Cuantificación de especies reactivas de oxígeno utilizando sonda de dicacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína y citometría de flujo en células gliales de Müller
13 de mayo de 2022
Aquí, proponemos un protocolo sistematizado, accesible y reproducible para detectar especies reactivas celulares de oxígeno (ROS) utilizando una sonda de dicacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína (DCFH-DA) en células gliales de Müller (MGC). Este método cuantifica los niveles totales de ROS celulares con un citómetro de flujo. Este protocolo es muy fácil de usar, adecuado y reproducible.
Existen varios métodos para medir la producción de ROS o estrés oxidativo en las células. Entre estos, la sonda de dicato de diclorofluoresceína 2'7'es una de las técnicas más utilizadas para medir directamente el estado redox. Esta sonda es lipofílica y no fluorescente. La difusión de esta sonda a través de la membrana celular permite que las esterasas intracelulares se escindan en los dos enlaces éster, produciendo un producto relativamente polar e impermeable a la membrana celular. Estas moléculas no fluorescentes se acumulan intracelularmente, y la posterior oxidación por ROS produce el producto altamente fluorescente diclorofluoresceína. La oxidación de la sonda es el producto de la acción de múltiples tipos de ROS. Que se puede detectar mediante citometría de flujo o microscopía confocal. En este artículo, hemos utilizado una sonda de diclorofluoresceína diacetato para medir y cuantificar ROS por citometría de flujo. Transfiera las placas de 6 pocillos a una campana de flujo laminar desde la incubadora. Aspirar el sobrenadante. Y lave las células una vez con PBS. Agregue 2 ml de DMEM sérico bajo por pozo. E incubar la placa de 6 pocillos durante dos horas en la incubadora. Trate las células con el antioxidante durante seis horas. Trate las células con el inductor de ROS, A o B, durante 30 minutos. Aspirar el sobrenadante. Y lave la célula tres veces con PBS para eliminar todos los estímulos. Apague la luz de la campana de flujo laminar y trabaje en la oscuridad. Añadir 1 ml de sonda de diclorofluoresceína de diacetato en DMEM sin rojo fenol. Añadir 1 ml de DMEM sin rojo fenol a las células de control de autofluorescencia de control. Incubar la placa de 6 pocillos durante 30 minutos en la incubadora. Transfiera las placas sobre hielo al laboratorio. Lave las células tres veces con 2 ml de PBS frío por pozo. Agregue 0.5 ml de tampón de separación en frío a cada pozo. Cosecha las células canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo usando una pipeta P1000. Recójalos en un tubo etiquetado de 1,5 ml. Y centrífuguelos a 600 x g durante cinco minutos a 4 C.Deseche el sobrenadante con cuidado y disocie suavemente el pellet con golpeteo. Agregue 1 ml de tampón FACS para lavar las células a cada tubo etiquetado. Si es necesario, use el vórtice en la intensidad más baja para la disociación completa del pellet. Centrifugarlos a 600 x g durante cinco minutos a 4 C.Repita este paso dos veces más. Tres lavados en total. Pellets de células resuspend en 200 L de tampón FACS. Disociar suavemente completamente el pellet en cada tubo mediante el uso de vórtice. Y transfiera a 5 ml etiquetados para tubos de citómetro de flujo. Mantenga los tubos en hielo hasta que se analicen en el citómetro de flujo. Usando el software de citometría de flujo, cree un nuevo experimento. Haga clic en la muestra y se abrirá una lista de tubos. Haga doble clic y cámbiele el nombre. Coloque el tubo de control de autofluorescencia en el brazo del aspirador, moviendo la base con cuidado solo hacia la izquierda. Haga clic en Adquirir datos y, a continuación, en Registrar datos y, a continuación, seleccione la condición de detención deseada. Dibuje una puerta alrededor de las celdas de interés, excluyendo las células muertas y los escombros. Retire el tubo. Haga clic en Siguiente tubo y ejecute la muestra de control basal. Haga clic en Adquirir datos y, a continuación, en Record Data.Abra el software. Agregue los ejemplos mediante el botón de acción Agregar ejemplos. Haga clic en Agregar muestra.Seleccione la carpeta Fecha experimental y haga clic en Elegir.Haga doble clic en la primera muestra del área de trabajo, control de autofluorescencia en este caso. Dibuje una puerta poligonal para aislar la celda de interés, excluyendo las células muertas y los escombros. Cambiar la trama a un histograma. Haga doble clic dentro de la M
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Resumen
Este estudio presenta un protocolo para detectar los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) celulares utilizando la sonda 2′,7′-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-DA) en células gliales de Müller (MGC). El método está diseñado para ser accesible y reproducible, y cuantifica el ROS mediante citometría de flujo.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Celular
- Estrés Oxidativo
- Neurociencia
Antecedentes
- Las especies reactivas de oxígeno (ROS) desempeñan un papel fundamental en diversos procesos celulares.
- La medición de ROS es esencial para comprender el estrés oxidativo en las células.
- La sonda DCFH-DA es un método ampliamente utilizado para detectar ROS.
- El protocolo enfatiza la reproducibilidad y facilidad de uso.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo claro para detectar ERO en células gliales de Müller.
- Permitir la cuantificación del estrés oxidativo en células neuronales.
- Facilitar la investigación sobre el papel de las ERO en la función glial y la neurobiología.
Métodos Utilizados
- Se realizó el cultivo celular de células gliales de Müller para crear el modelo biológico.
- Las células fueron tratadas con antioxidantes e inductores de ERO para evaluar los niveles de ERO.
- La sonda DCFH-DA fue utilizada para la detección de ERO y cuantificada mediante citometría de flujo.
- Los pasos críticos incluyeron lavar las células con PBS y controlar la exposición a la luz durante los ensayos.
Resultados principales
- El protocolo midió eficazmente los niveles celulares de ERO en las células gliales de Müller.
- La citometría de flujo proporcionó un análisis cuantitativo de la acumulación de ERO.
- Los resultados confirmaron la viabilidad de utilizar la sonda DCFH-DA bajo las condiciones especificadas.
Conclusiones
- Este estudio establece un método confiable para evaluar el estrés oxidativo en células gliales.
- El protocolo simplifica la medición de ERO, mejorando el acceso para los investigadores.
- Los hallazgos tienen implicaciones para comprender el estrés oxidativo en neurobiología y posibles dianas terapéuticas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La medición cuantitativa de especies reactivas de oxígeno (ROS) en células gliales de Müller mediante DCFH-DA y citometría de flujo permite una evaluación rigurosa de los mecanismos de estrés oxidativo relacionados con modelos de enfermedades neurodegenerativas y retinianas. Esta capacidad apoya la validación temprana de dianas y la reducción del riesgo mecanicista en la modulación de vías antioxidantes. La cuantificación confiable de ROS orienta las decisiones sobre carteras de moléculas candidatas dirigidas al equilibrio redox en sistemas relevantes para la enfermedad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la evaluación de la activación de la vía antioxidante y la modulación redox en modelos de células gliales.
- Apoya la validación funcional de dianas implicadas en el estrés oxidativo y los mecanismos de defensa celular.
- Proporciona una reducción mecanicista de riesgos para intervenciones candidatas que afectan los niveles de ERO.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Facilita la preparación de sistemas celulares validados para la selección de compuestos frente a puntos finales de estrés oxidativo.
- Proporciona lecturas cuantitativas estandarizadas de ERO adecuadas para la reproducibilidad del ensayo y la comparación entre estudios.
- Permite la evaluación confiable de los efectos de compuestos antioxidantes o prooxidantes en un formato escalable.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con modelos relevantes para enfermedades de patologías retinianas que implican estrés oxidativo, como la retinopatía diabética.
- Apoya la continuidad traslacional al vincular la modulación de ERO in vitro con estrategias preclínicas de biomarcadores.
- Proporciona información para el avance ajustado al riesgo de candidatos antioxidantes basado en resultados celulares cuantitativos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este protocolo de cuantificación de ERO se sitúa en la fase de descubrimiento temprano hasta la identificación de fármacos líderes, apoyando tanto la comprobación de hipótesis como la integración en cribados posteriores.
- Biología del Descubrimiento: Proporciona evidencia cuantitativa de la participación de las vías redox y la respuesta celular ante agresiones oxidativas.
- Tamizaje: Ofrece mediciones reproducibles de ERO basadas en citometría de flujo para la selección de compuestos.
- Análisis: Permite la comparación estadística de los niveles de ERO entre diferentes condiciones experimentales mediante la intensidad geométrica media de fluorescencia.
- Investigación Traducional: Conecta la modulación del estrés oxidativo in vitro con puntos finales relevantes para enfermedades en modelos retinianos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma estandarizada de ensayo de ERO adaptable a diversos tipos celulares y agentes moduladores del estado redox.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en el descubrimiento dirigido a procesos redox y reduce la ambigüedad mecanicista.
- Valor operativo: Proporciona una cuantificación estandarizada, escalable y reproducible de las especies reactivas de oxígeno (ROS) para flujos de trabajo entre equipos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción para moduladores de vías antioxidantes y aumenta la eficiencia del capital.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de candidatos dirigidos a mecanismos de estrés oxidativo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la operación de citometría de flujo y análisis de datos.
- Necesita acceso a instrumentación de citometría de flujo y software de análisis compatible.
- Exige estandarización entre equipos de los protocolos de selección de poblaciones celulares (gating) y cuantificación de fluorescencia.
- Adaptable a otros modelos celulares con optimización del protocolo para la carga del sonda y controles.
- Depende de un manejo riguroso de las muestras para minimizar la variabilidad del ensayo y los artefactos inducidos por la luz.
