Name: Explorando el metabolismo energético mitocondrial de esferoides de microtissue 3D individuales utilizando el análisis de flujo extracelular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Aprende a analizar el metabolismo energético mitocondrial en esferoides 3D individuales mediante análisis de flujo extracelular Seahorse. Este protocolo ofrece un modelo fisiológico superior para investigación oncológica y descubrimiento de fármacos.

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N.J.C fue apoyado por un premio BBSRC MIBTP CASE con Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003)

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Principales conclusiones y productos Este artículo proporciona un protocolo detallado para sondear el metabolismo energético mitocondrial de esferoides 3D individuales utilizando una serie de líneas celulares derivadas del cáncer con el analizador XFe96 XF. Se desarrolla y describe un método para el cultivo rápido de esferoides celulares A549, HepG2 /C3A, MCF7 y SK-OV-3 utilizando tecnologías repelentes celulares para la agregación forzada. Este protocolo aborda muchas consideraciones sobre el sondeo ...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/63346">Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis</a>. The Representative Results section was updated.
Figure 5 was updated from:
<img alt="Oxygen consumption rate (OCR) graphs with oligomycin effects on A549, HepG2/C3A, MCF-7, SK-OV-3 cells." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63346/63346fig05.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63346/63346fig05large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Oligomycin effect on OCR in cancer cell lines; comparison graph; metabolic activity analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63346/63346fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63346/63346fig5v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63346">Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis</a>. The Representative Results&#160;section was&#160;updated.

Erratum: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis

Los avances en los modelos in vitro en la investigación biológica han progresado rápidamente en los últimos 20 años. Tales modelos ahora incluyen modalidades de órgano en un chip, organoides y esferoides de microtejido 3D, todos los cuales se han convertido en un enfoque común para mejorar la traducción entre estudios in vitro e in vivo. El uso de modelos in vitro avanzados, particularmente esferoides, abarca varios campos de investigación, incluida la ingeniería de tejidos, la investigación con células madre, el cáncer y la biología de enfermedades 1,2,3,4,5,6,7 y las pruebas de seguridad, incluida la toxicología genética 8,9,10, la toxicología de nanomateriales 11, 12,13,14, y pruebas de seguridad y eficacia de medicamentos 8,15,16,17,18,19.
La morfología celular normal es crítica para el fenotipo y la actividad biológica. El cultivo de células en esferoides microtisulares 3D permite a las células adoptar una morfología, función fenotípica y arquitectura, más parecida a la observada in vivo pero difícil de capturar con las técnicas clásicas de cultivo celular monocapa. Tanto in vivo como in vitro, la función celular se ve directamente afectada por el microambiente celular, que no se limita a la comunicación y programación celular (por ejemplo, formaciones de unión célula-célula, oportunidades para formar nichos celulares); exposición celular a hormonas y factores de crecimiento en los entornos inmediatos (por ejemplo, exposición a citoquinas celulares como parte de una respuesta inflamatoria); composición de matrices físicas y químicas (por ejemplo, si las células se cultivan en plástico de cultivo de tejidos rígidos o en un entorno de tejido elástico); y lo más importante, cómo el metabolismo celular se ve afectado por la nutrición y el acceso al oxígeno, así como por el procesamiento de productos de desecho metabólicos como el ácido láctico.
El análisis de flujo metabólico es una forma poderosa de examinar el metabolismo celular dentro de sistemas in vitro definidos. Específicamente, la tecnología XF permite el análisis de cambios en vivo y en tiempo real en la bioenergética celular de células y tejidos intactos. Dado que muchos eventos metabólicos intracelulares ocurren del orden de segundos a minutos, los enfoques funcionales en tiempo real son primordiales para comprender los cambios en tiempo real en el flujo metabólico celular en células y tejidos intactos in vitro.
Este artículo proporciona protocolos para cultivar líneas celulares derivadas del cáncer A549 (adenocarcinoma de pulmón), HepG2/C3A (carcinoma hepatocelular), MCF-7 (adenocarcinoma de mama) y SK-OV-3 (adenocarcinoma de ovario) como modelos de esferoides 3D in vitro utilizando enfoques de agregación forzada (Figura 1). También (i) describe en detalle cómo sondear el metabolismo energético mitocondrial de esferoides 3D individuales utilizando el analizador XF Agilent XFe96, (ii) destaca formas de optimizar los ensayos XF utilizando esferoides 3D individuales, y (iii) discute consideraciones y limitaciones importantes de sondear el metabolismo de los esferoides 3D utilizando este enfoque. Lo más importante es que este artículo describe cómo se recopilan los conjuntos de datos que permiten el cálculo de la tasa de consumo de oxígeno (OCR) para determinar la fosforilación oxidativa y, por lo tanto, la función mitocondrial en los esferoides celulares. Aunque no se analiza para este protocolo, la tasa de acidificación extracelular (ECAR) es otro parámetro que se mide junto con los datos de OCR en experimentos XF. Sin embargo, ECAR a menudo se interpreta de manera deficiente o incorrecta a partir de conjuntos de datos XF. Proporcionamos un comentario sobre las limitaciones del cálculo de ECAR siguiendo los enfoques básicos del fabricante de la tecnología.

<table><tbody><tr><td>A549</td><td>ECACC</td><td>&nbsp;#86012804</td><td>Línea celular de carcinoma de pulmón</td></tr><tr><td>Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>103576-100 Medio de</td><td>ensayo XF con 1 mM de HEPES, sin rojo de fenol, bicarbonato de sodio, glucosa, L-glutamina y piruvato de sodio</td></tr><tr><td>Analizador de flujo extracelular Agilent Seahorse XFe96</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>-</td><td>Instrumento para medir las tasas de absorción de oxígeno de los esferoides en esferoides individuales</td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Merck Life Science</td><td>A8674</td><td>Inhibidor del complejo respiratorio mitocondrial III</td></tr><tr><td>BAM15</td><td>TOCRIS bio-techne</td><td>5737</td><td>Desacoplador de protnóforos mitocondriales</td></tr><tr><td>Microplaca de pared negra</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655076</td><td>Para ensayos</td></tr> <tr><td>basados en fluorescenciaCELLSTAR superficie repelente de células 96 U microplacas de pocillo</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td>Microplacas para la generación de esferoides</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Ensayo de viabilidad celular 3D</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td>Ensayo para la determinación de la viabilidad celular en esferoides de microtejidos 3D</td></tr><tr><td>Cultrex Poly-D-Lysine</td><td>R& D Systems una marca de biotecnología</td><td>3439-100-01</td><td>Adhesivo de células moleculares para el recubrimiento de microplacas de esferoides XFe96 para facilitar la fijación de esferoides</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Merck Life Sciences</td><td>G8270</td><td>Suplemento para el crecimiento de cultivos celulares y medio de ensayo XF</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Medio Eagle modificado (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11885084</td><td>Medio de cultivo para esferoides HepG2/C3A</td></tr><tr><td>Sistema de imagen EVOS XL Core</td><td>Microscopio de imagen de contraste de fase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>AMEX1000 EZ-PCR Kit de prueba de micoplasma</td><td>Biological Industries</td><td>20-700-20</td><td>Cribado de micoplasma en cultivos celulares</td></tr><tr><td>FIJI es solo una imagen J</td><td></td><td></td><td>Análisis de imágenes cotejadas</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Merck Life Science</td><td>F7524</td><td>Suplemento para medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>HepG2/C3A</td><td>ATCC</td><td>&nbsp;#CRL-10741</td><td>Línea celular de carcinoma hepático, un derivado clonal de la línea celular madre HepG2</td></tr><tr><td>Lactato-Glo</td><td>Promega</td><td>J5021</td><td>Ensayo para la medición de lactato en medio de cultivo de esféricos</td></tr><tr><td>L-glutamina (solución de 200 mM)</td><td>Merk Life Sciences</td><td>G7513</td><td>Suplemento para el crecimiento de cultivos celulares y medio de ensayo XF</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico M50</td><td>Microsytems Leica</td><td></td><td>LEICAM50 Micrcopio de disección estereoscópico; utilizado para el manejo de esféricos</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ECACC</td><td>#86012803</td><td>Línea celular de adenocarcinoma de mama</td></tr><tr><td>Oligomicina de Streptomyces diastatochromogenes</td><td>Merck Life Science</td><td>O4876</td><td>Inhibidor de la ATP sintasa</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Antibióticos añadidos al medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Kit</td><td>Initrogen</td><td>P7589</td><td>Análisis de dsDNA en esferoides</td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Merck Life Science</td><td>R8875</td><td>Inhibidor del complejo respiratorio mitocondrial</td></tr><tr><td>I RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875091</td><td>Medio de cultivo para A549, MCF7 y SK-OV-3 esferoides</td></tr><tr><td>Seahorse Analytics</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>Construcción 421</td><td>https://seahorseanalytics.agilent.com</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>102905-100</td><td>Cada Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contiene: 6 microplacas de esferoides Seahorse XFe96 (102978-100), 6 cartuchos de sensor XFe96 y 1 frasco de Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000)</td></tr><tr><td>Pipeta serológica: 5, 10 y 25 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606107; 607107; 760107</td><td>Consumibles para cultivo celular</td></tr><tr><td>SK-OV-3</td><td>ECACC</td><td>#HTB-77</td><td>Línea</td></tr> <tr><td>celular de adenocarcinoma de ovarioPiruvato de sodio (solución de 100 mM)</td><td>Merck Life Science</td><td>S8636</td><td>Suplemento para el crecimiento de cultivos celulares y medio de ensayo XF</td></tr><tr><td>T75 cm2 matraz de cultivo celular</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td>Matraces tratados con cultivo de tejidos para el mantenimiento de cultivos celulares</td></tr><tr><td>TrypLExpress</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td>Reactivo de disociación celular</td></tr><tr><td>Software de control de ondas</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Punta de orificio ancha</td><td>STARLAB International GmbH</td><td>E1011-8400</td><td>Puntas de pipeta con amplia apertura para la manipulación de esferoides</td></tr></tbody></table>

explorando el metabolismo energético mitocondrial de esferoides de microtissue 3d individuales utilizando el análisis de flujo extracelular

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Los agregados celulares tridimensionales (3D), denominados esferoides, se han convertido en la vanguardia del cultivo celular in vitro en los últimos años. En contraste con el cultivo de células como monocapas bidimensionales de una sola célula (cultivo 2D), el cultivo celular esferoide promueve, regula y apoya la arquitectura celular fisiológica y las características que existen in vivo, incluida la expresión de proteínas de matriz extracelular, señalización celular, expresión génica, producción de proteínas, diferenciación y proliferación. La importancia del cultivo 3D ha sido reconocida en muchos campos de investigación, incluyendo oncología, diabetes, biología de células madre e ingeniería de tejidos. Durante la última década, se han desarrollado métodos mejorados para producir esferoides y evaluar su función metabólica y destino.
Los analizadores de flujo extracelular (XF) se han utilizado para explorar la función mitocondrial en microtejidos 3D, como los esferoides, utilizando una placa de captura de islotes XF24 o una microplaca esferoide XFe96. Sin embargo, no se han descrito en detalle distintos protocolos y la optimización del sondeo del metabolismo energético mitocondrial en esferoides utilizando la tecnología XF. Este artículo proporciona protocolos detallados para sondear el metabolismo energético mitocondrial en esferoides 3D individuales utilizando microplacas esferoides con el analizador XFe96 XF. Utilizando diferentes líneas celulares de cáncer, se ha demostrado que la tecnología XF es capaz de distinguir entre la respiración celular en esferoides 3D no solo de diferentes tamaños, sino también de diferentes volúmenes, números de células, contenido y tipo de ADN.
Las concentraciones óptimas del compuesto efector mitocondrial de oligomicina, BAM15, rotenona y antimicina A se utilizan para sondear parámetros específicos del metabolismo energético mitocondrial en esferoides 3D. Este documento también discute los métodos para normalizar los datos obtenidos de los esferoides y aborda muchas consideraciones que deben considerarse al explorar el metabolismo de los esferoides utilizando la tecnología XF. Este protocolo ayudará a impulsar la investigación en modelos avanzados de esferoides in vitro .

Para obtener esferoides compactos y bien formados, cada línea celular se optimizó individualmente para la densidad de siembra y la duración del cultivo (Figura 3). Las líneas celulares A549, HepG2/C3A y SK-OV-3 inicialmente formaron agregados sueltos que no progresaron a esferoides redondos con perímetros claramente definidos hasta después de 7 días en cultivo. Por el contrario, las células MCF-7 podrían formar esferoides en 3 días. Hubo una clara correlación entre la densidad inicial de sie...

Estos protocolos ayudarán a los usuarios a sondear el metabolismo energético mitocondrial en esferoides derivados de líneas celulares de cáncer 3D utilizando el análisis de flujo extracelular Seahorse.

Explorando el metabolismo energético mitocondrial de esferoides de microtissue 3D individuales utilizando el análisis de flujo extracelular

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Nuestro protocolo permite a los investigadores sondear el metabolismo energético mitocondrial y los esferoides sin fisuras para permitir que se realicen comparaciones entre varias líneas celulares diferentes, números celulares y fenotipos, así como tratamientos farmacológicos en un campo de descubrimiento de fármacos e investigación del cáncer. Nuestro trabajo presenta un protocolo detallado para explorar el metabolismo energético mitocondrial utilizando esferoides 3D que proporcionan el modelo fisiológico superior en comparación con los experimentos de monocapa celular. Las observaciones biológicas podrían extrapolar de un esferoide vítreo a tumores in vivo e identificar vías que pueden dirigirse al metabolismo del tumor esferoide.Por ejemplo, la utilidad de los carbohidratos durante el crecimiento de los esferoides. Todos los datos del instrumento de flujo extracelular 96 son muy sensibles. El posicionamiento in vitro de los esferoides dentro de la placa de ensayo es primordial para obtener datos precisos a nivel de esferoide único.Compruebe la viabilidad de los esferoides utilizando un microscopio de luz invertida con contraste de fase a un aumento de 4x para garantizar la estructura esferoide intacta, la morfología y la uniformidad general entre las muestras. Para hidratar el cartucho del sensor, alícuota aproximadamente 20 mililitros del calibrante en un tubo cónico. Coloque el tubo cónico que contiene el calibrante en una incubadora sin dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante la noche.Saque el contenido del kit de ensayo. Coloque el cartucho del sensor boca abajo junto a la placa de utilidad. Pipetear 200 microlitros de agua destilada doble estéril en cada pozo de la placa de servicio utilizando una pipeta P300 multicanal.Coloque el cartucho del sensor en la parte superior de la placa de utilidad. Compruebe si el nivel de agua en cada pozo es lo suficientemente alto como para sumergir las sondas del sensor. Transfiera el cartucho del sensor ensamblado a una incubadora de 37 grados Celsius sin dióxido de carbono y déjelo durante la noche.Para recubrir la microplaca de ensayo de esferoides, agregue 30 microlitros de 0,1 miligramos estériles por mililitro de solución de poli-D-lisina por pocillo de microplaca esferoide utilizando una técnica séptica. Aspire la solución de cada pocillo de la microplaca esferoide, invierta la placa y tóquela firmemente sobre papel de seda para eliminar cualquier solución residual. Lavar cada pocillo de la placa con 200 microlitros de agua estéril doble destilada.Después del lavado final, invierta la microplaca y cúbrala firmemente sobre papel de seda para eliminar el agua residual. Deje que la placa se seque al aire durante 30 minutos antes de su uso futuro. Prepare el medio XF RPMI como se describe en el manuscrito.Precalentar el medio de ensayo XF RPMI suplementado a 37 grados Celsius una hora antes del ensayo. Y precalentar la microplaca de ensayo de esferoides recubiertos en una incubadora de 37 grados Celsius sin dióxido de carbono. Saque el tubo cónico que contiene el calibrante y el cartucho del sensor de la incubadora de aire.Retire el cartucho del sensor de la placa de utilidad y colóquelo boca abajo en la superficie de trabajo. Usando una pipeta multicanal P300, aspire el agua de la placa de servicio y deséchela. Agregue 200 microlitros del calibrante precalentado a cada pozo de la placa de utilidad.Coloque el cartucho del sensor en la placa de utilidad asegurándose de que los sensores estén bien sumergidos en el calibrante. Transfiera el cartucho del sensor ensamblado a la incubadora de 37 grados Celsius sin dióxido de carbono hasta que esté listo para cargar las soluciones de inyección de puerto. Saque la placa de cultivo de esferoides de la incubadora y observe los esferoides bajo el microscopio para garantizar su integridad antes de los pasos de transferencia de esferoides.Cargue 180 microlitros de medio de ensayo precalentado en cada pozo de la placa esferoide, incluidos los pozos de corrección de fondo. Llene parcialmente una placa de Petri de siete centímetros con tres mililitros del medio de ensayo. Transfiera los esferoides de la placa de cultivo de 96 pozos a una placa de Petri, utilizando una pipeta multicanal cargada con puntas de pipeta de orificio ancho y un volumen ajustado a 10 a 50 microlitros.Ajuste el volumen de un pipeteador de un solo canal equipado con una punta de pipeta de orificio ancho a 20 microlitros y aspire cuidadosamente un solo esferoide. Coloque la punta directamente en el centro de cada pozo de esta microplaca de ensayo de esferoides y permita que la acción capilar retire el esferoide de la punta de la pipeta. Confirme la evolución bajo el microscopio mediante el pipeteo del contenido del pipeteador en la placa de Petri.Una vez que todos estos esferoides se hayan transferido a la microplaca de ensayo de esferoides, transfiera la placa a una incubadora de 37 grados Celsius sin dióxido de carbono durante un mínimo de una hora. Prepare las concentraciones de material de trabajo de cada compuesto como se describe en el manuscrito, utilizando un medio de ensayo XF RPMI precalentado completamente complementado. Dispensó 20 microlitros de la solución de trabajo de cada compuesto en todos los puertos correspondientes utilizando una pipeta multicanal P100 calibrada.Prepare el analizador para cargar el cartucho del sensor. Para obtener esferoides compactos bien formados, cada línea celular se optimizó individualmente para la densidad de siembra y la duración del cultivo. En las estrategias de siembra optimizadas, el volumen de esferoides para SK-OV-3 fue de alrededor de 5,46 x 10 a los siete micrómetros cúbicos en cubos y para A549, fue de 1,45 x 10 a ocho micrómetros cúbicos.Todos los tipos de esferoides tenían una correlación lineal entre la densidad de siembra inicial y el volumen esferoide. La simetría esferoide perfecta tenía una circularidad de 1.0 y una desviación de 1.0 indicaba una pérdida de circularidad. Para todos los tipos de esferoides, la tasa de consumo de oxígeno aumentó con el tamaño de los esferoides y se correlacionó linealmente con el volumen de esferoides con el más alto en los esferoides MCF-7 y el más bajo en los esferoides SK-OV-3.Los esferoides MCF-7 no respondieron al control del vehículo durante todo el experimento. La tasa de consumo de oxígeno en los esferoides MCF-7 se redujo con oligomicina después de cinco ciclos de medición después de la primera inyección de 0,5 microgramos por mililitro. En respuesta a BAM15, la tasa de consumo de oxígeno aumentó antes de la segunda inyección.Mientras que la combinación de rotenona más antimicina A lo redujo. Un protocolo para sondear con precisión la respiración mitocondrial basal. La respiración por fosforilación de ADP, la respiración por fugas, la eficiencia de acoplamiento, la capacidad respiratoria máxima y la capacidad respiratoria sobrante se desarrollaron utilizando esferoides 3D derivados del cáncer.Todos los compuestos respiratorios produjeron los perfiles de tasa de consumo de oxígeno cinético esperado para los compuestos seleccionados, revelando una tasa de respiración basal constante promedio de 20 a 30 picomoles de oxígeno por minuto, por pozo. Ubicación de los esferoides dentro de la microplaca y número de ciclo de medición después de la inyección del compuesto para garantizar que las tasas de respiración sean estables entre las adiciones de compuestos. Al explorar la capacidad respiratoria mitocondrial con desacopladores, no solo la concentración es clave, sino también su capacidad para desacoplar la respiración en presencia de oligomicina, que generalmente se agrega antes que el desacoplador en experimentos que investigan el metabolismo energético mitocondrial.

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Investigación

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Cancer Research

Investigación del cáncer

Una descripción de un método para crear perfiles de la función mitocondrial en las células se proporciona. El perfil de las mitocondrias generan proporciona cuatro parámetros de la función mitocondrial que se puede medir en un experimento: la tasa de respiración basal, la respiración ATP-linked, fuga de protones, y la capacidad de reserva.

Experimento perfil bioenergético utilizando células C2C12 mioblastos

Este protocolo describe la técnica para realizar el ensayo de flujo extracelular en esferoides 3D generados a partir del cocultivo de células de cáncer de páncreas (Patu8902) y fibroblastos pancreáticos activados (PS1) para medir las dos principales vías productoras de energía, la glucólisis y la respiración mitocondrial.

Ensayo de flujo extracelular en esferoides 3D: un método para medir la actividad metabólica de los esferoides de tumores pancreáticos

Aquí, se describe un método para la preparación de la cultura de co de 3 dimensiones (3D) esferoide de células de cáncer de páncreas y fibroblastos, seguidos por la medida de las funciones metabólicas utilizando un analizador de flujo extracelular.

Preparación y análisis metabólico de 3 dimensiones del esferoide co-cultivos de células de cáncer de páncreas y fibroblastos

Esta técnica describe la grabación en tiempo real del consumo de oxígeno y los tipos de acidificación extracelular en los tejidos retinianos explanted ratón utilizando un analizador de flujo extracelular.

Medición del metabolismo energético en el tejido retiniano Explanted utilizando el análisis de flujo extracelular

El objetivo de este protocolo es ilustrar cómo utilizar cardiomiocitos neonatales de ratón como modelo para analizar cómo diversos factores pueden alterar el consumo de oxígeno en el corazón.

Analizando la tasa de consumo de oxígeno en los cardiomiocitos neonatales primario de ratón cultivadas utilizando un analizador de flujo extracelular

En este trabajo, describimos un protocolo modificado para probar el flujo del sustrato respiratorio mitocondrial utilizando perfringolisina O recombinante en combinación con respirometría basada en microplacas. Con este protocolo, mostramos cómo la metformina afecta la respiración mitocondrial de dos líneas celulares tumorales diferentes.

Medición del flujo de sustrato mitocondrial en células perfrendolisaminas o-permeabilizadas recombinantes

El método presentado aquí resume los protocolos optimizados para evaluar la bioenergética celular en células madre hematopoyéticas de ratón no adherentes y células progenitoras primitivas (HSPC) utilizando el analizador de flujo extracelular para medir la tasa de acidificación extracelular (ECAR) y la tasa de consumo de oxígeno (OCR) de los HSPC en tiempo real.

Evaluación de la bioenergética celular en células madre hematopoyéticas de ratón y células progenitoras primitivas utilizando el analizador de flujo extracelular

Describimos protocolos paso a paso que miden la respiración mitocondrial de neutrófilos de ratón y humanos y células HL60 utilizando el analizador de flujo extracelular metabólico.

Medición en tiempo real del perfil bioenergético mitocondrial de neutrófilos

Aquí, describimos en detalle los métodos para extraer macrófagos de la médula ósea, el bazo y el corazón infartado, y posteriormente evaluar el flujo metabólico en células vivas.

Análisis del flujo metabólico ex vivo en macrófagos esplénicos y cardíacos y monocitos de médula ósea

Aquí, establecemos una plataforma de perfiles metabólicos que integra esferoides de glioma tridimensionales (3D) y normalización basada en imágenes a través del análisis de flujo extracelular. Este enfoque permite una evaluación más precisa de las respuestas metabólicas de los tumores a los tratamientos farmacológicos y proporciona información sobre los posibles mecanismos de resistencia.

Avances en el perfil metabólico de esferoides tumorales cerebrales tridimensionales para la detección de fármacos

Este protocolo describe una forma rentable de realizar una prueba de esfuerzo de glucólisis para cuantificar la reprogramación metabólica en microglías primarias del ratón. Tras el aislamiento y la estimulación inflamatoria, se mide la tasa de acidificación extracelular (ECAR) utilizando reactivos recién preparados y ajustados con pH, seguida de la normalización de proteínas para permitir una evaluación precisa y reproducible de los desplazamientos glicolíticos.

Investigación de la glucólisis en la microglía primaria mediante ensayo de flujo extracelular

Aprende a analizar el metabolismo energético mitocondrial en esferoides 3D individuales mediante análisis de flujo extracelular Seahorse. Este protocolo ofrece un modelo fisiológico superior para investigación oncológica y descubrimiento de fármacos.

Explorando el metabolismo energético mitocondrial de esferoides de microtissue 3D individuales utilizando el análisis de flujo extracelular (Video) | JoVE Journal

Explorando el metabolismo energético mitocondrial de esferoides de microtissue 3D individuales utilizando el análisis de flujo extracelular

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