Aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón para ensayos respirométricos

Aquí, describimos un método detallado para el aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón y el posterior análisis de la respiración por tasa de consumo de oxígeno (OCR) utilizando ensayos respirométricos basados en microplacas. Esta tubería se puede aplicar para estudiar los efectos de múltiples intervenciones ambientales o genéticas en el metabolismo mitocondrial.

Esta palabra describe el análisis de la respiración en el procesamiento de mitocondrias del músculo esquelético del ratón. Este protocolo reduce considerablemente el tiempo de purificación y permite procesar múltiples muestras simultáneamente. Las mitocondrias de animales de cualquier género de origen unido pueden ser mutiladas utilizando este protocolo que permite el estudio de la respiración en una amplia variedad de condiciones experimentales.

Este método es adecuado para todas las áreas de investigación donde la función de las mitocondrias es relevante, incluido el envejecimiento, las pruebas de drogas, el cáncer o el desarrollo. Incluso se puede adaptar a otros tejidos y organismos también. Asegúrese de que todos los materiales estén fríos colocando todo en el hielo durante el procedimiento para proteger las mitocondrias del daño.

Coloque tres vasos de precipitados de 50 mililitros por muestra en hielo y agregue 10 mililitros de PBS en el vaso de precipitados uno, 10 mililitros de 10 milimolares EDTA PBS en el vaso de precipitados dos y cuatro mililitros IB1 en el vaso de precipitados tres. Rocíe la extremidad posterior derecha de un ratón sacrificado con 70% de etanol para evitar que el pelaje se desprenda y pegue la extremidad con cinta adhesiva a la tabla de disección de corcho y luego pegue con cinta adhesiva la extremidad anterior izquierda. Haga una incisión con un bisturí desechable estéril a través de la piel desde la rodilla hasta los pies.

Agarre la piel con pinzas dentadas a la altura del tobillo y córtela con tijeras finas alrededor del tobillo. Alivie la piel lejos de la musculatura subyacente con pinzas de punta fina en una mano mientras la levanta con pinzas dentadas en la otra mano. Diseccionar todos los músculos esqueléticos desde el tobillo hasta la rodilla y extraer todo el tejido conectivo sobre el músculo tibial anterior con pinzas finas y tijeras.

Encuentre los cuatro tendones distales del músculo extensor digitorum longus y seccionarlos cerca de sus inserciones en los dedos de los pies. Localice el tendón distal anterior tibial y córtelo cerca de su inserción debajo del tobillo. Tire de los tendones tibial anterior y extensor digitorum longus por encima del tobillo para liberar los cabos sueltos.

Agarre los extremos sueltos de los tendones y alivie los músculos lejos del resto de la musculatura en los huesos tirando de ellos hacia arriba. Corte los tendones proximales de estos músculos lo más cerca posible de la rótula. Gire el ratón boca abajo para proceder con la extracción del músculo gastrocnemio y sóleo.

Agarre el bolsillo formado entre el bíceps, el femoral y el gastrocnemio y separe estos músculos usando tijeras finas para visualizar el tendón gastrocnemio proximal. Agarre y corte cuidadosamente el tendón de Aquiles distal con tijeras finas. Cortar el tendón gastrocnemio proximal liberándolo con el sóleo subyacente.

Diseccione cuidadosamente los músculos restantes y vuelva a fijar el ratón en la posición inicial para diseccionar el músculo cuádriceps. Deseche el tejido adiposo y luego inserte pinzas finas entre los cuádriceps y el fémur para separar el músculo del hueso. Agarre los tendones musculares del cuádriceps distal y corte el tendón lo más cerca posible de la rótula.

Tire de los cuádriceps hacia arriba y libérelos con tijeras finas en la inserción proximal. Repita lo mismo para la extremidad posterior izquierda. Enjuague todos los músculos en vaso de precipitados uno, luego dos, seguido de vaso de precipitados tres.

Finalmente, pica todos los músculos en el vaso de precipitados tres con tijeras afiladas sobre hielo. Transfiera la suspensión a un tubo C, ciérrela herméticamente y colóquela boca abajo en la manga del homogeneizador. Divida el homogeneizado en dos tubos de microcentrífuga preenfriados de 2 mililitros y centrífuga durante 10 minutos.

Luego transfiera el sobrenadante a nuevos tubos preenfriados y centrífuga durante otros 10 minutos. Combine el pellet en 500 microlitros de IB2 Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga preenfriado de 2 mililitros y etiquételo como sobrenadante número dos, o SN2. Re suspender el pellet mitocondrial final en 200 microlitros de tampón de re suspensión.

Reserve rápidamente 10 microlitros para la cuantificación de proteínas e inmediatamente agregue 10 microlitros de 10% FFA BSA a la suspensión mitocondrial restante para evitar daños. Centrifugar la suspensión mitocondrial concentrada a 10, 500 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Vuelva a suspender el pellet mitocondrial en 100 microlitros de medio de ensayo de acoplamiento 1X con BSA, medio de ensayo de flujo de electrones 1X con BSA o medio de oxidación beta 1X con BSA, dependiendo del protocolo a realizar.

Diluya esta muestra mitocondrial concentrada a 0,2 microgramos por microlitro utilizando el medio de ensayo correspondiente. Sembra 50 microlitros de la suspensión por pozo en una microplaca de 24 pocillos preenfriada sobre hielo. En los pozos de corrección de fondo, agregue solo el medio de ensayo correspondiente.

Almacene la suspensión mitocondrial restante a menos 80 grados Celsius para la determinación de la pureza de la fragmentación. Gire la microplaca en la centrífuga preparativa preenfriada durante 20 minutos. Mientras tanto, caliente el medio de ensayo restante a 37 grados centígrados.

Después de la centrifugación, deje la microplaca en el banco durante cinco minutos para equilibrar. Agregue 450 microlitros del medio de ensayo caliente por pozo lenta y cuidadosamente para evitar la separación de las mitocondrias. Coloque la microplaca inmediatamente en el instrumento de medición del consumo de oxígeno sin la tapa e inicie el programa de medición.

Asegúrese de que el primer paso sea una incubación de 10 minutos para permitir que la microplaca se caliente. Una vez finalizado el experimento, retire el cartucho y la microplaca, apague el instrumento y comience el análisis. Los perfiles proteicos generales de las diferentes fracciones obtenidas a través de centrifugaciones seriadas mostraron distintas poblaciones de proteínas en las fracciones aisladas.

La presencia de todo el contenido mitocondrial es evidente por las fuertes señales de marcadores de la membrana mitocondrial externa e interna y las proteínas nucleoides asociadas. La fracción N representa núcleos y material no interrumpido. La mayoría de los marcadores de retículo endoplásmico, membrana plasmática o citoplasma en las fracciones SN1 o SN2 resaltan la alta pureza obtenida durante el aislamiento.

Se observó un aumento en el consumo de oxígeno después de la adición de ADP en los ensayos de acoplamiento y oxidación beta. Después de la adición de cianuro de carbonilo-p-trifluorometoxi fenilhidrazona, el consumo de oxígeno alcanzó su nivel más alto. Una baja relación de control respiratorio asegura la integridad de las mitocondrias aisladas.

El ensayo de flujo de electrones examinó la actividad de los complejos de la cadena de transporte de electrones individualmente o en combinación a través de la inyección de sustratos e inhibidores específicos. Aislar las mitocondrias es extremadamente sensible. Por lo tanto, todos los pasos después de la mitigación del tejido deben realizarse con diligencia y cuidado para preservar su viabilidad.

Los ensayos experimentales se pueden complementar con un análisis semático determinista de moléculas clave de mitocondrias o con el estudio del ensamblaje de complejos respirométricos utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida nativa azul.