Comparación de métodos para aislar hongos entomopatógenos de muestras de suelo
6 de enero de 2022
Las colonias de hongos entomopatógenos se aíslan de muestras de suelo tropical utilizando cebo Tenebrio , cebo Galleria , así como medio artificial selectivo, es decir, agar de dextrosa de papa enriquecido con extracto de levadura suplementado con cloranfenicol, tiabendazol y cicloheximida (medio CTC).
El aislamiento de hongos entomopatógenos es significativo para el desarrollo de un bioplaguicida y puede ser útil para estudiar la diversidad, distribución y ecología de este grupo en particular. El uso de cebos de insectos para aislar hongos entomopatógenos se considera un método de bajo costo y altamente eficiente. cloranfenicol, tiabendazol, cicloheximida, medios artificiales no utiliza dodina y requiere menos espacio en el proceso de muestreo del suelo.
Los pasos críticos incluyen la investigación de las placas ctC después de una y dos semanas para evitar que otros hongos se estrechen y los hongos entomopatógenos en desarrollo, y luego identificar colonias de hongos entomopatógenos en función de su macromorfología y micromorfología. Comience recolectando 800 gramos de tierra a una profundidad de 10 centímetros usando una pala pequeña. Guarde las muestras en bolsas de polipropileno a temperatura ambiente hasta el inicio del experimento.
También se pueden recolectar raíces pequeñas ya que se sabe que los hongos entomopatógenos tienen competencia de rizosfera. Para el aislamiento de hongos utilizando cloranfenicol, tiabendazol, cicloheximida o medio artificial selectivo CTC, pese 0,35 gramos de la muestra de suelo con o sin raíces. Coloque esta muestra en un microtubo de 1,5 mililitros.
Mientras trabaja en un gabinete de bioseguridad, agregue un mililitro de suspensión acuosa estéril de polioxietileno sorbitano monooleato al microtubo que contiene el suelo y vórtice el tubo durante 30 segundos. Cuando haya terminado, retire y pipetee 50 microlitros del sobrenadante en el centro de las placas de Petri con medio CTC. Luego use una espátula estéril de Drigalski de seis milímetros de diámetro para dispersar homogéneamente las suspensiones en la superficie del medio.
Incubar las placas en cámaras climáticas a 25 grados centígrados y un mínimo de 80% de humedad relativa en la oscuridad. Después de siete, 14 y 21 días de incubación, observe las placas para el crecimiento de colonias de hongos. Aislar los hongos utilizando larvas de galleria mellonella y Tenebrio molitor desinfectadas superficialmente como cebos para insectos.
Sumerja la larva en hipoclorito de sodio al 0,5% durante un minuto para la esterilización. Luego lave las larvas dos veces con agua estéril. Ensamble los cebos en macetas de plástico con 10 pequeños orificios de 10 milímetros de diámetro en la tapa que contengan 250 gramos de la tierra recolectada.
Homogeneizar el suelo cada dos días para permitir el máximo contacto de las larvas con el suelo y analizar las macetas diariamente, buscando insectos muertos. Después de eliminar los insectos muertos de la olla, esterilice superficialmente los insectos con hipoclorito de sodio al 0.5% durante un minuto. Para favorecer la micosis, coloque los insectos estériles en una cámara húmeda al 80% de humedad relativa y 25 grados centígrados durante siete días.
En la micosis, recolecte los conidios de la superficie del insecto y, con la ayuda del asa microbiológica, coloque los conidios en un medio de agar de dextrosa de papa que contenga 0.05% de cloranfenicol o medio PDAC bajo un microscopio estereoscópico. Como alternativa, coloque las larvas infectadas enteras en el medio PDAC. E incubar las placas de cultivo en una cámara climática como se explicó anteriormente.
Después de 14 días de incubación, identificar las especies de EPF analizando las características macromorfológicas de los cultivos de hongos en las placas como se describe en el manuscrito. A continuación, transfiera los conidios aéreos a cultivos deslizantes durante tres días al 80% de humedad relativa y 25 grados centígrados. Después de tres días, tiñe el portaobjetos con azul lactofenol para observar las características microscópicas.
Bajo un microscopio óptico, observe las estructuras fúngicas como la disposición, los conidióforos, la forma y el tamaño de los conidios a 400 veces y confirme la identificación de EPF. En el estudio, se aislaron 51 cepas de EPF de las especies Metarhizium y Beaveria de 524 muestras de suelo. El análisis representativo muestra las características micromorfológicas de algunos aislados de especies de Metarhizium y Beaveria.
La ocurrencia de EPF en las 24 muestras de suelo se estudió utilizando tres métodos diferentes de aislamiento. El cebo Galleria mellonella demostró ser más eficiente en el aislamiento, seguido por el cebo Tenebrio molitor y el medio CTC. Las mismas 24 muestras de suelo no mostraron recuperación de especies de Beaveria, sino solo Metarhizium.
Las cosas más importantes a recordar son transferir los conidios aéreos a la capa deslizante observando las características del microscopio y confirmando la identificación de hongos entomopatógenos utilizando claves morfológicas. Los métodos adicionales incluyen el uso de otros medios artificiales selectivos con productos químicos específicos para reducir el crecimiento de contaminantes como la dodina. La búsqueda de nuevos aislados de hongos con rasgos de control biológico sobresalientes es crucial para aumentar la efectividad de los hongos en el control de plagas de artrópodos y explorar más preguntas en el campo de la patología de los invertebrados.
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Descripción general
Este estudio investiga el aislamiento de hongos entomopatógenos a partir de suelos tropicales utilizando cebos insectos, destacando la eficiencia de diversos métodos. El aislamiento tiene como objetivo mejorar la comprensión de la diversidad fúngica y contribuir al desarrollo de biopesticidas.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Hongos entomopatógenos
- Microbiología del suelo
- Desarrollo de biopesticidas
Antecedentes
- Métodos de bajo costo para el aislamiento de hongos entomopatógenos.
- Importancia de evaluar muestras de suelo para estudios ecológicos.
- Uso de medios selectivos para el aislamiento eficaz de hongos.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de hongos mediante cebos de insectos (Galleria mellonella y Tenebrio molitor).
- Uso de medios artificiales selectivos (medio CTC, agar dextrosa papa).
- Observación microscópica para la identificación de especies fúngicas.
Resultados principales
- 51 cepas de especies de Metarhizium y Beauveria aisladas de 524 muestras de suelo.
- El cebo Galleria mellonella demostró la mayor eficiencia para el aislamiento fúngico.
- No hubo recuperación de especies de Beauveria a partir de las muestras analizadas.
Conclusiones
- El estudio demuestra eficazmente métodos para aislar hongos entomopatógenos.
- Los hallazgos contribuyen a la investigación sobre biocontrol y aplicaciones agrícolas potenciales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El aislamiento de hongos entomopatógenos del suelo es un paso fundamental en el descubrimiento de bioinsecticidas, donde la eficiencia del método influye directamente en la validación de objetivos y la identificación de candidatos prometedores. La comparación entre cebos con insectos y medios selectivos permite reducir los riesgos en la selección temprana de candidatos antifúngicos, al mejorar el rendimiento de aislamiento y disminuir los falsos negativos. Esto fortalece la confianza predictiva en la selección de objetivos para programas de control de plagas artrópodos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de la biodiversidad fúngica en ecosistemas del suelo para identificar cepas novedosas de Metarhizium y Beauveria con posible bioactividad.
- Valor operativo: Los métodos de atracción con insectos (Galleria mellonella, Tenebrio molitor) ofrecen una mayor eficiencia de aislamiento que el medio CTC, aumentando el acceso a los organismos objetivo para su caracterización posterior.
- Valor traslacional: Las cepas aisladas facilitan la reducción mecanicista de riesgos al vincular la virulencia fenotípica con la identidad genética mediante identificación morfológica y molecular.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Proporciona aislamientos fúngicos validados para el desarrollo de ensayos dirigidos a la patogenicidad frente a artrópodos y la especificidad del rango de hospedadores.
- Valor operativo: Protocolos estandarizados de aislamiento que utilizan cebos insectos mejoran la reproducibilidad y escalabilidad en el aislamiento fúngico entre diferentes lotes de muestras de suelo.
- Preparación para ensayos: Permite la obtención de cultivos puros para la recolección de conidios y la confirmación morfológica mediante microscopía, facilitando entradas consistentes para el cribado fenotípico.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Sistema Relevante para la Enfermedad: Las cepas de EPF aisladas sirven como modelos preclínicos para evaluar la virulencia frente a plagas de insectos, lo que se alinea con el desarrollo de productos de biocontrol.
- Confianza Predictiva: La identificación molecular de los aislamientos a nivel de especie fortalece la confianza en el objetivo y apoya la selección de cepas para estudios de formulación.
- Continuidad: Los protocolos de aislamiento establecidos permiten el seguimiento longitudinal de la presencia fúngica en suelos agrícolas, aportando información para estrategias de manejo de resistencia y rotación de cepas.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método de aislamiento se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano, donde las cepas de hongos entomopatógenos recuperadas avanzan hacia la selección fenotípica para evaluar la virulencia y la especificidad del huésped, lo que contribuye a la identificación de candidatos promisorios en las líneas de desarrollo de bioinsecticidas.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis sobre la ecología y patogenicidad de hongos mediante el aislamiento de hongos entomopatógenos de matrices complejas del suelo.
- Tamizaje: Genera preparaciones estandarizadas de hongos para ensayos de virulencia de alto rendimiento utilizando huéspedes insectos.
- Análisis: Los resultados de identificación morfológica y molecular proporcionan datos cuantitativos y cualitativos para la comparación y selección de cepas.
- Investigación Traducional: Conecta el aislamiento ambiental con la evaluación preclínica a través de mecanismos de virulencia conservados en Metarhizium y Beauveria.
- Reutilización Empresarial: El protocolo de aislamiento que utiliza cebos insectos puede estandarizarse entre diferentes sitios y tipos de suelo, permitiendo el almacenamiento escalable de cepas fúngicas para futuras campañas de tamizaje.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la diversidad de objetivos y reduce la ambigüedad mecanicista en la selección de objetivos de hongos entomopatógenos (EPF) para el desarrollo de bioinsecticidas.
- Valor operativo: Los métodos de cebo insecticida ofrecen mayor rendimiento y menor variabilidad técnica que los medios selectivos, mejorando las tasas de éxito en el aislamiento.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones más informadas sobre la continuidad o descarte en la priorización de cepas al incrementar el acceso a aislamientos virulentos provenientes de muestras ambientales.
- Impacto en la cartera: Apoya el avance ajustado al riesgo al ampliar el conjunto de cepas de hongos entomopatógenos caracterizadas con morfología e identidad confirmadas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de insectos, morfología fúngica y técnica aséptica para la preparación del cebo y la recolección de conidias.
- Necesita cámaras de incubación con condiciones controladas de 25°C y 80% de humedad para el crecimiento fúngico y la inducción de micosis.
- La estandarización entre equipos requiere una esterilización consistente del cebo, homogenización del suelo y cronogramas uniformes de procesamiento posterior a la micosis.
- La adaptación a diferentes tipos de suelo puede requerir ajustes en el tiempo de exposición del cebo y el volumen de suelo, según la prevalencia nativa de hongos entomopatógenos (EPF).
- Las limitaciones incluyen la dependencia de la viabilidad larval y de las condiciones ambientales que afectan el éxito de la micosis, como se indica en la dependencia del protocolo de cámaras húmedas y pasos de esterilización superficial.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:07
Soil Sampling and Isolation Methods for Entomopathogenic Fungi (EPF)
4:29
Identification of Entomopathogenic Fungi (EPF): Metarhizium and Beauveria Species
5:21
Results: Micromorphological Characteristics and Occurrence of Entomopathogenic Fungi in Various Soil Samples
6:16
Conclusion
