Name: Aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón para ensayos respirométricos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Aprenda a aislar mitocondrias de músculo esquelético de ratón para ensayos respirométricos. Este protocolo reduce el tiempo de purificación y permite procesar múltiples muestras simultáneamente.

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Queremos agradecer a Juan J. Tena por el uso del homogeneizador y a las instalaciones de Proteómica y Ganadería de CABD por el apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Educación, Cultura y Deporte de España a través de la beca FPU16/03264 a J.D.H.C., la Association Française contre les Myopathies (AFM) a través de la beca #22450 a C.V.-G., una Beca Institucional MDM-2016-0687 (Unidad de Excelencia Maria de Maeztu, Departamento de Regulación Génica y Morfogénesis en CABD) y BFU2017-83150-P a J.J.C. La Junta de Andalucía concede P18-RT-4572, el Programa de Financiación FEDER de la Unión Europea, y el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades a P.N.

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Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses que revelar.

Todos los métodos utilizados para estudiar la respiración mitocondrial tienen sus limitaciones; por lo tanto, es crucial seleccionar el método que mejor se adapte a una pregunta experimental específica. Este trabajo proporciona un protocolo actualizado y detallado para aislar las mitocondrias del músculo esquelético del ratón para realizar diferentes ensayos respiratorios para investigar la función mitocondrial. De hecho, el estudio de la bioenergética mitocondrial en mitocondrias aisladas utilizando tecnologías basadas ...

Las mitocondrias son los principales orgánulos metabólicos de la célula1. Estos orgánulos especializados encerrados en membrana utilizan moléculas de nutrientes para producir energía en forma de trifosfato de adenosina (ATP) por OXPHOS. Este proceso se basa en la transferencia de electrones de moléculas donantes en una serie de reacciones redox en el ETC2. La CoQ es el único lípido redox-activo que se produce endógenamente en todas las membranas celulares y lipoproteínas circulantes que muestra función antioxidante3. Es un componente esencial de la ETC, transfiriendo electrones del complejo I dependiente de NADH y del complejo II dependiente de FADH2 al complejo III, aunque muchas otras reductasas pueden impulsar la reducción de la CoQ mitocondrial a ubiquinol como paso obligatorio en múltiples vías metabólicas celulares4,5.
A lo largo del proceso, se crea un gradiente electroquímico de protones a través de la membrana interna mitocondrial, que se transforma en energía biológicamente activa por el complejo ATP sintasa V2. En consecuencia, la disfunción mitocondrial conduce a una miríada de condiciones patológicas que afectan principalmente a los tejidos con altos requerimientos de energía: el cerebro, el corazón y el músculo esquelético6,7. Por lo tanto, es fundamental desarrollar métodos para analizar con precisión la bioenergética mitocondrial para investigar su papel en la salud y la enfermedad, particularmente en tejidos altamente energéticos como los músculos esqueléticos.
El electrodo de oxígeno tipo Clark se ha utilizado clásicamente en el estudio de la respiración mitocondrial8. Sin embargo, este sistema ha sido desplazado progresivamente por tecnologías de mayor resolución, siendo especialmente populares las tecnologías de consumo de oxígeno basadas en microplacas como los analizadores Agilent Seahorse XF9. En el campo del músculo esquelético, estos estudios se realizan típicamente en células cultivadas, principalmente en la línea celular de mioblastos de ratón inmortalizada C2C12 o cultivos primarios derivados de células satélite10,11. Sin embargo, estos estudios no recapitulan completamente la situación in vivo, especialmente cuando se investiga la biología mitocondrial y la función a nivel tisular sobre insultos específicos, intervenciones no genéticas o manipulaciones genéticas.
Además, los ensayos de respiración en las células son más complejos debido a factores adicionales, incluida la demanda extramitocondrial de ATP y sustratos de ensayo o eventos de señalización, que podrían inducir a error la interpretación de los resultados. Alternativamente, también es posible usar miofibras individuales o haces de miofibras recién aisladas de los músculos. Sin embargo, el método de aislamiento es técnicamente desafiante y solo factible para unos pocos tipos de músculo. En este caso, los músculos flexor digitorum brevis (FDB) y extensor digitorum longus (EDL) se utilizan principalmente10,12,13, aunque algunos informes describen el uso de otros tipos de músculos también14,15.
También se ha reportado perfil bioenergético de secciones del músculo esquelético16. La principal ventaja de este método es que se pueden estudiar los músculos intactos (los autores muestran que cortar a través de las fibras no altera los resultados en comparación con las miofibras aisladas). Sin embargo, el acceso mitocondrial a sustratos e inhibidores de ensayos es limitado y, por lo tanto, solo se pueden medir unos pocos parámetros16. Finalmente, las mitocondrias aisladas también pueden ser empleadas9,17,18,19. En este caso, las mitocondrias pierden su entorno citosólico, lo que podría afectar su función. Por el contrario, este método garantiza el acceso a sustratos e inhibidores, permite el análisis de una gran cantidad de tipos de muestras y, por lo general, requiere menos material.
Este artículo describe un método para realizar el perfil bioenergético de mitocondrias aisladas del músculo esquelético de ratón utilizando ensayos respirométricos basados en microplacas (Figura 1). En particular, se detallan tres protocolos: el Ensayo de Acoplamiento, CA para evaluar el grado de acoplamiento entre el ETC y la maquinaria OXPHOS; el ensayo de flujo de electrones, EFA para medir la actividad de los complejos ETC individuales; y el ensayo BOX para determinar la capacidad de β-oxidación mitocondrial. En particular, solo se requieren pequeñas cantidades de muestras en comparación con los métodos de respirometría convencionales. El protocolo de aislamiento utilizado aquí ha sido modificado a partir del método publicado en otra parte18.

<table><tbody><tr><td>Acciones de ADP</td><td>Sigma</td><td>A5285</td><td>a -20 &deg; Tecnología</td></tr><tr><td>de señalización celular</td> de<td>anticuerpos C AKT</td><td>C67E7</td><td>Conejo (especie huésped)</td></tr><tr><td>anti-Cabra HRP</td><td>Sigma</td><td></td><td>401504 Conejo (especie huésped)</td></tr><tr><td>anti-ratón Señalización celular HRP</td><td></td><td>#7076</td><td>Caballo (especie huésped)</td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td>Stock a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>anti-Conejo HRP</td><td>Señalización</td> celular<td>#7074</td><td>Cabra (especie huésped)</td></tr><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td>Stock en RT</td></tr><tr><td>Anticuerpo de bactina</td><td>Sigma</td><td>MBS4-48085</td><td>Cabra (especie huésped)</td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas Bio-Rad II</td><td>Bio-Rad</td><td>5000002</td><td>Incluye 5 veces el reactivo Bradford y BSA de concentración conocida para la curva estándar</td></tr><tr><td>BSA, fracción V, Caldo de 126575 Calbiochem sin ácidos grasos</td><td></td><td></td><td>a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>C tubo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>Tapa morada</td></tr><tr><td>Anticuerpo de calnexina</td><td>ThermoFisher</td><td>MA3-027</td><td>Ratón (especie huésped)</td></tr><tr><td>D-manitol</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>Stock en RT</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BDH</td><td>280254D</td><td>Stock en 4 & deg; C</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E-4378</td><td>Culata en RT</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>Culata en -20 &deg; C</td></tr><tr><td>gentleMACS Disociador</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>Homogeneizador</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>Stock en RT</td></tr><tr><td>Anticuerpo HSP70</td><td>Proteintech</td><td>10995-1-AP</td><td>Conejo (Especie huésped)</td></tr><tr><td>Anticuerpo LDH-A</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC27230</td><td>Cabra (Especie huésped)</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>ChemCruz</td><td>sc-255260A</td><td>Stock en RT</td></tr><tr><td>Ácido málico</td><td>Sigma</td><td>P1645</td><td>Stock en RT</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro de microplacas</td><td>BMG LABTECH GmbH</td><td>POLARstar OMEGA S/N 415-0292</td><td>Stock en RT</td></tr><tr><td>Milli-Q water</td><td>Millipore system F7HA17757A</td><td></td><td>Agua ultrapura</td></tr><tr><td>anticuerpo mtTFA</td><td>Santa Cruz Biotechnology SC23588</td><td></td><td>Cabra (Especie huésped)</td></tr><tr><td>Na+/K+-ATPasa y alfa; 1 anticuerpo</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB300-14755</td><td>Ratón (Especie huésped)</td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>Stock a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Palmitoyl-L-carnitina</td><td>Sigma</td><td>P1645</td><td>Stock a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>PBS comprimidos</td><td>Sigma</td><td>P4417-100TAB</td><td>1x stock en RT</td></tr><tr><td>Fosfato de dihidrógeno potásico</td><td>ChemCruz</td><td>sc-203211</td><td>Stock en RT</td></tr><tr><td>Hidróxido de potasio</td><td>Sigma</td><td>60377</td><td>Stock en RT</td></tr><tr><td>Ácido pirúvico</td><td>Sigma</td><td>107360</td><td>Stock en 4 & deg; C</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma</td><td>R8875</td><td>Stock a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Caballito de mar XF24 analizador de flujo mitocondrial</td><td>Agilent Technologies</td><td>420179</td><td>modelo XFe24</td></tr><tr><td>Caballito de mar XFe24 FluxPak mini</td><td>Agilent Technologies</td><td>102342-100</td><td>El kit incluye cartuchos, microplacas y solución calibrante</td></tr><tr><td>Succinato</td><td>Sigma</td><td>S7626</td><td>Stock en RT</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td>Stock en</td></tr><tr><td>RT TIMM23 anticuerpo</td><td>Abcam</td><td>ab230253</td><td>Conejo (Especie huésped)</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Sigma</td><td>T7394</td><td>Stock a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>TOMM20 anticuerpo</td><td>Abcam</td><td>ab56783</td><td>Ratón (Especie huésped)</td></tr><tr><td>Anticuerpo VDAC</td><td>Abcam</td><td>ab15895</td><td>Conejo (Especie huésped)</td></tr></tbody></table>

aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón para ensayos respirométricos

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

La mayor parte de la energía de la célula se obtiene a través de la degradación de glucosa, ácidos grasos y aminoácidos por diferentes vías que convergen en el sistema de fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS), que se regula en respuesta a las demandas celulares. La molécula lipídica Coenzima Q (CoQ) es esencial en este proceso mediante la transferencia de electrones al complejo III en la cadena de transporte de electrones (ETC) a través de ciclos constantes de oxidación/reducción. El estado de las mitocondrias y, en última instancia, la salud celular se pueden evaluar midiendo el consumo de oxígeno ETC utilizando ensayos respirométricos. Estos estudios se realizan típicamente en líneas celulares establecidas o primarias que se han cultivado durante varios días. En ambos casos, los parámetros respiratorios obtenidos pueden haberse desviado de las condiciones fisiológicas normales en cualquier órgano o tejido dado.
Además, las características intrínsecas de las fibras individuales cultivadas aisladas del músculo esquelético impiden este tipo de análisis. Este artículo presenta un protocolo actualizado y detallado para el análisis de la respiración en mitocondrias recién aisladas del músculo esquelético de ratón. También proporcionamos soluciones a posibles problemas que podrían surgir en cualquier etapa del proceso. El método aquí presentado podría aplicarse para comparar las tasas de consumo de oxígeno en diversos modelos de ratones transgénicos y estudiar la respuesta mitocondrial a los tratamientos farmacológicos u otros factores como el envejecimiento o el sexo. Este es un método factible para responder a preguntas cruciales sobre el metabolismo y la regulación de la bioenergética mitocondrial.

El protocolo aquí presentado permite el análisis in vivo de la respiración mitocondrial a través del aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón. En la Figura 1 se muestra un esquema del método. Después de diseccionar los músculos esqueléticos de las extremidades posteriores (Figura 2), los tejidos se homogeneizan y las mitocondrias se purifican, en condiciones isotónicas, a través de centrifugaciones en serie. La pureza de las diferent...

Aquí, describimos un método detallado para el aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón y el posterior análisis de la respiración por tasa de consumo de oxígeno (OCR) utilizando ensayos respirométricos basados en microplacas. Esta tubería se puede aplicar para estudiar los efectos de múltiples intervenciones ambientales o genéticas en el metabolismo mitocondrial.

Aislamiento de mitocondrias del músculo esquelético de ratón para ensayos respirométricos

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

Esta palabra describe el análisis de la respiración en el procesamiento de mitocondrias del músculo esquelético del ratón. Este protocolo reduce considerablemente el tiempo de purificación y permite procesar múltiples muestras simultáneamente. Las mitocondrias de animales de cualquier género de origen unido pueden ser mutiladas utilizando este protocolo que permite el estudio de la respiración en una amplia variedad de condiciones experimentales.Este método es adecuado para todas las áreas de investigación donde la función de las mitocondrias es relevante, incluido el envejecimiento, las pruebas de drogas, el cáncer o el desarrollo. Incluso se puede adaptar a otros tejidos y organismos también. Asegúrese de que todos los materiales estén fríos colocando todo en el hielo durante el procedimiento para proteger las mitocondrias del daño.Coloque tres vasos de precipitados de 50 mililitros por muestra en hielo y agregue 10 mililitros de PBS en el vaso de precipitados uno, 10 mililitros de 10 milimolares EDTA PBS en el vaso de precipitados dos y cuatro mililitros IB1 en el vaso de precipitados tres. Rocíe la extremidad posterior derecha de un ratón sacrificado con 70% de etanol para evitar que el pelaje se desprenda y pegue la extremidad con cinta adhesiva a la tabla de disección de corcho y luego pegue con cinta adhesiva la extremidad anterior izquierda. Haga una incisión con un bisturí desechable estéril a través de la piel desde la rodilla hasta los pies.Agarre la piel con pinzas dentadas a la altura del tobillo y córtela con tijeras finas alrededor del tobillo. Alivie la piel lejos de la musculatura subyacente con pinzas de punta fina en una mano mientras la levanta con pinzas dentadas en la otra mano. Diseccionar todos los músculos esqueléticos desde el tobillo hasta la rodilla y extraer todo el tejido conectivo sobre el músculo tibial anterior con pinzas finas y tijeras.Encuentre los cuatro tendones distales del músculo extensor digitorum longus y seccionarlos cerca de sus inserciones en los dedos de los pies. Localice el tendón distal anterior tibial y córtelo cerca de su inserción debajo del tobillo. Tire de los tendones tibial anterior y extensor digitorum longus por encima del tobillo para liberar los cabos sueltos.Agarre los extremos sueltos de los tendones y alivie los músculos lejos del resto de la musculatura en los huesos tirando de ellos hacia arriba. Corte los tendones proximales de estos músculos lo más cerca posible de la rótula. Gire el ratón boca abajo para proceder con la extracción del músculo gastrocnemio y sóleo.Agarre el bolsillo formado entre el bíceps, el femoral y el gastrocnemio y separe estos músculos usando tijeras finas para visualizar el tendón gastrocnemio proximal. Agarre y corte cuidadosamente el tendón de Aquiles distal con tijeras finas. Cortar el tendón gastrocnemio proximal liberándolo con el sóleo subyacente.Diseccione cuidadosamente los músculos restantes y vuelva a fijar el ratón en la posición inicial para diseccionar el músculo cuádriceps. Deseche el tejido adiposo y luego inserte pinzas finas entre los cuádriceps y el fémur para separar el músculo del hueso. Agarre los tendones musculares del cuádriceps distal y corte el tendón lo más cerca posible de la rótula.Tire de los cuádriceps hacia arriba y libérelos con tijeras finas en la inserción proximal. Repita lo mismo para la extremidad posterior izquierda. Enjuague todos los músculos en vaso de precipitados uno, luego dos, seguido de vaso de precipitados tres.Finalmente, pica todos los músculos en el vaso de precipitados tres con tijeras afiladas sobre hielo. Transfiera la suspensión a un tubo C, ciérrela herméticamente y colóquela boca abajo en la manga del homogeneizador. Divida el homogeneizado en dos tubos de microcentrífuga preenfriados de 2 mililitros y centrífuga durante 10 minutos.Luego transfiera el sobrenadante a nuevos tubos preenfriados y centrífuga durante otros 10 minutos. Combine el pellet en 500 microlitros de IB2 Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga preenfriado de 2 mililitros y etiquételo como sobrenadante número dos, o SN2. Re suspender el pellet mitocondrial final en 200 microlitros de tampón de re suspensión.Reserve rápidamente 10 microlitros para la cuantificación de proteínas e inmediatamente agregue 10 microlitros de 10% FFA BSA a la suspensión mitocondrial restante para evitar daños. Centrifugar la suspensión mitocondrial concentrada a 10, 500 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Vuelva a suspender el pellet mitocondrial en 100 microlitros de medio de ensayo de acoplamiento 1X con BSA, medio de ensayo de flujo de electrones 1X con BSA o medio de oxidación beta 1X con BSA, dependiendo del protocolo a realizar.Diluya esta muestra mitocondrial concentrada a 0,2 microgramos por microlitro utilizando el medio de ensayo correspondiente. Sembra 50 microlitros de la suspensión por pozo en una microplaca de 24 pocillos preenfriada sobre hielo. En los pozos de corrección de fondo, agregue solo el medio de ensayo correspondiente.Almacene la suspensión mitocondrial restante a menos 80 grados Celsius para la determinación de la pureza de la fragmentación. Gire la microplaca en la centrífuga preparativa preenfriada durante 20 minutos. Mientras tanto, caliente el medio de ensayo restante a 37 grados centígrados.Después de la centrifugación, deje la microplaca en el banco durante cinco minutos para equilibrar. Agregue 450 microlitros del medio de ensayo caliente por pozo lenta y cuidadosamente para evitar la separación de las mitocondrias. Coloque la microplaca inmediatamente en el instrumento de medición del consumo de oxígeno sin la tapa e inicie el programa de medición.Asegúrese de que el primer paso sea una incubación de 10 minutos para permitir que la microplaca se caliente. Una vez finalizado el experimento, retire el cartucho y la microplaca, apague el instrumento y comience el análisis. Los perfiles proteicos generales de las diferentes fracciones obtenidas a través de centrifugaciones seriadas mostraron distintas poblaciones de proteínas en las fracciones aisladas.La presencia de todo el contenido mitocondrial es evidente por las fuertes señales de marcadores de la membrana mitocondrial externa e interna y las proteínas nucleoides asociadas. La fracción N representa núcleos y material no interrumpido. La mayoría de los marcadores de retículo endoplásmico, membrana plasmática o citoplasma en las fracciones SN1 o SN2 resaltan la alta pureza obtenida durante el aislamiento.Se observó un aumento en el consumo de oxígeno después de la adición de ADP en los ensayos de acoplamiento y oxidación beta. Después de la adición de cianuro de carbonilo-p-trifluorometoxi fenilhidrazona, el consumo de oxígeno alcanzó su nivel más alto. Una baja relación de control respiratorio asegura la integridad de las mitocondrias aisladas.El ensayo de flujo de electrones examinó la actividad de los complejos de la cadena de transporte de electrones individualmente o en combinación a través de la inyección de sustratos e inhibidores específicos. Aislar las mitocondrias es extremadamente sensible. Por lo tanto, todos los pasos después de la mitigación del tejido deben realizarse con diligencia y cuidado para preservar su viabilidad.Los ensayos experimentales se pueden complementar con un análisis semático determinista de moléculas clave de mitocondrias o con el estudio del ensamblaje de complejos respirométricos utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida nativa azul.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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Aislamiento mitocondrial del músculo esquelético

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Los métodos presentados proporcionan instrucciones paso a paso para la realización de una colección de ensayos respirométricos basados en microplacas utilizando mitocondrias aisladas de cantidades mínimas de músculo esquelético de ratón. Estos ensayos son capaces de medir los cambios/adaptaciones mecanicistas en el consumo de oxígeno mitocondrial en un modelo animal comúnmente utilizado.

Uso de mitocondrias aisladas a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para alta microplacas rendimiento Mediciones respiratorias

Aquí, presentamos una modificación de un método previamente reportado que permite el aislamiento de mitocondrias purificadas y de alta calidad a partir de cantidades más pequeñas de músculo esquelético de ratón. Este procedimiento da como resultado mitocondrias altamente acopladas que respiran con alta función durante los ensayos respirometirc basados en microplacas.

Aislamiento de mitocondrias a partir de cantidades mínimas de ratón músculo esquelético para mediciones de alto rendimiento de microplacas Respiratorias

Aquí, se toma una muestra de músculo cuádriceps de un cerdo anestesiado y se aíslan las mitocondrias por centrifugación diferencial. A continuación, se determinan las frecuencias respiratorias de los complejos de cadenas respiratorias mitocondriales I, II y IV mediante respirometría de alta resolución.

Aislamiento de mitocondrias intactas de músculo esquelético por centrifugación diferencial para Medidas respirometría de alta resolución

Las mitocondrias son orgánulos metabólicos clave que exhiben un alto nivel de plasticidad fenotípica en el músculo esquelético. La importación de proteínas del citosol es una vía crítica para la biogénesis de orgánulos, esencial para la expansión del retículo y el mantenimiento de la función mitocondrial.  Por lo tanto, la importación de proteínas sirve como un barómetro de la salud celular.

Medición de la capacidad de importación de proteínas de las mitocondrias del músculo esquelético

El micro-disección técnica de explantes es un método robusto y fiable para el aislamiento de proliferación células del músculo esquelético de los músculos menores, adultas o embrionarias como fuente de células madre de músculo esquelético. Excepcionalmente, estas células han sido derivadas por clonación para producir músculo esquelético líneas de células madre utilizadas en el trasplante de vivo.

Adultas y embrionarias del músculo esquelético Cultura Microexplant y aislamiento de células madre de músculo esquelético

Método para la disociación enzimática, el etiquetado de superficie y la purificación por citometría de flujo de fibro / adipogénico y progenitores miogénica del músculo esquelético murino.

Purificación de los progenitores del músculo esquelético

El método que aquí se presenta incluye el daño exacto de embriones de pez cebra en vivo con pulsos láser de alta energía y el posterior análisis de estas lesiones y su recuperación con el tiempo. También mostramos cómo genéticamente etiquetado individual o grupos de células del músculo esquelético se puede seguir durante y después de la luz láser daño inducido.

Laser-infligido lesiones de músculo esquelético embrionario de pez cebra

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Aislamiento y cultivo de fibras individuales y sus células satélite del músculo esquelético adulto

Aprenda a aislar mitocondrias de músculo esquelético de ratón para ensayos respirométricos. Este protocolo reduce el tiempo de purificación y permite procesar múltiples muestras simultáneamente.

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