Aislamiento de células madre mesenquimales del tejido adiposo de rata para la diferenciación en células productoras de insulina
29 de agosto de 2022
Las células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (Ad-MSC) pueden ser una fuente potencial de MSC que se diferencian en células productoras de insulina (IPC). En este protocolo, proporcionamos pasos detallados para el aislamiento y la caracterización de las MSC Ad-MSC epidídimas de ratas, seguidas de un protocolo simple y corto para la generación de IPC a partir de las mismas MSC Ad-MSC de ratas.
El objetivo general de este protocolo es aislar y caracterizar el tejido adiposo rojo, las células madre mesenquimales secas y diferenciarlas hacia las células productoras de insulina utilizando métodos simples. Las células madre mesenquimales han encontrado los caminos en el campo de la genética. Se pueden aislar de diversas fuentes, como la médula ósea, el tejido adiposo y el tejido perinatal.
Aceptan excelentes características culturales. Son multi potentes y potencialmente pueden tratar diversas enfermedades. El tejido adiposo proporciona una rica fuente de células madre mesenquimales.
Estas MSC adiposas se pueden aislar de lipoaspirados fácilmente con alto rendimiento en comparación con otras fuentes como la médula ósea. Y pueden proporcionar una buena fuente para el trasplante autólogo y alogénico. En este vídeo se presenta un protocolo sencillo para el aislamiento y caracterización de células madre mesenquimales adiposas a partir de grasa epidídima de rata.
Este procedimiento es un método simple y altamente eficiente para el aislamiento. Después del aislamiento, soportaremos la diferenciación de estas células madre mesenquimales adiposas en células productoras de insulina utilizando un protocolo simple y relativamente corto. Comenzaremos con el aislamiento de las células madre mesenquimales adiposas por digestión colágena de la grasa epidídima para obtener una fracción vascular más fuerte.
Luego, las células madre mesenquimales se caracterizarán por su adherencia plástica, así como la expresión de marcadores de CD y la diferenciación en múltiples linajes mesodérmicos. Anestesiar al animal, luego sacrificar mediante luxación cervical. Rocíe todo el cuerpo con etanol al 70% y comience con la escisión de la piel y los músculos en la parte inferior del abdomen.
Luego exponga los testículos con la grasa epidídima. Corte suavemente la grasa del epidídimo. Tenga cuidado de no cortar los vasos sanguíneos con las grasas.
En un gabinete de bioseguridad, corte el tejido graso en trozos pequeños con fórceps y bisturí. Transfiera el tejido adiposo al tubo centrífugo que contiene PBS estéril de 10 mililitros. Comience a lavar inclinando el tubo Falcon durante 45 segundos.
Luego mantenga el tubo de pie durante cinco minutos para separarlo en dos capas. Retire el PBS infranado con una jeringa de 10 mililitros. Repita estos pasos de lavado de cuatro a cinco veces hasta que PBS esté claro.
Después del lavado, vuelva a suspender el tejido adiposo en solución colágena, luego incube en un baño de agua agitada hasta que el tejido esté casi homogéneo. Después, vórtice la mezcla de colágeno tisular durante 15 segundos, luego centrífuga durante cinco minutos. Después de la centrifugación, tendrá tres capas.
Deseche cuidadosamente el sobrenadante sobre la fracción vascular del estroma. Primero deseche la capa de aceite en la parte superior con cuidado, seguido de la capa de ecos sin perturbar la bolita de fracción vascular estromal. Vuelva a suspender la fracción vascular estromal en BSA estéril y vuelva a centrifugar durante cinco minutos.
Centrifugación completa, coloque el medio DMEM F-12 completo en matraz cuadrado de 25 centímetros. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo vascular estromal en medios DMEM F-12 completos. Y traslado al matraz de cultura.
Coloque en la incubadora de dióxido de carbono de 37 grados 5%. Al día siguiente, retire las celdas no unidas y reemplace los medios con medios nuevos. A partir del siguiente día de aislamiento, las células similares a los fibroblastos comenzarán a aparecer.
Luego, gradualmente, a medida que pasa el tiempo, aumentarán en número y tamaño. Al pasar, las células se volverán más homogéneas. Estas células exhiben todos los criterios de caracterización de células madre mesenquimales.
Estas células se diferenciaron hacia células productoras de insulina utilizando este protocolo simple que contiene nicotinamida beta mercaptoetanol y Exendin-4. A lo largo de los pasos de diferenciación, las células comienzan a perder su forma fibroblástica y creo que se agrupan como la morfología. Cuando se usan células productoras de insulina muestran una tinción positiva de distionona roja carmesí, luego las células productoras de insulina utilizadas expresan varios marcadores de células beta como Pdx-1, mafA e insulina.
Además, las células productoras de insulina inducidas secretan niveles más altos de insulina en el sobrenadante cuando se les desafía con una mayor concentración de glucosa. Proporcionamos un protocolo detallado y gradual para el aislamiento y la caracterización de las células madre mesenquimales adiposas. También proporcionamos aquí un protocolo relativamente corto, simple y eficiente para la diferenciación de células madre mesenquimales adiposas en células productoras de insulina.
Esto proporciona una puerta de entrada para que el investigador ingrese al campo de las células madre mesenquimales y estudie su diferenciación en células productoras de insulina.
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Descripción general
Este protocolo describe el aislamiento y la caracterización de células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo (Ad-MSCs) a partir de tejido epididimal de rata, seguido de su diferenciación en células productoras de insulina (IPCs). Los métodos proporcionados son sencillos y están diseñados para facilitar su aplicación en un entorno de laboratorio.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología de Células Madre
- Medicina Regenerativa
- Endocrinología
Antecedentes
- Las células madre mesenquimales (MSCs) pueden obtenerse de diversos tejidos, incluido el tejido adiposo.
- El tejido adiposo es una fuente rica en MSCs con características de cultivo favorables.
- Las MSCs tienen la capacidad de diferenciarse en diversos tipos celulares, incluidas células productoras de insulina.
- Comprender el proceso de diferenciación puede ayudar en el desarrollo de terapias para la diabetes.
Objetivo del estudio
- Aislar y caracterizar CMM-A del epidídimo de rata.
- Desarrollar un protocolo para diferenciar estas células en CIP.
- Proporcionar un método confiable para investigaciones futuras en medicina regenerativa.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de CMM derivadas del tejido adiposo de la grasa epididimal de rata.
- Caracterización de CMM aisladas mediante marcadores estándar.
- Inducción de diferenciación en células productoras de insulina.
- Evaluación de la funcionalidad de las CIP tras la diferenciación.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de CEM-Ad con marcadores de superficie característicos.
- Diferenciación demostrada de CEM-Ad en CIP.
- La evaluación funcional mostró que las CIP eran capaces de secreción de insulina.
- El protocolo proporciona un método reproducible para generar CIP a partir de CEM-Ad.
Conclusiones
- Los Ad-MSC son una fuente viable para generar células productoras de insulina.
- El protocolo puede facilitar investigaciones adicionales sobre el tratamiento de la diabetes.
- Estudios futuros podrían explorar el potencial terapéutico de estas CIP.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Las células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo (Ad-MSCs) ofrecen una fuente renovable y éticamente no controvertida para la generación de células productoras de insulina (IPCs) en la investigación de la diabetes. El protocolo proporciona un método sencillo y reproducible para aislar y caracterizar Ad-MSCs a partir de grasa epididimal de rata, seguido de su diferenciación en IPCs mediante señales bioquímicas definidas. Este enfoque apoya la validación de dianas y la reducción de riesgos mecanicistas en las primeras etapas del descubrimiento terapéutico para enfermedades metabólicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la multipotencialidad de las CMM y su compromiso de linaje hacia el destino de células beta pancreáticas.
- Valor operativo: Proporciona una fuente estandarizada de CMM-Ad con expresión confirmada de CD90, CD73 y CD105 para experimentación reproducible.
- Valor científico: Apoya la validación funcional de las CIP mediante la secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS) y la tinción con ditionina, confirmando una funcionalidad semejante a la de las células beta.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Genera células precursoras de islotes que expresan factores clave de transcripción de células beta (Pdx-1, MafA, NKX6.1, Ins1) para su uso en ensayos de cribado de compuestos.
- Valor operativo: Permite la producción escalable de células precursoras de islotes a partir de Ad-MSC para la evaluación de alto rendimiento de la dinámica de secreción de insulina.
- Valor científico: Facilita la estandarización de ensayos mediante protocolos de diferenciación consistentes que utilizan HG-DMEM, β-mercaptoetanol, nicotinamida y exendina-4.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Demuestra relevancia traslacional mediante la producción de células productoras de insulina que responden a desafíos de glucosa con un aumento en la secreción de insulina.
- Valor operativo: Facilita la continuidad preclínica al proporcionar una fuente renovable de células para pruebas de respuesta a la dosis y de eficacia en modelos de diabetes.
- Valor científico: Reduce el riesgo biológico al confirmar la multipotencialidad mediante diferenciación osteogénica, adipogénica y condrogénica antes de la inducción a células productoras de insulina.
Integración de la Línea de Procesamiento y Flujo de Trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la validación inicial del blanco hasta la identificación del fármaco candidato y la evaluación preclínica, particularmente para terapéuticas contra la diabetes que tienen como objetivo el reemplazo o la función de las células beta.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la plasticidad y la especificación de linajes de las CMM mediante señales definidas de diferenciación.
- Selección: Permite la producción de CIP listas para ensayos con resultados cuantificables, como los niveles de secreción de insulina y la expresión de marcadores.
- Análisis: Proporciona puntos finales medibles, incluyendo SSIG, tinción con ditizona y qPCR para marcadores de células beta, con el fin de comparar condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta la generación in vitro de CIP con la validación preclínica mediante ensayos funcionales de liberación de insulina.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para generar CIP a partir de fuentes adiposas en múltiples proyectos y líneas celulares.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la generación de IPC mediante caracterización multilinaje y validación funcional.
- Valor operativo: Normalización y reproducibilidad del aislamiento y diferenciación de Ad-MSC entre laboratorios.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar o descartar en las primeras etapas del desarrollo de terapias para la diabetes, mediante la validación de modelos celulares de la función de las células beta.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de enfoques basados en células madre para intervenciones en enfermedades metabólicas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo de células madre, técnicas de diferenciación y citometría de flujo para inmunofenotipificación.
- Necesita acceso a centrífugas, cabinas de seguridad biológica, incubadoras y equipos para ensayos de secreción de insulina estimulada por glucosa.
- Exige la estandarización de los procedimientos de digestión, lavado y siembra para garantizar un rendimiento constante de la fracción vascular estromal.
- Requiere adaptar el tiempo de diferenciación y las concentraciones de reactivos al aplicarlos a diferentes depósitos adiposos o especies.
- Limitado por la necesidad de utilizar células entre el pase 3 y 5 para asegurar homogeneidad y multipotencialidad antes de la inducción de la diferenciación.
