Name: Estudio del tráfico de proteínas de membrana en células fotorreceptoras de Drosophila utilizando proteínas marcadas con eGFP (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Aprende a localizar proteínas de membrana en fotorreceptores de Drosophila mediante imágenes de pseudopupila profunda y microscopía de inmersión en agua. Este método no invasivo permite estudiar la degeneración retiniana hereditaria en humanos.

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Nos gustaría agradecer a nuestros estudiantes investigadores a lo largo de los años. En particular, Nina Meyer, Sibylle Mayer, Juliane Kaim y Laura Jaggy, cuyos datos se han utilizado en este protocolo como resultados representativos. La investigación de nuestro grupo presentada aquí fue financiada por subvenciones de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 839/2-4, Hu 839/7-1) a Armin Huber.

<ol><li>Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+protein+trafficking+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration.+9%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration.</a> Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31(2014).</li>
<li>Schopf, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+trafficking+in+Drosophila+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells.</a> European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photoreceptor+array+of+the+dipteran+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The photoreceptor array of the dipteran retina.</a> Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).</li>
<li>Wang, T., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+and+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv+-+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila.</a> Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).</li>
<li>Xiong, B., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+homeostasis+and+retinal+degeneration%3A+lessons+from+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly.</a> Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).</li>
<li>Bähner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-regulated+subcellular+translocation+of+Drosophila+TRPL+channels+induces+long-term+adaptation+and+modifies+the+light-induced+current%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current.</a> Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).</li>
<li>Cronin, M. A., Lieu, M. -H., Tsunoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+stages+of+light-dependent+TRPL-channel+translocation+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).</li>
<li>Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+translocation+of+the+eGFP-tagged+TRPL+channel+in+Drosophila+photoreceptors+requires+activation+of+the+phototransduction+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade.</a> Journal of Cell Science. 119, Pt 12 2592-2603 (2006).</li>
<li>Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+TRPL+ion+channel+shares+a+Rab-dependent+translocation+pathway+with+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).</li>
<li>Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+D+and+retromer+promote+recycling+of+TRPL+ion+channel+via+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum.</a> Traffic. , (2021).</li>
<li>Franceschini, N., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Les+ph%C3%A9nom%C3%A9nes+de+pseudopupille+dans+l%27oeil+compose+de+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Kybernetik%22%5BJournal%5D)">Les phénoménes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila.</a> Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).</li>
<li>Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+visualization+approach+for+identifying+mutations+that+affect+differentiation+and+organization+of+the+Drosophila+ommatidia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia.</a> Development. 128 (6), 815-826 (2001).</li>
<li>Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+fluorescent+proteins+for+functional+dissection+of+the+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).</li>
<li>Meyer, N. Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+Karlsruhe+%28TH%29%22">University of Karlsruhe (TH)</a>. , Karlsruhe. (2005).</li>
<li>Meyer, N., Oberegelsbacher, C., Dürr, T. D., Schäfer, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+eGFP-based+genetic+screen+for+defects+in+light-triggered+subcelluar+translocation+of+the+Drosophila+photoreceptor+channel+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL.</a> Fly. 2 (1), 36-46 (2008).</li>
<li>Zheng, L., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lola+regulates+cell+fate+by+antagonizing+Notch+induction+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye.</a> Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).</li>
<li>Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+cytoplasmic+DEAD+box+helicase+Dbp21E2+in+rhodopsin+maturation+and+photoreceptor+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability.</a> Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).</li>
<li>Huang, Y., Xie, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fluorescence-based+genetic+screen+to+study+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila.</a> PloS One. 10 (12), 0144925(2015).</li>
<li>Zhao, H., Wang, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+V-ATPase+V1+subunit+A1+is+required+for+rhodopsin+anterograde+trafficking+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).</li>
<li>Xiong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+complex+proteins+are+required+for+rhodopsin+biosynthesis+and+photoreceptor+survival+in+Drosophila+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).</li>
<li>Zhao, H., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PE+homeostasis+rebalanced+through+mitochondria-ER+lipid+exchange+prevents+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila.</a> PLoS Genetics. 16 (10), 1009070(2020).</li>
<li>Cerny, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GTP-+and+phospholipid-binding+protein+TTD14+regulates+trafficking+of+the+TRPL+ion+channel+in+Drosophila+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells.</a> PLoS Genetics. 11 (10), 1005578(2015).</li>
<li>Richter, D. Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+Karlsruhe+%28TH%29%22">University of Karlsruhe (TH)</a>. , Karlsruhe. (2007).</li>
<li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).</li>
<li>Hardie, R. C., Liu, C. -H., Randall, A. S., Sengupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+phosphoinositides+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).</li>
<li>Chakrabarti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dPIP5K+dependent+pool+of+phosphatidylinositol+4%2C5+bisphosphate+%28PIP2%29+is+required+for+G-protein+coupled+signal+transduction+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors.</a> PLoS Genetics. 11 (1), 1004948(2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La aplicabilidad de las proteínas de fluorescencia y la simplicidad de la detección mediante imágenes DPP y microscopía de inmersión en agua de la retina han demostrado ser exitosas por muchos grupos12. Estrategias similares a las aquí presentadas se han utilizado en varios cribados genéticos para detectar defectos en los niveles de expresión de rodopsina, homeostasis, organización retiniana o integridad celular con la ayuda de Rh1::eGFP 17,18,19,20,21.<sup class...

Al entregar y eliminar proteínas hacia y desde la membrana plasmática, el tráfico de proteínas de membrana en las neuronas controla el equipo de membrana plasmática con receptores y canales iónicos y, como resultado, regula la función neuronal. La mala regulación o los defectos en el tráfico de proteínas suelen tener efectos perjudiciales en las células y provocar una degeneración neuronal. En los seres humanos, esto puede causar enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer y Parkinson o la retinosis pigmentaria1. Los fotorreceptores en el ojo compuesto de Drosophila melanogaster se han convertido en un sistema modelo in vivo para estudiar el tráfico de proteínas de membrana2. Esto no solo se debe a la versatilidad genética de Drosophila que permite exámenes genéticos efectivos, sino también a que todos los componentes esenciales de la membrana fotorreceptora absorbente de luz se caracterizan con gran detalle y se dispone de técnicas microscópicas eficientes que se pueden aplicar al ojo de mosca. Estas técnicas son el foco de este artículo.
En las células fotorreceptoras de Drosophila, la membrana plasmática apical forma una pila densamente empaquetada de microvellosidades a lo largo de un lado de la célula, denominada rabdomero. Los rabdomeros de las células fotorreceptoras R1-6 están dispuestos en un patrón trapezoidal característico, mientras que las células fotorreceptoras R7 y R8 forman un solo rabdomero en el centro de este trapecio3. El tráfico de proteínas de membrana es necesario para un recambio regulado de proteínas de membrana rabdomeral como la rodopsina y los canales iónicos TRP (potencial de receptor transitorio) y TRPL (similar a TRP) activados por la luz para asegurar la cantidad adecuada de estas proteínas de fototransducción en el rabdomero. Las proteínas de membrana fotorreceptoras se sintetizan en el retículo endoplásmico y se transportan a través del aparato de Golgi al rabdomero. Después de la activación de la rodopsina por la luz, una molécula de rodopsina puede inactivarse por absorción de un segundo fotón o puede ser eliminada del rabdomero por endocitosis mediada por clatrina. La rodopsina endocitosa se degrada en el lisosoma o se recicla de nuevo al rabdomero 4,5. El canal iónico TRPL también se internaliza tras la activación de la cascada de fototransducción y sufre una translocación dependiente de la luz entre el rabdomero (donde se encuentra cuando las moscas se mantienen en la oscuridad) y un compartimento de almacenamiento enriquecido con ER en el cuerpo celular (al que se transporta dentro de varias horas después de la iluminación)6,7,8,9,10 . A diferencia de la rodopsina endocitosa, solo pequeñas cantidades de TRPL se degradan a través de la vía endolisosomal, y la mayoría se almacena intracelularmente en su lugar y se recicla de nuevo al rabdomero tras la adaptación oscura6. Por lo tanto, TRPL se puede utilizar para analizar el tráfico de proteínas de membrana plasmática desencadenado por la luz. Las células fotorreceptoras de Drosophila también se emplean para estudiar la degeneración neuronal. La degeneración de las células fotorreceptoras se determina con frecuencia mediante la evaluación de la estructura de los rabdomeros, que se desintegran como resultado de procesos degenerativos5.
Con el fin de estudiar la localización subcelular de TRPL y rodopsina en células fotorreceptoras o degeneración de células fotorreceptoras, se han aplicado aquí dos métodos de microscopía de fluorescencia que difieren con respecto a la velocidad de análisis y la resolución. Un método muy rápido y no invasivo que se puede utilizar para cribados genéticos pero con una resolución espacial limitada es la detección de fluorescencia en el pseudopúpilo profundo (DPP). El DPP es un fenómeno óptico de ojos compuestos de artrópodos cuyo origen geométrico ha sido explicado en detalle por Franceschini y Kirschfeld en 197111. En resumen, en varios planos ópticos debajo de la superposición de retina se pueden observar imágenes de rabdomeros de ommatidios adyacentes. En un plano focal a través del centro de la curvatura del ojo, estas proyecciones superpuestas forman una imagen que se asemeja al diseño trapezoidal de rabdomeros en un solo ommatidio solo órdenes de magnitud más grande. Este fenómeno también se puede observar independientemente de la expresión exógena de proteínas de fluorescencia (por ejemplo, TRPL::eGFP8), que sin embargo hacen que el DPP sea más fácil de detectar (Figura 1A-A'')12. Un segundo método no invasivo es la microscopía de inmersión en agua que se basa en la obtención de imágenes de proteínas marcadas con fluorescencia después de neutralizar ópticamente el aparato dióptrico de los ojos con agua (Figura 1B-C'')12. Utilizando el método de inmersión en agua, la cantidad relativa de TRPL::eGFP en los rabdomeros o cuerpo celular se puede evaluar cuantitativamente para células fotorreceptoras individuales. Además, las proteínas marcadas con fluorescencia no translocadoras se pueden utilizar para evaluar la integridad rabdomeral y determinar el curso temporal de una degeneración potencial de manera cuantitativa, como se describe aquí.
Si bien las grabaciones del DPP son, con mucho, los métodos más fáciles y rápidos de realizar, la resolución espacial de los datos que generan es limitada. Además, hay numerosas razones por las que un DPP puede estar ausente, que no son necesariamente discernibles por las propias imágenes de DPP. Dado que el DPP representa una suma de varios ommatidios, se pierde información sobre células individuales. Por lo tanto, las imágenes DPP de baja resolución cumplen una función importante en la detección de un gran número de moscas, pero generalmente deben ir seguidas de grabaciones de mayor resolución a través de microscopía de inmersión en agua. Las micrografías de inmersión en agua permiten interpretaciones sobre células individuales, defectos del desarrollo, morfología ocular, mala localización de proteínas o degeneración de la retina, así como la cuantificación de estos efectos. Este Protocolo describe estas dos técnicas en detalle.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63375/63375fig01.jpg"> Figura 1: Descripción general de las variaciones de microscopía para el ojo de Drosophila presentadas en este Protocolo. Representaciones esquemáticas y micrografías ejemplares de imágenes de pseudopúpodo profundo fluorescente (DPP) (A-A''), microscopía letal de inmersión en agua (B-B'') de rabdomeros fluorescentes y (C-C'') microscopía de gota de agua no letal de rabdomeros fluorescentes. Barra de escala (A''): 100 μm. Barras de escala (B''-C''): 10 μm. La figura ha sido modificada a partir de la referencia13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63375/63375fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Tubo de centrífuga de 15 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>CO2 almohadilla de anestesia</td><td>Flystuff</td><td>59-172</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara de luz fría (KL 1500 LCD)</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia con lámpara UV, cámara, juego de filtros y software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition)</td>Tubo fluorescente <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) [1750 Lux, Ee470nm = 298 &micro; W cm-2, Ee590nm = 215 &micro; W cm-2] y [760 Lux, Ee470nm = 173 &micro; W cm-2, Ee590nm = 147 &micro; W cm-2]</td><td>Osram</td><td>4050300518039</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de laboratorio (20-200 &micro; L)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos</td><td>Roth</td><td>0656.1</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (94 mm)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633102</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta (200 y micro; L)</td><td>Plastilina 7695844</td><td></td><td></td></tr> absoluta <tr><td>(Blu-Tack)</td><td>Microscopio</td><td></td> estereoscópico 30811745 <td></td>Bostik</tr><tr><td>(SMZ445)</td><td>Microscopio</td> estereoscópico Nikon <td></td><td></td></tr><tr><td>con lámpara UV, cámara, juego de filtros y software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

estudio del tráfico de proteínas de membrana en células fotorreceptoras de drosophila utilizando proteínas marcadas con egfp

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

El tráfico de proteínas de membrana regula la incorporación y eliminación de receptores y canales iónicos en la membrana plasmática. Este proceso es fundamentalmente importante para la función celular y la integridad celular de las neuronas. Las células fotorreceptoras de Drosophila se han convertido en un modelo para estudiar el tráfico de proteínas de membrana. Además de la rodopsina, que tras la iluminación se internaliza desde la membrana del fotorreceptor y se degrada, el canal iónico similar al potencial del receptor transitorio (TRPL) en Drosophila exhibe una translocación dependiente de la luz entre la membrana del fotorreceptor rabdomeral (donde se encuentra en la oscuridad) y el cuerpo celular fotorreceptor (al que se transporta tras la iluminación). Este transporte intracelular de TRPL se puede estudiar de una manera simple y no invasiva mediante la expresión de TRPL marcado con eGFP en células fotorreceptoras. La fluorescencia eGFP se puede observar en el pseudopúplo profundo o mediante microscopía de inmersión en agua. Estos métodos permiten la detección de fluorescencia en el ojo intacto y, por lo tanto, son útiles para ensayos de alto rendimiento y pruebas genéticas para mutantes de Drosophila defectuosos en la translocación de TRPL. Aquí, se explican en detalle la preparación de moscas, las técnicas microscópicas, así como los métodos de cuantificación utilizados para estudiar esta translocación de TRPL desencadenada por la luz. Estos métodos se pueden aplicar también para estudios de tráfico en otras proteínas fotorreceptoras de Drosophila , por ejemplo, rodopsina. Además, mediante el uso de proteínas rabdomerales marcadas con eGFP, estos métodos se pueden utilizar para evaluar la degeneración de las células fotorreceptoras.

Se han generado moscas Drosophila transgénicas que expresan una proteína de fusión TRPL::eGFP bajo el control del promotor de rodopsina 1. En estas moscas, TRPL::eGFP se expresa en las células fotorreceptoras R1-6 del ojo compuesto y muestra una localización dependiente de la iluminación. Cuando las moscas se mantienen en la oscuridad, TRPL::eGFP se incorpora a los rabdomeros externos. Después de la iluminación durante varias horas, TRPL se transloca en el cuerpo celular donde se almacena en un compartimento enr...

Aquí, se describen métodos no invasivos para la localización de proteínas de membrana fotorreceptoras y la evaluación de la degeneración retiniana en el ojo compuesto de Drosophila utilizando fluorescencia eGFP.

Estudio del tráfico de proteínas de membrana en células fotorreceptoras de Drosophila utilizando proteínas marcadas con eGFP

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally ...

Las proteínas fotorreceptoras marcadas con GFP, como el canal iónico TRPL GFP, nos permiten estudiar el transporte de proteínas en las neuronas utilizando técnicas no invasivas. Este método también se puede utilizar para controlar la degeneración de los fotorreceptores. Por lo tanto, la base molecular de las enfermedades hereditarias que resultan en ceguera en humanos se puede estudiar en el ojo de Drosophila.La localización celular de proteínas marcadas con GFP se puede evaluar observando la fluorescencia en el pseudopúplo profundo o mediante microscopía de inmersión en agua. Ambos métodos permiten determinar rápidamente la localización de proteínas visuales y observar defectos estructurales de rabdomeros debido a la degeneración de las células fotorreceptoras. Para obtener imágenes de alta calidad, el aspecto más importante es la orientación del ojo de mosca.Al realizar esta técnica, uno debe centrarse en los ommatidios ubicados ligeramente hacia la periferia del ojo. Demostraré el procedimiento de imágenes DPP, mientras que las dos técnicas que utilizan microscopía de inmersión en agua serán demostradas por mi colega, la Dra. Krystina Wagner, y Matthias Zeger, un estudiante de doctorado en nuestro grupo. Para comenzar las imágenes profundas de pseudopúpido, o DPP, anestesia las moscas de uno a tres días de edad, y coloca una de ellas en el centro del objetivo del microscopio de lado para que el ojo izquierdo o derecho esté mirando hacia el objetivo con precisión radialmente.Aumente la ampliación para que se ajuste a todo el ojo y centre los ommatidios centrales del ojo. Si es posible, disminuya la profundidad de campo del microscopio ajustando el diafragma de doble iris a un ajuste poco profundo. A continuación, encienda la lámpara UV del microscopio a máxima intensidad.Luego, seleccione el conjunto de filtros de fluorescencia del microscopio de acuerdo con la proteína de fluorescencia expresada en los ojos y establezca la trayectoria de la luz hacia la cámara montada en el microscopio. Usando la función de imágenes en vivo dentro del software, ajuste el brillo de la imagen a una configuración que detecte solo señales específicas del ojo al aumentar el tiempo de exposición y ganar valor. Reajuste el foco del microscopio en el ojo para generar la imagen superpuesta del DPP.Luego, tome una instantánea del DPP fluorescente. Para preparar una mosca en una variación letal, adhiera un trozo de plastilina en un portaobjetos de objeto y otro trozo en el centro de una placa de Petri. Llene la placa de Petri con agua destilada helada y algunos copos de hielo.Luego, coloque una mosca anestesiada con hielo bajo un microscopio estereoscópico en la parte superior del portaobjetos recubierto de plastilina. Gire la mosca sobre su espalda y perfore un alfiler de insecto a través del centro del tórax. Fije el pasador horizontalmente en la diapositiva del objeto recubierto de plastilina y oriente el ojo izquierdo o derecho de la mosca hacia arriba.Luego, fije cuidadosamente la corredera del objeto con su lado libre de plastilina hacia abajo en la placa de Petri, evitando la rotación de la cabeza de la mosca. Asegúrese de que el ojo de mosca esté cubierto de agua. Alternativamente, para preparar una mosca en una variación no letal, transfiera la mosca anestesiada con hielo de cabeza a una punta de pipeta de 200 microlitros y empuje cuidadosamente la mosca hacia la punta con aire comprimido.Luego, usando un bisturí, corte la punta de la pipeta justo en frente de la cabeza y, con pinzas, empuje cuidadosamente la mosca unos milímetros en la punta de la pipeta. Corte la punta de la pipeta nuevamente y empuje la mosca hacia la punta con el aire comprimido para que solo la cabeza de la mosca sobresalga de la punta de la pipeta. Después de adherir un trozo de plastilina en un portaobjetos de objeto, presione la punta de la pipeta en él para que el ojo izquierdo o derecho mire hacia arriba.Asegúrese de que el ojo esté orientado correctamente bajo el microscopio. Para la adquisición de imágenes, seleccione un objetivo de inmersión en agua. En el caso de una variación no letal, use una pipeta de laboratorio para adherir una gran gota de agua fría a la parte inferior del objetivo de inmersión en agua.Coloque cuidadosamente el portaobjetos del objeto con la mosca preparada en el escenario del microscopio. Luego, baje el objetivo de inmersión en agua manualmente hasta que entre en contacto con la superficie del agua o el ojo de la mosca toque la gota. Luego, cambie la trayectoria de la luz hacia la cámara del microscopio y genere una imagen en vivo.Reajuste el enfoque para la cámara, y evalúe la orientación del ojo, considerando que el ojo debe mirar radialmente hacia el objetivo del microscopio. Utilice el software de tabla de búsqueda para detectar la sobresaturación. En el caso de moscas no pigmentadas, ajuste el tiempo de exposición de modo que los píxeles más brillantes estén justo por debajo del límite de saturación para cada imagen.Grabe una imagen y guárdela como un archivo sin procesar para archivar todos los metadatos correspondientes de la grabación. A continuación, exporte la imagen en formato tif. Para cuantificar la fluorescencia relativa de eGFP en los rabdomeros de las micrografías de inmersión en agua, ajuste la configuración de ImageJ haciendo clic en Analizar, luego en Establecer mediciones y marque solo la casilla valor gris medio.Importe la imagen tif haciendo clic en Archivo y, a continuación, en Abrir. Elija una región representativa de la imagen en foco y amplíela al 200 al 300% presionando repetidamente Control y juntos. A continuación, seleccione la herramienta Óvalo y, al presionar la tecla Mayús, genere una selección circular en la imagen que sea significativamente más pequeña que un rabdomero fluorescente.Luego, busque el tamaño exacto que se muestra debajo de la barra de herramientas en la ventana principal de ImageJ. Para medir las intensidades de fluorescencia dentro de la selección circular, mueva el círculo al primer rabdomero con las teclas de flecha del teclado y haga clic en Analizar y, a continuación, en Medir. Aparecerá una ventana de resultados que enumera el valor gris medido.Continúe con las mediciones de rabdomeros de dos a seis, y también mida la señal de fondo. En el caso de moscas no pigmentadas, realice mediciones adicionales de las áreas del cuerpo celular correspondientes. Mida la fluorescencia de dos ommatidios más, lo que resulta en tres réplicas técnicas.Marque los ommatidios analizados mediante la herramienta Lápiz y guarde esta imagen para la documentación. Seleccione y copie los valores grises medidos desde la ventana de resultados y péguelos en el software de hoja de cálculo para realizar cálculos adicionales. Ordene los valores de intensidad de fluorescencia según su origen en las categorías rabdomere, cuerpo celular y fondo, y calcule la intensidad media de cada categoría.Luego, calcule la cantidad relativa de eGFP presente en el rabdomero utilizando la primera fórmula para ojos no pigmentados y la segunda para ojos pigmentados. Alternativamente, para cuantificar la morfología ocular mediante fluorescencia eGFP en micrografías de inmersión en agua, elija tres ommatidios adyacentes en una región representativa de la imagen que está enfocada. Evalúe los 18 rabdomeros de la selección individualmente de acuerdo con su intensidad eGFP, nitidez de borde y contraste con respecto a la señal de fondo circundante.Finalmente, puntúe los rabdomeros claramente visibles con un valor de dos, los rabdomeros visibles semanales con un valor de uno y los rabdomeros ausentes con un valor de cero para generar un índice de degeneración. En las moscas transgénicas de Drosophila que expresan una proteína de fusión eGFP TRPL, la fluorescencia rabdomeral desaparece en la luz debido a la translocación de la TRPL eGFP. Esto permite realizar un cribado genético para identificar mutantes defectuosos en la internalización de la eGFP TRPL.En las moscas de control, eGFP TRPL se transloca de los rabdomeros al cuerpo celular después de 16 horas de iluminación, lo que resulta en una disminución significativa de la fluorescencia rabdomeral en comparación con el estado adaptado a la oscuridad. La segunda incubación oscura eleva la fluorescencia rabdomeral de nuevo hacia el valor inicial. Sin embargo, en la translocación TRPL mutante defectuoso vps35MH20, el patrón de fluorescencia no cambia drásticamente después de 16 horas de iluminación y una posterior adaptación a la oscuridad durante 24 horas.Este método de cuantificación puede detectar un defecto de reciclaje estadísticamente altamente significativo. Las moscas de ojos blancos permiten la detección de señales de fluorescencia tanto del rabdomero como del cuerpo celular. En contraste, en las moscas de ojos rojos, las señales de fluorescencia solo son detectables en rabdomeros, pero no en el cuerpo celular.Con respecto a la cuantificación de la degeneración de la retina, la fluorescencia eGFP TRP se puede evaluar en el transcurso de varias semanas. Cuando se mantuvo en un ciclo de oscuridad de 12 horas de luz y 12 horas durante dos semanas, el índice de degeneración disminuyó en las moscas mutantes, pero no en las moscas de control. En este protocolo, uno necesita diferenciar entre ojos pigmentados y no pigmentados.Dado que la pigmentación afecta a la señal fluorescente, la microscopía cuantitativa de inmersión en agua se ha optimizado para ambos casos individualmente. Las imágenes DPP y la microscopía de inmersión en agua son métodos de alto rendimiento con resolución limitada. Para investigar la localización subcelular, se recomienda la microscopía de inmunofluorescencia en secciones de tejido.Para un análisis detallado de los fenotipos degenerativos, se puede realizar microscopía electrónica.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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