Name: Aislamiento de células madre mesenquimales del tejido adiposo de rata para la diferenciación en células productoras de insulina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Aprende a aislar células madre mesenquimales de tejido adiposo de rata y diferenciarlas en células productoras de insulina. Este protocolo sencillo facilita la investigación en medicina regenerativa y tratamientos para diabetes.

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Reconocemos al Dr. Rawda Samir Mohamed, MSc, Especialista Veterinario, Facultad de Farmacia, Universidad Británica de Egipto (BUE) por ayudar con la disección de las ratas.
También nos gustaría reconocer y apreciar los esfuerzos de la Facultad de Comunicación de Masas, la Universidad Británica en Egipto (BUE) para la producción y edición del video de este manuscrito.
Nos gustaría agradecer a la señorita Fatma Masoud, MSc, profesora asistente de inglés, La Universidad Británica de Egipto (BUE) por la revisión y revisión en inglés del manuscrito.
Este trabajo fue parcialmente financiado por el Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CDRD), Facultad de Farmacia, La Universidad Británica de Egipto (BUE), El Cairo, Egipto.

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</ol>

Todos los coautores declaran que no hay conflicto de intereses asociado con este trabajo.

En este protocolo, logramos presentar un protocolo detallado para el aislamiento de Ad-MSCs de grasa epidídima de rata y la diferenciación de estos Ad-MSCs en IPC. De hecho, la grasa epidídima de rata es una fuente fácilmente alcanzable de tejido adiposo para la obtención de Ad-MSC y no requiere ningún equipo especial, ni para la recolección ni para el procesamiento 15,26,27. Las MSC Ad aisladas mostraron una excelente expansión...

Las células madre mesenquimales (MSC), también conocidas como células del estroma mesenquimal, se encuentran entre los tipos de células más utilizados para la medicina regenerativa 1,2. Se clasifican como células madre adultas y se caracterizan por un potencial de diferenciación multilinaje y capacidad de autorrenovación3. Las MSC se pueden aislar y obtener de diversas fuentes, incluyendo tejido adiposo, médula ósea, sangre periférica, tejido y sangre del cordón umbilical, folículos pilosos y dientes 4,5.
El aislamiento de las células madre del tejido adiposo se considera atractivo y prometedor debido a su fácil acceso, rápida expansión in vitro y alto rendimiento6. Las células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (Ad-MSC) se pueden aislar de diferentes especies como humanos, bovinos, ratones, ratas y, más recientemente, cabras7. Se ha demostrado que las MSC Ad son ahora candidatos potenciales para la ingeniería de tejidos y la terapia génica / celular que incluso se pueden utilizar para desarrollar una alternativa autóloga para la reparación a largo plazo de lesiones o defectos de tejidos blandos 7,8.
La Sociedad Internacional de Terapia Celular y Génica (ISCT) ha definido tres criterios mínimos que deben ser exhibidos por las MSC para la caracterización completa9. Primero, deben ser adherentes al plástico. En segundo lugar, las MSC deben expresar marcadores de superficie de células madre mesenquimales como CD73, CD90 y CD105 y carecer de expresión de los marcadores hematopoyéticos CD45, CD34, CD14 o CD11b, CD79α o CD19 y HLA-DR. Finalmente, las MSC deben exhibir la capacidad de diferenciarse en los tres linajes mesenquimales: adipocitos, osteocitos y condrocitos. Curiosamente, las MSC también pueden diferenciarse en otros linajes como células neuronales, cardiomiocitos, hepatocitos y células epiteliales10,11.
De hecho, las MSC poseen propiedades únicas que les permiten ser aplicadas como agentes terapéuticos potenciales en la terapia regenerativa para diferentes enfermedades. Las MSC pueden secretar factores solubles para inducir un ambiente inmunomodulador que proporciona beneficios terapéuticos12. Además, las MSC pueden migrar hacia sitios de lesión y microambientes tumorales para administrar terapia dirigida; sin embargo, los mecanismos no están completamente dilucidados13. Además, las MSC tienen la capacidad de secretar exosomas, vesículas extracelulares en la nanoescala que transportan una carga de ARN no codificantes, proteínas y factores solubles, que últimamente surgieron como un nuevo mecanismo del potencial terapéutico de las MSC en diversas enfermedades14.
Más importante aún, las MSC han generado una marcada atención por su potencial para diferenciarse en células productoras de insulina (IPC), ya sea por modificación genética15,16 o mediante la utilización de varios factores inductores extrínsecos dentro de los medios de cultivo in vitro17. El período de inducción de IPC varía mucho, ya que depende del protocolo de inducción utilizado y de los factores extrínsecos utilizados. El proceso de diferenciación puede durar de días a meses, y requiere una combinación de factores exógenos inductores que deben agregarse y / o retirarse en diferentes etapas. Muchos de estos factores que se han utilizado para la diferenciación pancreática endocrina son compuestos biológicamente activos que han demostrado promover la proliferación o diferenciación/neogénesis de las células β secretoras de insulina y/o aumentar el contenido de insulina de los IPC 18,19,20,21. Cabe destacar aquí que también se ha informado que las MSC tienen efectos terapéuticos en la diabetes y sus complicaciones a través de varios mecanismos, incluido su secretoma, así como una amplia gama de acciones inmunomoduladoras 22,23,24.
En este protocolo, presentamos un protocolo paso a paso detallado para el aislamiento y caracterización de Ad-MSC a partir de grasa epidídima de rata, seguido de un protocolo simple y relativamente corto para la generación de IPC a partir de Ad-MSC.

<table><tbody><tr><td>Albúmina, suero bovino Fracción V</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azul alcián 8GX</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>A3157</td><td></td></tr><tr><td>Rojo de alizarina S</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de amonio</td><td>Fisher Scientific, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo para rata CD90, FITC</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>60024FI</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3912</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Fisher Scientific, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal CD105, FITC</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, EE. UU.</td><td>MA1-19594</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal CD34</td><td>Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, EE. UU.</td><td>PA5-85917</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Fisher Scientific, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa tipo I, polvo</td><td>Gibco, Thermo Fisher, EE. UU.</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa anhidra, extra pura</td><td>Fisher Scientific, Alemania</td><td>G/0450/53</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Fisher Scientific, Alemania</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Tinción con ditzona</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU</td>. <td>D5130</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - Alta glucosa 4,5 g/L</td><td>Lonza, Suiza</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM - Glucosa baja 1 g/L</td><td>Lonza, Suiza</td><td>12-707F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medio</td><td>Lonza, Suiza</td><td>BE12-719F Agua</td><td></td></tr><tr><td>libre de ADNasa/ARNasa</td><td>Gibco Thermo Fisher, EE. UU</td>. <td>10977-035</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto, grado de biología molecular</td><td>Sigma-Aldrich, Alemania</td><td>24103</td><td></td></tr><tr><td>Exendin-4</td><td>Sigma-Aldrich, Alemania</td><td>E7144</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco Thermo Fisher, Brasil</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído 37%</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico (HCl)</td><td>Fisher Scientific, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol, grado de biología molecular</td><td>Fisher Scientific, EE. UU</td>. <td>BP2618500</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco Thermo Fisher, EE. UU.</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio (anhidro)</td><td>Fisher Scientific, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de identificación funcional de células madre mesenquimales</td><td>R& D systems Inc., MN, EE. UU</td>. <td>SC006 Nicotinamida</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich, Alemania</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Aceite Tinte Rojo</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina-Anfotericina</td><td>Gibco Thermo Fisher, EE. UU.</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato, 1X, sin Ca/Mg</td><td>Lonza, Suiza</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Potasio Cloruro Fisher</td><td>Scientific, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulina para ratas Kit ELISA</td><td>Cloud-Clone Corp., EE. UU.</td><td>CEA682Ra</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Fisher Scientific, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Scientific, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico (anhidro)</td><td>Fisher Scientific, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodio Fosfato monobásico (anhidro)</td><td>Fisher Scientific, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green Maxima</td><td>Thermo Scientific, EE. UU</td>. <td>K0221</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa, 0,2 micras</td><td>Corning, EE. UU.</td><td>431224</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Thermo Scientific, EE. UU.</td><td></td> 15596026 <td></td></tr><tr><td>Azul de tripano</td><td>Gibco Thermo Fisher, EE. UU</td>. <td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Versene-EDTA, 1X</td><td>Lonza, Suiza</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>Verso Kit de síntesis de ADNc</td><td>Thermo Scientific, EE. UU.</td><td>AB-1453/A</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich, Alemania</td><td>M3148</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de células madre mesenquimales del tejido adiposo de rata para la diferenciación en células productoras de insulina

Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

Las células madre mesenquimales (MSC), especialmente aquellas aisladas del tejido adiposo (MSC Ad), han ganado especial atención como una fuente renovable y abundante de células madre que no plantea ninguna preocupación ética. Sin embargo, los métodos actuales para aislar las MSC Ad no están estandarizados y emplean protocolos complicados que requieren equipos especiales. Se aislaron las MSC Ad-MSC de la grasa epidídima de las ratas Sprague-Dawley utilizando un método simple y reproducible. Las MSC Ad aisladas generalmente aparecen dentro de los 3 días posteriores al aislamiento, ya que las células adherentes muestran morfología fibroblástica. Esas células alcanzan el 80% de confluencia dentro de 1 semana de aislamiento. Posteriormente, en el paso 3-5 (P3-5), se llevó a cabo una caracterización completa para las MSC Ad-MSC aisladas mediante inmunofenotipado para marcadores de superficie característicos del grupo de diferenciación (CD) MSC como CD90, CD73 y CD105, así como inducir la diferenciación de estas células a través de los linajes osteogénico, adipogénico y condrogénico. Esto, a su vez, implica la multipotencia de las células aisladas. Además, inducimos la diferenciación de las Ad-MSC aisladas hacia el linaje de células productoras de insulina (IPC) a través de un protocolo simple y relativamente corto mediante la incorporación del medio Eagle modificado de Dulbecco de alta glucosa (HG-DMEM), β-mercaptoetanol, nicotinamida y exendina-4. La diferenciación de los IPC se evaluó genéticamente, en primer lugar, mediante la medición de los niveles de expresión de marcadores específicos de células β como MafA, NKX6.1, Pdx-1 e Ins1, así como la tinción de ditizona para los IPC generados. En segundo lugar, la evaluación también se llevó a cabo funcionalmente mediante un ensayo de secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS). En conclusión, las MSC Ad-MSC se pueden aislar fácilmente, exhibiendo todos los criterios de caracterización de MSC, y de hecho pueden proporcionar una fuente abundante y renovable de IPC en el laboratorio para la investigación de la diabetes.

Aislamiento y caracterización de las MSC Ad Como se muestra en la Figura 2, las células aisladas del tejido adiposo mostraron una población heterogénea de células redondeadas y similares a fibroblastos a partir del día siguiente de aislamiento (Figura 2A). 4 días después del aislamiento, las células de fibroblastos comenzaron a aumentar en número y tamaño y crecer como una población homogénea por el paso 1 (Figura 2B</str...

Las células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (Ad-MSC) pueden ser una fuente potencial de MSC que se diferencian en células productoras de insulina (IPC). En este protocolo, proporcionamos pasos detallados para el aislamiento y la caracterización de las MSC Ad-MSC epidídimas de ratas, seguidas de un protocolo simple y corto para la generación de IPC a partir de las mismas MSC Ad-MSC de ratas.

Aislamiento de células madre mesenquimales del tejido adiposo de rata para la diferenciación en células productoras de insulina

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...

El objetivo general de este protocolo es aislar y caracterizar el tejido adiposo rojo, las células madre mesenquimales secas y diferenciarlas hacia las células productoras de insulina utilizando métodos simples. Las células madre mesenquimales han encontrado los caminos en el campo de la genética. Se pueden aislar de diversas fuentes, como la médula ósea, el tejido adiposo y el tejido perinatal.Aceptan excelentes características culturales. Son multi potentes y potencialmente pueden tratar diversas enfermedades. El tejido adiposo proporciona una rica fuente de células madre mesenquimales.Estas MSC adiposas se pueden aislar de lipoaspirados fácilmente con alto rendimiento en comparación con otras fuentes como la médula ósea. Y pueden proporcionar una buena fuente para el trasplante autólogo y alogénico. En este vídeo se presenta un protocolo sencillo para el aislamiento y caracterización de células madre mesenquimales adiposas a partir de grasa epidídima de rata.Este procedimiento es un método simple y altamente eficiente para el aislamiento. Después del aislamiento, soportaremos la diferenciación de estas células madre mesenquimales adiposas en células productoras de insulina utilizando un protocolo simple y relativamente corto. Comenzaremos con el aislamiento de las células madre mesenquimales adiposas por digestión colágena de la grasa epidídima para obtener una fracción vascular más fuerte.Luego, las células madre mesenquimales se caracterizarán por su adherencia plástica, así como la expresión de marcadores de CD y la diferenciación en múltiples linajes mesodérmicos. Anestesiar al animal, luego sacrificar mediante luxación cervical. Rocíe todo el cuerpo con etanol al 70% y comience con la escisión de la piel y los músculos en la parte inferior del abdomen.Luego exponga los testículos con la grasa epidídima. Corte suavemente la grasa del epidídimo. Tenga cuidado de no cortar los vasos sanguíneos con las grasas.En un gabinete de bioseguridad, corte el tejido graso en trozos pequeños con fórceps y bisturí. Transfiera el tejido adiposo al tubo centrífugo que contiene PBS estéril de 10 mililitros. Comience a lavar inclinando el tubo Falcon durante 45 segundos.Luego mantenga el tubo de pie durante cinco minutos para separarlo en dos capas. Retire el PBS infranado con una jeringa de 10 mililitros. Repita estos pasos de lavado de cuatro a cinco veces hasta que PBS esté claro.Después del lavado, vuelva a suspender el tejido adiposo en solución colágena, luego incube en un baño de agua agitada hasta que el tejido esté casi homogéneo. Después, vórtice la mezcla de colágeno tisular durante 15 segundos, luego centrífuga durante cinco minutos. Después de la centrifugación, tendrá tres capas.Deseche cuidadosamente el sobrenadante sobre la fracción vascular del estroma. Primero deseche la capa de aceite en la parte superior con cuidado, seguido de la capa de ecos sin perturbar la bolita de fracción vascular estromal. Vuelva a suspender la fracción vascular estromal en BSA estéril y vuelva a centrifugar durante cinco minutos.Centrifugación completa, coloque el medio DMEM F-12 completo en matraz cuadrado de 25 centímetros. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo vascular estromal en medios DMEM F-12 completos. Y traslado al matraz de cultura.Coloque en la incubadora de dióxido de carbono de 37 grados 5%. Al día siguiente, retire las celdas no unidas y reemplace los medios con medios nuevos. A partir del siguiente día de aislamiento, las células similares a los fibroblastos comenzarán a aparecer.Luego, gradualmente, a medida que pasa el tiempo, aumentarán en número y tamaño. Al pasar, las células se volverán más homogéneas. Estas células exhiben todos los criterios de caracterización de células madre mesenquimales.Estas células se diferenciaron hacia células productoras de insulina utilizando este protocolo simple que contiene nicotinamida beta mercaptoetanol y Exendin-4. A lo largo de los pasos de diferenciación, las células comienzan a perder su forma fibroblástica y creo que se agrupan como la morfología. Cuando se usan células productoras de insulina muestran una tinción positiva de distionona roja carmesí, luego las células productoras de insulina utilizadas expresan varios marcadores de células beta como Pdx-1, mafA e insulina.Además, las células productoras de insulina inducidas secretan niveles más altos de insulina en el sobrenadante cuando se les desafía con una mayor concentración de glucosa. Proporcionamos un protocolo detallado y gradual para el aislamiento y la caracterización de las células madre mesenquimales adiposas. También proporcionamos aquí un protocolo relativamente corto, simple y eficiente para la diferenciación de células madre mesenquimales adiposas en células productoras de insulina.Esto proporciona una puerta de entrada para que el investigador ingrese al campo de las células madre mesenquimales y estudie su diferenciación en células productoras de insulina.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este video demuestra una técnica para aislar y cultivar células madre adiposas (ADSC) derivadas de la cresta neural marcadas con fluorescencia a partir de tejido adiposo del arco periaórtico murino. Tras el aislamiento, las NCADSC se detectan, se clasifican mediante la clasificación celular activada por fluorescencia y, posteriormente, se cultivan en una placa, lo que promueve la proliferación celular.

Aislamiento de células madre derivadas del tejido adiposo periaórtico murino

Este protocolo describe el aislamiento de células madre derivadas del tejido adiposo de cerdo (pADSC) de tejidos adiposos subcutáneos con examen de multipotencia. Los pADSC multipotentes se utilizan para delinear procesos de diferenciación de adipocitos y estudiar la transdiferenciación en múltiples linajes celulares de mesénquima mesodérmico o linajes adicionales de ectodermo y endodermo para estudios regenerativos.

El aislamiento y la diferenciación de células madre derivadas de tejido adiposo subcutáneo de la especie porcina tejidos adiposos

Aquí se informa un método para el aislamiento de las poblaciones de células progenitoras de adipocitos (APC) de tejido adiposo perivascular (PVAT) utilizando clasificación de células activadas magnéticamente (MCS). Este método permite un mayor aislamiento de APC por gramo de tejido adiposo cuando se compara con la Clasificación de Células Activadas por Fluorescencia (FACS).

Expansión y Adipogénesis Inducción de Progenitores Adipocíticos de Tejido Adiposo Perivascular Aislado por Clasificación de Células Magnéticas Activadas

La diferenciación de los adipocitos blancos y beiges de tejido adiposo vascular progenitores tiene potencial para mejoramiento metabólico en obesidad. Se describen los protocolos para un CD34 + CD31 + aislamiento de células endoteliales de la grasa humana y un posterior en vitro expansión y diferenciación a adipocitos blancos y beiges. Se discuten varias aplicaciones posteriores.

Aislamiento, expansión y Adipogenic inducción de CD31 + CD34 + células endoteliales del humano omentales y subcutáneos de tejido adiposo

Este protocolo describe el enfoque técnico para aislar subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos murinos de tejido adiposo blanco intraabdominal (WAT) mediante clasificación celular activada por fluorescencia o separación inmunomagnética de perlas.

Aislamiento de subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos adiposos intraabdominales murinos

En este artículo, describimos el aislamiento de células madre derivadas de tejido adiposo derivadas de macaco rhesus (ADSC) utilizando un protocolo de digestión enzimática de tejidos. A continuación, describimos la proliferación de ADSC que incluye el desprendimiento celular, el conteo y el recubrimiento. Por último, la diferenciación de ADSC se describe utilizando agentes inductores adipogénicos específicos. Además, describimos técnicas de tinción para confirmar la diferenciación.

Aislamiento, proliferación y diferenciación de células madre derivadas de tejido adiposo de macaco rhesus

Este protocolo describe el aislamiento de preadipocitos de ratón de la grasa subcutánea, su diferenciación en adipocitos maduros y la inducción de resistencia a la insulina. La acción de la insulina se evalúa mediante la fosforilación/activación de los miembros de la vía de señalización de la insulina a través del western blot. Este método permite la determinación directa de la resistencia/sensibilidad a la insulina en adipocitos primarios.

Adipocitos diferenciados de ratón en cultivo primario: un modelo de resistencia a la insulina

Este protocolo describe una metodología para aislar e identificar células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (MSC) de ratas Sprague Dawley.

Aislamiento e identificación de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo de ratas Sprague Dawley

Este protocolo describe el aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal (SVF) del tejido adiposo murino para obtener preadipocitos y lograr la diferenciación de los adipocitos in vitro. El uso de un disociador de tejidos para la digestión de la colagenasa reduce la variación experimental y aumenta la reproducibilidad.

Aislamiento semiautomático de la fracción vascular estromal del tejido adiposo blanco murino utilizando un disociador tisular

El tejido adiposo es una excelente fuente de células madre mesenquimales. Aquí, traemos el paso a paso de la extracción, el cultivo y la caracterización de células madre derivadas del tejido adiposo (ADSC) del tejido adiposo epididimario de ratones suizos.

Aislamiento, expansión in vitro y caracterización de células madre mesenquimales a partir de tejido adiposo epididimario de ratón

Aquí presentamos un método estándar para aislar de forma eficiente células madre y adipocitos derivados del adiposo, caracterizado por una reducción del &gt; del 90% en el tiempo de procesamiento, alta viabilidad celular y amplia compatibilidad.

Aislamiento eficiente de células madre y adipocitos derivados del adiposo a partir de tejido adiposo porcino

Aprende a aislar células madre mesenquimales de tejido adiposo de rata y diferenciarlas en células productoras de insulina. Este protocolo sencillo facilita la investigación en medicina regenerativa y tratamientos para diabetes.

Aislamiento de células madre mesenquimales del tejido adiposo de rata para la diferenciación en células productoras de insulina

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