ESI-MS, MALDI-MS y MALDI-MSI. A través de resultados representativos de varios experimentos, se demuestra la utilidad y la capacidad de estos métodos para identificar, cuantificar y localizar neuropéptidos de cangrejos azules, Callinectes sapidus. Para comprender mejor el sistema nervioso, los sistemas modelo se utilizan comúnmente. Muchos organismos no tienen un genoma completamente secuenciado disponible, lo que impide el descubrimiento integral de neuropéptidos a nivel de péptidos. Con el fin de mitigar este desafío, se incluye un protocolo para la identificación de nuevos neuropéptidos y la minería de transcriptomas para generar bases de datos para organismos sin información completa del genoma. Todos los protocolos presentados aquí pueden optimizarse para muestras de neuropéptidos de cualquier especie, así como aplicarse para el análisis de cualquier péptido endógeno.

<table><tbody><tr><td><Matriz > productos químicos, reactivos y consumibles</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,5-dihidroxibenzoico (DHB)</td><td>Supelco</td><td>39319</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38S-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo Optima Grado LC/MS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A955-500</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Borane piridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179752</td><td></td></tr><tr><td>Bruker mezcla de calibración de péptidos</td><td>Bruker Daltonics</td><td>NC9846988</td> Capillary Polymicro 1068150019 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>para hacer columna de nanoflujo (75 &micro; m diámetro interior x 360 y micro; m diámetro exterior)</td></tr><tr><td>Copa de criostato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6032</td><td>cualquier copa o molde debería funcionar</td></tr><tr><td>&nbsp; Tubos de microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>30108434</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído - D2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492620</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico Optima LC/MS grado</td><td>Fisher Chemical</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Difco</td><td>214340</td><td>lugar en 37 &deg; C Baño de agua para derretir</td></tr><tr><td>Bolígrafo de barrera hidrofóbica</td><td>Vector Labs</td><td>15553953</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos de vidrio recubiertos de óxido de indio y estaño (ITO)</td> Delta <td>Technologies</td><td>CB-90IN-S107</td><td>25 mm x 75 mm x 0,8 mm (ancho x largo x grosor)</td></tr><tr><td>Viales LC-MS</td><td>Thermo</td><td>TFMSCERT5000-30LVW</td><td></td></tr><tr><td>Metanol Optima Grado LC/MS</td><td>Fisher Chemical</td><td>A456-500</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td>Película hidrofóbica</td></tr><tr><td>Tiras indicadoras de pH</td><td>Supelco</td><td>109450</td><td></td></tr><tr><td>Cúmulos de fósforo rojo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>343242</td><td></td></tr><tr><td>Fase reversa C18 Material</td><td>Aguas</td><td>186002350</td><td>envasado manualmente en columna de nanoflujo</td></tr><tr><td>Bolígrafo Wite-out</td><td>BIC</td><td>150810</td><td></td></tr><tr><td>ZipTip</td><td>Millipore</td><td>Z720070</td><td></td></tr><tr><td>Instruments and ToolsSistema automático de</td> pulverización de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>matriz- Centrífuga M5</td><td>HTX Technologies, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>05-401-205</td><td></td></tr><tr><td>Criostato- HM 550</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>956564A</td><td></td></tr><tr><td>2088701</td><td></td> de <td>Drierita</td><td>Desecante</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>WPI</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>MALDI placa de objetivo de acero inoxidable</td><td>Bruker Daltonics</td><td>8280781</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Lite XLS</td><td>Rainin</td><td>17014391</td><td>200 &micro; L</td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Híbrido Cuadrupolo-Orbitrap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td><td></td></tr><tr><td>RapifleX MALDI-TOF/TOF</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac - SVC100</td><td>Savant</td><td>SVC-100D</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador ultrasónico</td><td>Bransonic</td><td>2510R-MTH</td><td>para sonicación</td></tr><tr><td>Homogeneizador ultrasónico</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120110</td><td>Interruptor sónico FB120 con sonda CL-18</td></tr><tr><td>Bomba de vacío - Alcatel 2008 A</td><td>Ideal Vacuum Products</td><td>P10976</td><td>presión final = 1 x 10-4 Mezclador</td></tr> de <tr><td>vórtice</td> Torr <td>Corning</td><td>6775</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua (37C) - Isotemp 110</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-460-10</td><td></td></tr><tr><td>Data Analysis Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expasy</td><td>https://web.expasy.org/translate/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>FlexAnalysis</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlexControl</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlexImaging</td><td>Bruker Daltonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEAKS Studio</td><td>Bioinformatics Solutions, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SCiLS Lab</td><td>https://scils.de/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>SignalP 5.0</td><td>https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tBLASTn</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMAS=tblastn& PAGE_ TIPO=BlastSearch& SHOW_ DEFAULTS=on& LINK_LOC = casa</td><td></td><td></td> de explosión</tr></tbody></table>

investigación espectrométrica de masas multifacética de neuropéptidos en callinectes sapidus

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Los neuropéptidos son moléculas de señalización que regulan casi todos los procesos fisiológicos y conductuales, como el desarrollo, la reproducción, la ingesta de alimentos y la respuesta a los factores estresantes externos. Sin embargo, los mecanismos bioquímicos y el complemento completo de los neuropéptidos y sus funciones funcionales siguen siendo poco conocidos. La caracterización de estos péptidos endógenos se ve obstaculizada por la inmensa diversidad dentro de esta clase de moléculas de señalización. Además, los neuropéptidos son bioactivos en concentraciones 100x - 1000x más bajas que las de los neurotransmisores y son propensos a la degradación enzimática después de la liberación sináptica. La espectrometría de masas (EM) es una herramienta analítica altamente sensible que puede identificar, cuantificar y localizar analitos sin un conocimiento exhaustivo a priori . Es muy adecuado para perfilar neuropéptidos a nivel mundial y ayudar en el descubrimiento de nuevos péptidos. Debido a la baja abundancia y la alta diversidad química de esta clase de péptidos, se han adaptado varios métodos de preparación de muestras, parámetros de adquisición de EM y estrategias de análisis de datos a partir de técnicas proteómicas para permitir una caracterización óptima de neuropéptidos. Aquí, se describen métodos para aislar neuropéptidos de tejidos biológicos complejos para la caracterización de secuencias, cuantificación y localización mediante cromatografía líquida (LC)-MS y desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI)-MS. Se incluye un protocolo para preparar una base de datos de neuropéptidos a partir del cangrejo azul, Callinectes sapidus, un organismo sin información genómica completa. Estos flujos de trabajo se pueden adaptar para estudiar otras clases de péptidos endógenos en diferentes especies utilizando una variedad de instrumentos.

El flujo de trabajo para la preparación de muestras y el análisis de EM se muestra en la Figura 1. Después de la disección del tejido neuronal, se realiza la homogeneización, extracción y desalinización para purificar muestras de neuropéptidos. Si se desea una cuantificación isotópica basada en etiquetas, las muestras se etiquetan y desalan una vez más. La muestra resultante se analiza a través de LC-MS/MS para la identificación y cuantificación de neuropéptidos.
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La caracterización espectrométrica de masas de neuropéptidos proporciona información de secuencia, cuantificación y localización. Este flujo de trabajo optimizado no solo es útil para estudios de neuropéptidos, sino también para otros péptidos endógenos. Los protocolos proporcionados aquí describen la preparación de muestras, la adquisición de EM, el análisis de EM y la generación de neuropéptidos en bases de datos utilizando LC-ESI-MS, maldi-MS spotting e imágenes MALDI-MS.

Investigación espectrométrica de masas multifacética de neuropéptidos en Callinectes sapidus

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and ...

El análisis de péptidos endógenos, que son más pequeños que la mayoría de las proteínas, pero más grandes que muchos péptidos digeridos es un campo poco examinado. Este protocolo aborda el scap en flujos de trabajo basados en espectrometría de masas. La espectrometría de masas es altamente sensible y se puede utilizar para atacar neuropéptidos específicos de interés o puede capturar y detectar una variedad de neuropéptidos dentro de una muestra.La cuantificación y localización de la expresión de neuropéptidos por espectrometría de masas puede conducir al desarrollo de terapias peptídicas y al descubrimiento de biomarcadores de neuropéptidos para diversas enfermedades. Para comenzar la extracción de neuropéptidos, recolecte tejido cerebral del crustáceo y, utilizando fórceps, coloque inmediatamente un tejido cada uno en un tubo de 0,6 mililitros que contenga 20 microlitros de metanol acidificado. Añadir 150 microlitros de metanol acidificado a la muestra.Establezca el tiempo total del paciente con Sonic en 24 segundos, el tiempo de pulso en ocho segundos. Pausa el tiempo a 15 segundos y la amplitud al 50% en un homogeneizador ultrasónico y homogeneiza las muestras en hielo. Centrifugar la muestra a cuatro grados Centígrados a 20.000 GS durante 20 minutos.Con una pipeta se transfiere el sobrenadante a un tubo y se seca en un concentrador de vacío a aproximadamente 35 grados centígrados. Para la desalinización reconstituir la muestra de tejido extraída en 20 microlitros de ácido fórmico al 0,1%. Vórtice la solución y sonice en un baño de agua a temperatura ambiente durante un minuto.Aplique 0,5 microlitros de muestra a una tira de pH para confirmar que el pH es inferior a cuatro. Centrifugar a cuatro grados Centígrados y 20.000 GS durante 30 segundos. Preparar el lavado de equilibrio humectante en soluciones de ilusión.Obtenga una punta desaladora de 10 microlitros con resina C18. Coloque la punta de desalinización en una pipeta de 20 microlitros que se ajuste a 15 microlitros. Aspire la punta tres veces con solución humectante y tres veces con solución de colaboración equi.Aspirar en la muestra 10 veces seguido de lavar tres veces en solución de lavado desechando cada lavado. Elute aspirando 10 veces en cada una de las soluciones de ilusión con el fin de aumentar el acetonitrilo. Secar los neuropéptidos aludidos en un concentrador de vacío.Reconstituir los neuropéptidos desalados secos en cinco microlitros de ácido fórmico al 0,1%. Vórtice la solución y sonicarla en un baño de agua a temperatura ambiente durante un minuto. Centrifugación breve en 2000 GS. Para detectar neuropéptidos y tejidos de la corteza, pipetee una gota de muestra de tres microlitros en una película hidrofóbica.Pipetee tres microlitros de matriz DHB directamente sobre la gota de muestra. Mezcle las soluciones canalizando hacia arriba y hacia abajo. Pipetear un microlitro de la mezcla de muestra y matriz en un pozo de la placa objetivo de acero inoxidable MALDI y usar la punta de la pipeta para extender cada mezcla a los bordes del pozo de muestra.Detecte un microlitro de calibre uno a uno y mezcla de matriz en un pozo cerca de la muestra. Inserte la placa objetivo que contiene puntos de muestra secos en el instrumento de tiempo de vuelo en tándem MALDI. Con la matriz DHB, ajuste la potencia del láser al 95%, seleccione la ganancia óptima automática del detector y el modo inteligente de movimiento del portador de muestras completas.Adquiera MS Spectra en el rango de 200 a 3, 200 M sobre Z y agregue múltiples espectros de cada punto juntos para aumentar la relación entre la señal del neuropéptido y el ruido. Llene media taza de criostato con gelatina y deje que se solidifique a temperatura ambiente. Mantenga caliente la gelatina líquida sobrante en un baño de agua de 37 grados centígrados.Recoja el tejido neuronal deseado del animal y use fórceps para sumergir inmediatamente el tejido en un tubo de 0,6 mililitros que contiene agua desionizada durante un segundo. Coloque el tejido sobre la gelatina sólida y llene el resto de la taza de criostato con gelatina líquida. Use fórceps para colocar el tejido.Coloque la copa de criostato sobre una superficie plana y congele con hielo seco. Para la preparación de la sección, separe la muestra incrustada de gelatina del molde de criostato cortando el molde. Monte el tejido incrustado en un mandril de criostato pipeteando una gota de un mililitro de agua desionizada sobre el mandril e inmediatamente presionando el tejido incrustado sobre la gota.Una vez congelada la pipeta, más agua desionizada alrededor del tejido para asegurarlo aún más al mandril. Seccionar el tejido a un grosor aproximado de una célula. Monte cada sección con el pulgar en un portaobjetos de vidrio recubierto de óxido de indio y estaño colocando un lado de la diapositiva cerca de la sección y colocando un dedo en el otro lado de la diapositiva para calentar lentamente el vidrio y permitir que la sección se pegue a la diapositiva.Exportar de Novo sólo péptidos. CSV de picos con un puntaje de confianza local promedio mayor o igual a 75. Busque en la lista de péptidos motivos de secuencia conocidos indicativos de neuropéptidos pertenecientes a familias específicas de neuropéptidos.Elija una secuencia conocida de aminoácidos de la hormona pre-pro de interés y use TB blast N para buscar la secuencia de hormonas pre-pro de consulta en una base de datos. Seleccione el organismo objetivo y cambie los parámetros del algoritmo de umbral de espera a 1000 para incluir alineaciones de puntuación baja. Ejecute el programa blast y luego verifique los resultados para obtener puntajes de homología altos entre las secuencias de consulta y de sujeto que producen alineaciones significativas.Guarde el archivo FASTA que contiene la secuencia de nucleótidos. Traduzca la secuencia de nucleótidos de la hormona pre-pro en secuencias de péptidos de la hormona pre-pro utilizando la herramienta de traducción Expasy. Para callinectes sapidus seleccione invertebrado mitocondrial para el código genético y ejecute la herramienta.Verifique la secuencia del péptido de señal y los sitios de escisión de la hormona pro en las secuencias de péptidos utilizando la señal P.Este es un espectro de fragmentación de un neuropéptido identificado con una cobertura de secuencia del 100% en un error de masa de fragmento bajo con un límite máximo de 0.02 Dalton. Aquí hay un espectro de un neuropéptido también identificado con una cobertura de secuencia del 100%, pero con un bajo número de iones de fragmento, por lo tanto, la confianza de la identificación es baja. Estos son los cromatogramas iónicos extraídos para un solo neuropéptido que se identificó en dos tiradas separadas y consecutivas.A pesar de que el tiempo de retención difiere ligeramente, esto todavía se puede utilizar para la cuantificación sin etiquetas porque el cambio de tiempo es inferior a un minuto. Este es un ejemplo de un espectro de masa de escaneo completo que contiene un neuropéptido que fue etiquetado con Dimetil, lo que resulta en un cambio de masa de Dalton de 4.025 entre las formas ligeras y pesadas del neuropéptido. El espectro de masa iónica de fragmentos de un péptido secuenciado De Novo demuestra una buena cobertura de fragmentación, donde se observó un ion fragmento B y/o Y para cada aminoácido con un error de masa bajo de 0,02 Dalton.Esto indica que se observó un péptido endógeno perteneciente a la familia de neuropéptidos RYMI del crustáceo. Ejemplos de buenos puntos que tocan todos los bordes del pozo grabado se muestran a la izquierda. Y ejemplos de puntos malos se muestran a la derecha.Después de la obtención de imágenes MALDI MS de neuropéptidos de tejidos callinectes sapidus, se obtuvieron imágenes de distribución iónica de varios valores de M sobre Z correspondientes a diferentes neuropéptidos. La optimización del disolvente de extracción para un tipo de analy en particular es crucial. También asegúrese de que se produzca una homogeneización completa y ajuste el método según sea necesario.No se detectará nada aguas abajo si no se extrae. Esta técnica puede proporcionar una lista fundamental de neuropéptidos importantes que pueden investigarse más a fondo como biomarcadores potenciales, así como proporcionar información de localización no dirigida sin la necesidad de anticuerpos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

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Aprende espectrometría de masas para caracterizar neuropéptidos en Callinectes sapidus. Este protocolo optimizado permite secuenciar, cuantificar y localizar péptidos endógenos con alta sensibilidad.

Investigación espectrométrica de masas multifacética de neuropéptidos en Callinectes sapidus

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