Name: Cuantificación de especies reactivas de oxígeno utilizando sonda de dicacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína y citometría de flujo en células gliales de Müller (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: Aprende a cuantificar especies reactivas de oxígeno en células gliales de Müller utilizando la sonda DCFH-DA y citometría de flujo. Este protocolo reproducible facilita el estudio del estrés oxidativo en neurobiología.

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Los autores desean agradecer a María Pilar Crespo y Paula Alejandra Abadie del CIBICI (Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología, CONICET-UNC, Córdoba, Argentina) por su asistencia en citometría de flujo y a Gabriela Furlan y Noelia Maldonado por su asistencia en cultivo celular. También agradecemos a Víctor Díaz (Pro-Secretario de Comunicación Institucional de la FCQ) por la producción y edición del video.
Este artículo fue financiado por subvenciones de la Secretaría de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Córdoba (SECyT-UNC) Consolidar 2018-2021, Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica (FONCyT) y Proyecto de Investigación en Ciencia y Tecnología (PICT) 2015 N° 1314 (todos a M.C.S.).

<ol><li>Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, L., Wong, R. O. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+architecture+of+the+retina%3A+Development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Functional architecture of the retina: Development and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 42, 44-84 (2014).</li>
<li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li>
<li>Subirada, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+journey+into+the+retina%3A+M%C3%BCller+glia+commanding+survival+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A journey into the retina: Müller glia commanding survival and death.</a> European Journal of Neuroscience. 47 (12), 1429-1443 (2018).</li>
<li>Coughlin, B. A., Feenstra, D. J., Mohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+cells+and+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Research%22%5BJournal%5D)">Müller cells and diabetic retinopathy.</a> Vision Research. 139, 93-100 (2017).</li>
<li>Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+glial+cell+reprogramming+and+retina+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Müller glial cell reprogramming and retina regeneration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 15 (7), 431-442 (2014).</li>
<li>Kamalden, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomal+microRNA-15a+transfer+from+the+pancreas+augments+diabetic+complications+by+inducing+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidation+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Exosomal microRNA-15a transfer from the pancreas augments diabetic complications by inducing oxidative stress.</a> Antioxidation Redox Signaling. 27 (13), 913-930 (2017).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+of+inflammatory+cytokine+TNF%CE%B1+is+upregulated+in+retinal+angiogenesis+under+hyperoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Transcription of inflammatory cytokine TNFα is upregulated in retinal angiogenesis under hyperoxia.</a> Cell Physiology and Biochemistry. 39 (2), 573-583 (2016).</li>
<li>Rojas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOX2-induced+activation+of+arginase+and+diabetes-induced+retinal+endothelial+cell+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants%22%5BJournal%5D)">NOX2-induced activation of arginase and diabetes-induced retinal endothelial cell senescence.</a> Antioxidants. 6 (2), 43(2017).</li>
<li>Sennlaub, F., Courtois, Y., Goureau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+nitric+oxide+synthase+mediates+retinal+apoptosis+in+ischemic+proliferative+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Inducible nitric oxide synthase mediates retinal apoptosis in ischemic proliferative retinopathy.</a> Journal of Neuroscience. 22 (10), 3987-3993 (2002).</li>
<li>Wilkinson-Berka, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase%2C+NOX1%2C+mediates+vascular+injury+in+ischemic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidation+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase, NOX1, mediates vascular injury in ischemic retinopathy.</a> Antioxidation and Redox Signaling. 20 (17), 2726-2740 (2014).</li>
<li>Wang, H., Zhang, S. X., Hartnett, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+triggered+by+oxidative+stress+that+mediate+features+of+severe+retinopathy+of+prematurity%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways triggered by oxidative stress that mediate features of severe retinopathy of prematurity.</a> JAMA Ophthalmology. 131 (1), 80-85 (2013).</li>
<li>Sies, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%3A+a+concept+in+redox+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress: a concept in redox biology and medicine.</a> Redox Biology. 4, 180-183 (2015).</li>
<li>Zorov, D. B., Juhaszova, M., Sollott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reactive+oxygen+species+%28ROS%29+and+ROS-induced+ROS+release%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) and ROS-induced ROS release.</a> Physiological Reviews. 94 (3), 909-950 (2014).</li>
<li>Navneet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+homocysteine+upregulates+the+NRF2-antioxidant+pathway+in+retinal+M%C3%BCller+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experiments+in+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Excess homocysteine upregulates the NRF2-antioxidant pathway in retinal Müller glial cells.</a> Experiments in Eye Research. 178, 228-237 (2019).</li>
<li>Navneet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperhomocysteinemia-induced+death+of+retinal+ganglion+cells%3A+The+role+of+M%C3%BCller+glial+cells+and+NRF2%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyperhomocysteinemia-induced death of retinal ganglion cells: The role of Müller glial cells and NRF2.</a> Redox Biology. 24, 101199(2019).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sigma+1+receptor+regulates+the+oxidative+stress+response+in+primary+retinal+M%C3%BCller+glial+cells+via+NRF2+signaling+and+system+xc%28-%29%2C+the+Na%28%2B%29-independent+glutamate-cystine+exchanger%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sigma 1 receptor regulates the oxidative stress response in primary retinal Müller glial cells via NRF2 signaling and system xc(-), the Na(+)-independent glutamate-cystine exchanger.</a> Free Radical Biology and Medicine. 86, 25-36 (2015).</li>
<li>Nakamura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+activator+RS9+suppresses+pathological+ocular+angiogenesis+and+hyperpermeability%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Nrf2 activator RS9 suppresses pathological ocular angiogenesis and hyperpermeability.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (6), 1943-1952 (2019).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NRF2+plays+a+protective+role+in+diabetic+retinopathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">NRF2 plays a protective role in diabetic retinopathy in mice.</a> Diabetologia. 57 (1), 204-213 (2014).</li>
<li>Chen, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+protects+photoreceptor+cells+from+photo-oxidative+stress+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Experiments+in+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Nrf2 protects photoreceptor cells from photo-oxidative stress induced by blue light.</a> Experiments in Eye Research. 154, 151-158 (2017).</li>
<li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+in+ischemic+neurons+promotes+retinal+vascular+regeneration+through+regulation+of+semaphorin+6A%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nrf2 in ischemic neurons promotes retinal vascular regeneration through regulation of semaphorin 6A.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112 (50), 6927-6936 (2015).</li>
<li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+has+a+protective+role+against+neuronal+and+capillary+degeneration+in+retinal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nrf2 has a protective role against neuronal and capillary degeneration in retinal ischemia-reperfusion injury.</a> Free Radical Biology and Medicine. 51 (1), 216-224 (2011).</li>
<li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+acts+cell-autonomously+in+endothelium+to+regulate+tip+cell+formation+and+vascular+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nrf2 acts cell-autonomously in endothelium to regulate tip cell formation and vascular branching.</a> Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (41), 3910-3918 (2013).</li>
<li>Wei, Y., Gong, J., Xu, Z., Duh, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+promotes+reparative+angiogenesis+through+regulation+of+NADPH+oxidase-2+in+oxygen-induced+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nrf2 promotes reparative angiogenesis through regulation of NADPH oxidase-2 in oxygen-induced retinopathy.</a> Free Radical Biology and Medicine. 99, 234-243 (2016).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+role+of+Nrf2+for+retinal+ganglion+cells+in+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective role of Nrf2 for retinal ganglion cells in ischemia-reperfusion.</a> Journal of Neurochemistry. 133 (2), 233-241 (2015).</li>
<li>Armstrong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+protocols+in+oxidative+stress+III%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Advanced protocols in oxidative stress III.</a> Methods in Molecular Biology. 1208, (2015).</li>
<li>Shehat, M. G., Tigno-Aranjuez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+ROS+production+in+macrophages+in+response+to+Fc%CE%B3R+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of ROS production in macrophages in response to FcγR cross-linking.</a> Journal of Visualized Experiments. (145), e59167(2019).</li>
<li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+%28ROS%29+in+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3357(2011).</li>
<li>Halliwell, B., Whiteman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+reactive+species+and+oxidative+damage+in+vivo+and+in+cell+culture%3A+how+should+you+do+it+and+what+do+the+results+mean%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean.</a> British Journal of Pharmacology. 142 (2), 231-255 (2004).</li>
<li>Kalyanaraman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+with+fluorescent+probes%3A+challenges+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations.</a> Free Radical Biology and Medicine. 52 (1), 1-6 (2012).</li>
<li>Fernandes, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DHE-derived+oxidation+products+by+HPLC+in+the+assessment+of+superoxide+production+and+NADPH+oxidase+activity+in+vascular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+and+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of DHE-derived oxidation products by HPLC in the assessment of superoxide production and NADPH oxidase activity in vascular systems.</a> American Journal of Physiology and Cell Physiology. 292 (1), 413-422 (2007).</li>
<li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation%3A+another+inconvenient+truth%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li>
<li>Roelofs, B. A., Ge, S. X., Studlack, P. E., Polster, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+micromolar+concentrations+of+the+superoxide+probe+MitoSOX+uncouple+neural+mitochondria+and+inhibit+complex+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Low micromolar concentrations of the superoxide probe MitoSOX uncouple neural mitochondria and inhibit complex IV.</a> Free Radical Biology and Medicine. 86, 250-258 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Varias afecciones patológicas, como el cáncer, las enfermedades inflamatorias, la isquemia/reperfusión, la cardiopatía isquémica, la diabetes y las retinopatías, y también situaciones fisiológicas como el envejecimiento, conducen a la sobreproducción de ROS 6,7,8,9,10,11. Por lo tanto, la detección, medición y comprensión de ...

La retina neural es un tejido muy organizado que presenta capas neuronales bien definidas. En estas, las neuronas (células ganglionares, amacrinas, bipolares, horizontales y fotorreceptoras) están interconectadas entre sí y también con células gliales de Müller (MGC) y astrocitos, lo que lleva a una adecuada fototransducción y procesamiento de la información visual 1,2. Se sabe que los MGC tienen un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis retiniana porque atraviesan toda la sección retiniana y, por lo tanto, pueden interactuar con todos los tipos de células que modulan múltiples procesos protectores. Se ha reportado que los MGC tienen varias funciones importantes para el mantenimiento y la supervivencia de las neuronas retinianas, incluyendo la glucólisis para proporcionar energía a las neuronas, la eliminación de desechos neuronales, el reciclaje de neurotransmisores y la liberación de factores neurotróficos, entre otros 3,4,5.
Por otro lado, la inflamación, el estrés oxidativo y nitrosativo están implicados en la patogénesis y progresión de muchas enfermedades humanas, incluidas las retinopatías 6,7,8,9,10,11. El equilibrio redox en las células depende de una regulación estricta de los niveles de ROS. Las ROS se generan constantemente en condiciones fisiológicas como resultado de la respiración aeróbica principalmente. Los principales miembros de la familia ROS incluyen radicales libres reactivos como el anión superóxido (O2͘͘͘͘•−), radicales hidroxilo (•OH), varios peróxidos (ROOR′), hidroperóxidos (ROOH) y el peróxido de hidrógeno sin radicales (H2O2)12,13. En los últimos años, se ha hecho evidente que las ROS desempeñan un importante papel de señalización en las células mediante el control de procesos esenciales. Los MGC tienen una fuerte defensa antioxidante por la activación del factor nuclear transcripcional eritroide-2 relacionado con el factor 2 (Nrf2) y la posterior expresión de proteínas antioxidantes para eliminar la producción excesiva de ROS en condiciones patológicas 14,15,16. Cuando las células pierden su equilibrio redox debido a una producción exagerada de ROS o una capacidad defectuosa para eliminar ROS, la acumulación de estrés oxidativo promueve modificaciones dañinas en proteínas, lípidos y ADN, lo que lleva al estrés celular o la muerte. El aumento del sistema de defensa antioxidante de la retina mejora la resolución y prevención de retinopatías, como roP y RD 17,18,19,20,21,22,23,24. Por lo tanto, la medición de la producción de ROS en tiempo real es una herramienta poderosa y útil.
Existen varios métodos para medir la producción de ROS o el estrés oxidativo en las células. Entre estos, la sonda de 2′,7′-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA) es una de las técnicas más utilizadas para cuantificar directamente el estado redox de una célula 25,26,27,28. Esta sonda es lipofílica y no fluorescente. La difusión de esta sonda a través de la membrana celular permite su escisión por esterasas intracelulares en los dos enlaces éster, produciendo un producto relativamente polar e impermeable a la membrana celular, 2′,7′-diclorofluoresceína (H2DCF). Esta molécula no fluorescente se acumula intracelularmente, y la posterior oxidación por ROS produce el producto altamente fluorescente DCF. La oxidación de la sonda es producto de la acción de múltiples tipos de ROS (peroxinitrito, radicales hidroxilo, óxido nítrico o peróxidos), que pueden detectarse mediante citometría de flujo o microscopía confocal (emisión a 530 nm y excitación a 485 nm). La limitación de esta técnica es que el superóxido y el peróxido de hidrógeno no reaccionan fuertemente con H2DCF25,29. En este artículo, utilizamos la sonda DCFH-DA para medir y cuantificar ROS por citometría de flujo. Por esa razón, inducimos la producción de ROS estimulando mgC con inductor de ROS, A o B, antes de cargar las células con la sonda fluorescente. Además, utilizamos un compuesto antioxidante. Finalmente, mostramos datos representativos y fiables obtenidos utilizando este protocolo.

<table><tbody><tr><td>2&prime;,7&prime;-DCFH-DA</td><td>Sigma</td><td>35845-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfónico (HEPES)</td><td>Gibco by life technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II citómetro de flujo</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCanto</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva software</td><td>BD Biosciences Placas de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cultivo celular 100x20 mm</td><td>Cell Star- Greiner Bio-One</td><td>664 160</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Thermo</td><td>Sorvall legend micro 17 R</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga (15 ml)</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011150</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Centrífuga (50 ml)</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011500</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>CRYO. S - Greiner Bio-One</td><td>126263</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W387520-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Disodio-hidrógeno-fosfato heptahidratado</td><td>Merck</td><td>106575</td><td></td></tr><tr><td>DMEM sin fenol</td><td>rojo Gibco de life technologies</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM)</td><td>Gibco por tecnologías de la vida</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiamina tetraacético (EDTA), sal disódica, dihidrato</td><td>Merck</td><td>324503</td><td></td></tr><tr><td>suero fetal bovino</td><td>Internegocios</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10 Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Merck</td><td>108337</td><td></td></tr><tr><td>hemocitómetro, cámara de Neubauer</td><td>BOECO,Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Campana de flujo laminar</td><td>ESCO</td><td>AC2-6E8</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (GlutaMAX)</td><td>Gibco by life technologies</td><td>A12860-01</td><td></td></tr><tr><td>MitoSOX Red</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; M36008</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco de life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de</td> potasio <td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio-dihidrógeno</td><td>Merck</td><td>4878</td><td></td></tr><tr><td>Tubos redondos de poliestireno 5 ml (tubos de citometría de flujo)</td><td>Falcon - Corning</td><td>BD-352008</td><td></td></tr><tr><td>Azida de Sodio</td><td>Merck</td><td>822335</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Merck</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>hidróxido de sodio</td><td>Merck</td><td>106462</td><td></td></tr><tr><td>SPINWIN Micro Tubo de centrífuga 1,5 ml</td><td>Tarson</td><td>500010-N</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo de tejidos 6 pocillos</td><td>BIOFIL</td><td>TCP011006</td><td></td></tr><tr><td>Azul de tripano</td><td>Merck</td><td>111732</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA 0,5% 10X</td><td>Gibco de life technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>Labnet International, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación de especies reactivas de oxígeno utilizando sonda de dicacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína y citometría de flujo en células gliales de müller

Quantification of Reactive Oxygen Species Using 2&#8242;,7&#8242;-Dichlorofluorescein Diacetate Probe and Flow-Cytometry in M&#252;ller Glial Cells

El equilibrio redox tiene un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis celular. El aumento de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) promueve la modificación de proteínas, lípidos y ADN, lo que finalmente puede conducir a la alteración de la función celular y la muerte celular. Por lo tanto, es beneficioso para las células aumentar su defensa antioxidante en respuesta a insultos perjudiciales, ya sea activando una vía antioxidante como Keap1 / Nrf2 o mejorando los eliminadores redox (vitaminas A, C y E, β caroteno y polifenoles, entre otros). La inflamación y el estrés oxidativo están involucrados en la patogénesis y progresión de las retinopatías, como la retinopatía diabética (RD) y la retinopatía del prematuro (ROP). Dado que las células gliales de Müller (MGC) desempeñan un papel clave en la homeostasis del tejido retiniano neural, se consideran un modelo ideal para estudiar estos mecanismos de protección celular. En este sentido, cuantificar los niveles de ROS con un método reproducible y sencillo es fundamental para valorar el aporte de vías o moléculas que participan en el mecanismo de defensa celular antioxidante. En este artículo, proporcionamos una descripción completa de los procedimientos necesarios para la medición de ROS con sonda DCFH-DA y citometría de flujo en MGC. Aquí se proporcionan pasos clave para el procesamiento de datos de citometría de flujo con el software, por lo que los lectores podrán medir los niveles de ROS (medios geométricos de FITC) y analizar histogramas de fluorescencia. Estas herramientas son muy útiles para evaluar no solo el aumento de ROS después de un insulto celular, sino también para estudiar el efecto antioxidante de ciertas moléculas que pueden proporcionar un efecto protector sobre las células.

Como se describe en la sección de protocolo, hemos mostrado datos representativos y cuantitativos que demuestran la detección de citometría de flujo de la producción de ROS con la sonda de fluorescencia DCFH-DA de células MIO-M1 estimuladas con inductor de ROS, A o B. Como era de esperar, observamos cambios en la fluorescencia FITC en células no estimuladas por encima de los niveles de autofluorescencia (Figura 1A, comparar "control basal" vs. "control de autofluorescencia", gráfico de diagr...

Aquí, proponemos un protocolo sistematizado, accesible y reproducible para detectar especies reactivas celulares de oxígeno (ROS) utilizando una sonda de dicacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína (DCFH-DA) en células gliales de Müller (MGC). Este método cuantifica los niveles totales de ROS celulares con un citómetro de flujo. Este protocolo es muy fácil de usar, adecuado y reproducible.

Cuantificación de especies reactivas de oxígeno utilizando sonda de dicacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína y citometría de flujo en células gliales de Müller

The redox balance has an important role in maintaining cellular homeostasis. The increased generation of reactive oxygen species (ROS) promotes the ...

Existen varios métodos para medir la producción de ROS o estrés oxidativo en las células. Entre estos, la sonda de dicato de diclorofluoresceína 2'7'es una de las técnicas más utilizadas para medir directamente el estado redox. Esta sonda es lipofílica y no fluorescente. La difusión de esta sonda a través de la membrana celular permite que las esterasas intracelulares se escindan en los dos enlaces éster, produciendo un producto relativamente polar e impermeable a la membrana celular. Estas moléculas no fluorescentes se acumulan intracelularmente, y la posterior oxidación por ROS produce el producto altamente fluorescente diclorofluoresceína. La oxidación de la sonda es el producto de la acción de múltiples tipos de ROS. Que se puede detectar mediante citometría de flujo o microscopía confocal. En este artículo, hemos utilizado una sonda de diclorofluoresceína diacetato para medir y cuantificar ROS por citometría de flujo. Transfiera las placas de 6 pocillos a una campana de flujo laminar desde la incubadora. Aspirar el sobrenadante. Y lave las células una vez con PBS. Agregue 2 ml de DMEM sérico bajo por pozo. E incubar la placa de 6 pocillos durante dos horas en la incubadora. Trate las células con el antioxidante durante seis horas. Trate las células con el inductor de ROS, A o B, durante 30 minutos. Aspirar el sobrenadante. Y lave la célula tres veces con PBS para eliminar todos los estímulos. Apague la luz de la campana de flujo laminar y trabaje en la oscuridad. Añadir 1 ml de sonda de diclorofluoresceína de diacetato en DMEM sin rojo fenol. Añadir 1 ml de DMEM sin rojo fenol a las células de control de autofluorescencia de control. Incubar la placa de 6 pocillos durante 30 minutos en la incubadora. Transfiera las placas sobre hielo al laboratorio. Lave las células tres veces con 2 ml de PBS frío por pozo. Agregue 0.5 ml de tampón de separación en frío a cada pozo. Cosecha las células canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo usando una pipeta P1000. Recójalos en un tubo etiquetado de 1,5 ml. Y centrífuguelos a 600 x g durante cinco minutos a 4 C.Deseche el sobrenadante con cuidado y disocie suavemente el pellet con golpeteo. Agregue 1 ml de tampón FACS para lavar las células a cada tubo etiquetado. Si es necesario, use el vórtice en la intensidad más baja para la disociación completa del pellet. Centrifugarlos a 600 x g durante cinco minutos a 4 C.Repita este paso dos veces más. Tres lavados en total. Pellets de células resuspend en 200 L de tampón FACS. Disociar suavemente completamente el pellet en cada tubo mediante el uso de vórtice. Y transfiera a 5 ml etiquetados para tubos de citómetro de flujo. Mantenga los tubos en hielo hasta que se analicen en el citómetro de flujo. Usando el software de citometría de flujo, cree un nuevo experimento. Haga clic en la muestra y se abrirá una lista de tubos. Haga doble clic y cámbiele el nombre. Coloque el tubo de control de autofluorescencia en el brazo del aspirador, moviendo la base con cuidado solo hacia la izquierda. Haga clic en Adquirir datos y, a continuación, en Registrar datos y, a continuación, seleccione la condición de detención deseada. Dibuje una puerta alrededor de las celdas de interés, excluyendo las células muertas y los escombros. Retire el tubo. Haga clic en Siguiente tubo y ejecute la muestra de control basal. Haga clic en Adquirir datos y, a continuación, en Record Data.Abra el software. Agregue los ejemplos mediante el botón de acción Agregar ejemplos. Haga clic en Agregar muestra.Seleccione la carpeta Fecha experimental y haga clic en Elegir.Haga doble clic en la primera muestra del área de trabajo, control de autofluorescencia en este caso. Dibuje una puerta poligonal para aislar la celda de interés, excluyendo las células muertas y los escombros. Cambiar la trama a un histograma. Haga doble clic dentro de la M

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Este video muestra un ensayo de citometría de flujo para cuantificar los niveles de ROS en organoides intestinales 3D obtenidos de ratones transgénicos que expresan GFP. Este método proporciona un modelo experimental in vitro para investigar la eficacia de los compuestos de prueba en la producción de ROS.

Ensayo de citometría de flujo para cuantificar el estrés oxidativo: un ensayo para cuantificar especies reactivas de oxígeno en organoides intestinales utilizando sondas fluorogénicas

Este video muestra la citometría de flujo para medir la absorción microglial de biopartículas fluorescentes después de la administración intravítrea en un ojo de ratón. La citometría de flujo detecta células vivas que expresan CD11b y distingue las células de microglía fagocítica que exhiben fluorescencia verde de otras células mieloides, incluidos los monocitos que expresan Ly6C y los neutrófilos que expresan Ly6G.

Medición de la absorción microglial de partículas fluorescentes administradas intravítreamente mediante citometría de flujo

fagocitosis microglial es crítica para el mantenimiento de la homeostasis del tejido e inadecuada función fagocítica se ha implicado en la patología. Sin embargo, la evaluación de la función de la microglia in vivo es un desafío técnico. Hemos desarrollado una técnica sencilla pero robusto para el seguimiento y cuantificar el potencial fagocítica de microglia en un entorno fisiológico con precisión.

La evaluación de la función retiniana Microglial fagocítica<em&gt; En Vivo</em&gt; El uso de un ensayo basado en citometría de flujo

Este estudio demuestra el uso de citometría de flujo para detectar la producción de (ROS) las especies reactivas de oxígeno resultante de la activación de la FcγR. Este método puede utilizarse para evaluar los cambios en el antimicrobiano y función de los fagocitos en respuesta a complejos inmunes, microorganismos opsonizadas o FcγR directa Cross-linking de señalización redox.

Medición de Cytometric del flujo de producción de ROS en los macrófagos en respuesta a Cross-linking FcγR

Describimos un método para utilizar citometría de flujo multiparámetro para detectar especies de oxígeno reactivo mitocondrial (ROS) en células hematopoyéticas sanas murinas (HSCCP) y células de leucemia a partir de un modelo de ratón de leucemia mieloide aguda (LMA) impulsada por MLL-AF9.

Análisis citométrico de flujo de especies de oxígeno reactivo mitocondrial en células hematopoyéticas de la muriña y células progenitoras y leucemia impulsada por MLL-AF9

Aquí, presentamos un protocolo para detectar especies totales de oxígeno reactivo celular (ROS) usando 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Este método puede visualizar la localización de ROS celular en células adherentes con un microscopio de fluorescencia y cuantificar la intensidad ROS con un lector de placas de fluorescencia. Este protocolo es simple, eficiente y rentable.

Detección de especies totales reactivas de oxígeno en células adherentes por 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Este protocolo describe la evaluación del estado redox subcelular específico del compartimento dentro de la célula. Una sonda fluorescente sensible al redox permite un análisis ratiométrico conveniente en las células intactas.

Evaluación de la oxidación celular utilizando una proteína fluorescente verde sensible al redox específica del compartimento subcelular

Aquí presentamos un método basado en citometría de flujo para la visualización y cuantificación de múltiples marcadores asociados a la senescencia en células individuales.

Detección simultánea basada en imágenes y citometría de flujo de múltiples marcadores de senescencia fluorescente en células cancerosas senescentes inducidas por terapia

En este trabajo se describe un protocolo para la cuantificación de modificaciones globales de histonas mediante citometría de flujo intranuclear en microglía cerebral aislada. El trabajo también contiene el protocolo de aislamiento de microglía que se utilizó para la recolección de datos.

Cuantificación de las modificaciones postraduccionales globales de histonas mediante citometría de flujo intranuclear en microglía cerebral de ratón aislada

Aquí presentamos dos protocolos para cuantificar el envolvimiento microglial de sinapsis positivas para vGLUT1 y sinaptosomas crudos marcados con pHRodo Red mediante citometría de flujo.

Cuantificación de la envolvimiento microglial de material sináptico mediante citometría de flujo

Aprende a cuantificar especies reactivas de oxígeno en células gliales de Müller utilizando la sonda DCFH-DA y citometría de flujo. Este protocolo reproducible facilita el estudio del estrés oxidativo en neurobiología.

Cuantificación de especies reactivas de oxígeno utilizando sonda de dicacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína y citometría de flujo en células gliales de Müller (Video) | JoVE Journal

Cuantificación de especies reactivas de oxígeno utilizando sonda de dicacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína y citometría de flujo en células gliales de Müller

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