Name: Protocolo para el modelado de blastoides humanos Desarrollo e implantación de blastocistos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Aprenda a generar blastoides humanos que replican el desarrollo temprano mediante células madre pluripotentes inducidas. Este protocolo permite estudiar la implantación embrionaria y mejorar aplicaciones terapéuticas en reproducción asistida.

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Este proyecto ha recibido financiación del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo de subvención ERC-Co n.º 101002317 'BLASTOID: una plataforma de descubrimiento para la embriogénesis humana temprana'). H.H.K. cuenta con el apoyo del Fondo Austriaco para la Ciencia (FWF), Lise Meitner Programme M3131-B. Agradecemos a Yasuhiro Takashima por compartir las líneas celulares H9 y H9-GFP, y a Austin Smith, Peter Andrews y Ge Guo por compartir las líneas celulares HNES1, Shef6, niPSC 16.2b y cR-NCRM2. Agradecemos a Hossein Baharvand por compartir los organoides endometriales. Agradecemos a Joshua M. Brickman por compartir el ARN aislado de células diferenciadas de PrE y células nEND. Agradecemos a Shankar Srinivas por compartir los datos de secuenciación de ARN unicelular del embrión de perigastrulación. Agradecemos a Aleksand Bykov y Luisa Cochella por la asistencia técnica para la preparación de la biblioteca SMARTSeq2. Agradecemos a las instalaciones de NGS, Biooptic y Stem Cell en IMBA por su asistencia crítica.

El Instituto de Biotecnología Molecular de la Academia de Ciencias de Austria ha presentado una solicitud de patente EP21151455.9 que describe los protocolos para la formación de blastoides humanos y el ensayo de interacción blastoide-endometrio. HK, AJ, HHK y NR son los inventores de esta patente. Todos los demás autores no declaran intereses contrapuestos.

En el presente estudio, mostramos, paso a paso, cómo establecer blastoides humanos con altas eficiencias utilizando un protocolo simple y robusto. Tras la agregación de hPSC PXGL naïve y su triple inhibición, los blastoides se forman de manera eficiente (> 70%) y generan secuencialmente los 3 análogos de blastocistos en 4 días. Las limitaciones en la eficiencia y la calidad de los blastoides (por ejemplo, la presencia de células fuera del objetivo) pueden ocurrir si el estado inicial es subóptimo. Cabe destacar que hemos medido que las hPSC PXGL contienen aproximadamente el 5% de las células que reflejan las etapas posteriores a la implantación. Estas células podrían limitar la formación de blastoides de alta calidad. Más allá del estado inicial ingenuo de PXGL que refleja el epiblasto blastocisto, otro factor fundamental es el medio utilizado para la formación de blastoides. Con el fin de formar rápidamente células similares a blastocistos y prevenir la formación de células similares a las postimplantaciones fuera del objetivo, proponemos que la inhibición de las vías triples (Hippo, ERK, TGF-β) es esencial. Mientras que las diferentes líneas celulares dan diferentes rendimientos de blastoideo en la inhibición de ERK / TGF-β (generalmente alrededor del 10% -20%), la exposición a LPA da como resultado la formación de un rendimiento de blastoides igualmente alto en todas las líneas celulares, mientras se utilizan estrictos criterios morfométricos y de especificación de linaje. LpA posiblemente actúa sobre la inhibición de la vía del hipopótamo, que juega un papel crítico en la primera segregación del linaje entre los linajes epiblasto y trofetodermo enratones y humanos 8,51. La mejora significativa de la eficiencia de los blastoides por LPA sugiere que los mecanismos de especificación de células internas-externas mediadas por la vía de Hippo en juego en el blastocisto son cooptados durante la formación de blastoides. Una limitación actual radica en el hecho de que, debido a una suboptimidad de los protocolos utilizados para cultivar blastocistos humanos o blastoides en el día 7-13 equivalente a un tiempo (después de la formación de blastocistos/blastoides), no somos capaces de evaluar hasta qué punto podemos modelar adecuadamente el desarrollo post-implantación.
El análisis del estado transcriptómico de las células blastoides se puede lograr fácilmente utilizando scRNAseq, mapas de referencia adecuados y métodos bioinformáticos. Anteriormente, el análisis transcriptómico mostró que las hPSC cultivadas en PXGL son más similares al epiblasto blastocisto en comparación con el estado cebado. Las limitaciones en el análisis de los datos pueden ocurrir si el mapa de referencia solo comprende células en etapa de blastocisto. El mapa de referencia debe incluir células procedentes de embriones postimplantados con el fin de evaluar la presencia de posibles células fuera del objetivo. En el futuro, con el fin de comparar las células blastoides, un mapa de referencia que incluya todos los tejidos del conceptus humano pre y postimplantación sería extremadamente valioso. Además, los mapas de referencia multiómicos de una sola célula, por ejemplo, incluyendo el transcriptoma, la accesibilidad a la cromatina y la metilación del ADN, ayudarían aún más. Finalmente, los métodos bioinformáticos estandarizados para evaluar cuantitativamente las similitudes entre las células de los modelos embrionarios y los conceptos de referencia, y para identificar positivamente las células fuera del objetivo ayudarían aún más a analizar y comparar los resultados de manera imparcial.
En conjunto, los blastoides formados por la triple inhibición de las vías Hippo, TGF-β y ERK poseen las cuatro características de 1) morfogénesis altamente eficiente, 2) secuencia correcta de especificación de linaje, 3) alta pureza de células similares a blastocistos a nivel de transcriptoma, 4) capacidad para modelar el desarrollo periimplantacional. Estas características de los blastoides facilitarán la construcción de hipótesis sobre el desarrollo e implantación de blastocistos, sin embargo, no recapitulan las primeras etapas del desarrollo embrionario. En contraste con la limitada accesibilidad y versatilidad del blastocisto humano, los blastoides son susceptibles de exámenes genéticos y farmacológicos para las investigaciones funcionales del desarrollo e implantación de blastocistos. En el futuro, estos conocimientos básicos podrían contribuir a mejorar la formulación de medios de FIV, desarrollar anticonceptivos posteriores a la fertilización y gestionar mejor el embarazo temprano.

La falta de modelos experimentales ha limitado la comprensión de la embriogénesis humana temprana. El conocimiento actual de los aspectos humanos específicos del desarrollo embrionario se deriva de los embriones excedentes de fertilización in vitro (FIV) donados para la investigación. Sin embargo, la limitada disponibilidad, las dificultades de las manipulaciones experimentales y la calidad variable de los embriones dificultan las investigaciones científicas. Por el contrario, un modelo in vitro fiel de embriones humanos permitiría manipulaciones experimentales complejas, proporcionando así una oportunidad ética para complementar la investigación en embriones humanos 1,2,3,4. Un modelo previamente desarrollado de blastocistos de ratón combinó células madre embrionarias de ratón y células madre trofoblásticas5. En este protocolo detallado, se describe un método para generar un modelo del blastocisto humano a partir de células madre pluripotentes naïve que es fiel a los criterios de blastocisto elemental6.
Cuatro criterios para los blastoides humanos. Aquí, en un intento de establecer una definición estandarizada de blastoides humanos, proponemos cuatro criterios mínimos. Aunque no son exhaustivos, estos criterios podrían servir de base para evaluar los parámetros que permiten la formación de blastoides humanos (Figura 1A). (1) Los blastoides deben formarse eficientemente en términos de morfología y de generación de los análogos de los tres linajes, a saber, epiblasto (Epi), trofoectodermo (TE) y endodermo primitivo (PrE). Es probable que la ineficiencia apunte a un estado celular inicial inadecuado o/o a una condición de cultivo (por ejemplo, medio blastoideo). (2) Los blastoides deben generar análogos de los tres linajes de acuerdo con la secuencia de desarrollo (Epi/TE primero, PrE/polarTE último)7,8 y el tiempo (inducción ~ 3 días; días embrionarios 5-7)7,9. (3) Los blastoides deben formar análogos de la etapa de blastocisto, pero no de las etapas posteriores a la implantación (por ejemplo, epiblasto postimplantación, trofoblasto o células de amnios). (4) Finalmente, los blastoides deben ser capaces de recapitular las características funcionales de la implantación y el desarrollo de blastocistos. Usando este protocolo, los blastoides humanos se forman de manera eficiente utilizando múltiples líneas celulares (>70%), son capaces de generar los análogos celulares de blastocistos secuencialmente y dentro de los 4 días, y los análogos son transcripcionalmente similares a la etapa de blastocisto (>96% basado en varios análisis)6,10,11. Finalmente, los blastoides generan robustamente el eje embrio-abembrionario, lo que les permite interactuar con las células endometriales estimuladas hormonalmente a través de la región polar, y expandir robustamente los linajes en el cultivo extendido (equivalente en el tiempo: día embrionario 13).
La importancia del estado inicial de la célula. Las células madre pluripotentes humanas (hPSC) se pueden estabilizar en diferentes estados que intentan capturar etapas precisas del desarrollo. Estos estados son sostenidos por condiciones de cultivo que, aunque todavía subóptimas, restringen las células en una etapa 12 de epiblasto preimplantacional (~ embrionario días 5-7) o postimplantacional (~ días embrionarios8-14). El análisis transcriptómico mostró que las hPSC cultivadas en PD0325901, XAV939, Gö6983 y el factor inhibidor de la leucemia (LIF; denominadas hPSC naïve PXGL)13,14 son más similares al epiblasto blastocisto en comparación con las hPSC cultivadas en factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) 2 y activina15 (denominadas hPSCs12 cebadas) y a células madre pluripotentes extendidas humanas (hEPSC)16 (ver análisis en las referencias17, 18,19). En consecuencia, el transcriptoma de las hPSC cebadas coincide mejor con un epiblasto de mono cynomolgus post-implantación/pre-gastrulación20. Criterios moleculares adicionales, como la expresión del transposón, la metilación del ADN y el estado del cromosoma X, confirmaron que las variaciones del estado ingenuo se asemejan más al epiblasto blastocisto en comparación con el estado cebado17,21. Finalmente, las líneas de hPSC naïve se han derivado con éxito directamente de blastocistos utilizando condiciones de cultivo PXGL22.
Las células de blastocisto temprano en humanos aún no están comprometidas. La especificación del linaje murino se produce a partir de la etapa de la mórula que precede a la etapa de blastocisto23. Por el contrario, los experimentos de disociación y reagregación han demostrado que las células del trofoectodermo humano de los blastocistos tempranos aún no están comprometidas24. En consecuencia, el análisis de las células de blastocistos humanos mediante secuenciación de ARN unicelular (scRNAseq) ha demostrado que la primera especificación de linaje (trofoblasto/epiblasto) se produce después de la formación de la cavidad del blastocisto7. Esta especificación humana diferida se correlaciona con las observaciones de que las hPSC son potentes para formar trofoblastos 25,26,27 cuando las PSC de ratón están en gran medida comprometidas con el linaje de epiblastos. Estas observaciones combinadas llevaron a la posibilidad de que las hPSC ingenuas reflejen una etapa de blastocisto y conserven el potencial de formar los tres linajes de blastocistos. Últimamente, se ha propuesto que la potencia de las hPSC para especificar análogos extraembrionarios cambia de trophectoderm a amnion durante la progresión de estado ingenuo a estado cebado27. Por lo tanto, las hPSC naïve son más similares a la etapa preimplantacional 17,18,21 y tienen una mayor capacidad para formar trofoblastos en comparación con las hPSCs27, hEPSC 16 o estados reprogramados intermedios28, que son propensos a formar análogos postimplantación10 (Figura 1B ). Por lo tanto, el estado celular inicial es crucial para formar los análogos extraembrionarios apropiados. Aunque aún queda por hacer un análisis exhaustivo lado a lado de los análogos del trofoectodermo convertidos, un estado ingenuo de PXGL que refleje el blastocisto temprano parece importante para formar blastoides de alta fidelidad.
Provoque la especificación y la morfogénesis mediante la inhibición de las vías de señalización. La inhibición de la vía de señalización de Hippo es un mecanismo conservado que impulsa la especificación de trofoblastos en ratones, vacas y humanos 9,29,30. Asimismo, desde 2013, se sabe que la inhibición del NODAL (A83-01) y la quinasa regulada por señal extracelular (ERK; PD0325901 o equivalente) y la activación de las vías de señalización de la proteína morfogenética ósea (BMP) desencadenan hPSCs preparadas para activar la red transcripcional asociada con el linaje trofoblasto 25,31,32,33,34. Además, recientemente varios informes también confirmaron que la inhibición de la vía NODAL y ERK y la activación de BMP facilitan la diferenciación trofoblástica de las hPSC naïve 25,31,32,33,34. Finalmente, si la especificación del trofoblasto se desencadena a partir de un estado ingenuo, las células recapitulan aspectos de la progresión del desarrollo del trofoectodermo26. Sin embargo, las líneas autorrenovadoras que reflejan el trofoectodermo del blastocisto no se han estabilizado in vitro. Siguiendo la especificación del trofoblasto, la inducción del factor de crecimiento epidérmico (EGF) y las vías de señalización Wnt junto con la inhibición de HDAC podría facilitar la progresión del desarrollo del trofoblasto 34,35 y estabilizar las células en líneas de células madre trofoblásticas humanas (hTSC) que reflejan citotrofofoblastos post-implantación 18,35. Tales líneas pueden derivarse tanto de blastocistos como de tejidos placentarios35.
El segundo linaje extraembrionario, denominado PrE, se especifica después de los trofoblastos y se origina en el epiblasto 7,9. Contrariamente a la PrE36 murina, se cree que la contraparte humana es independiente de la señalización FGF37,38. Las líneas que reflejan el endodermo extraembrionario (denominado nEnd) se establecieron a partir de hPSC naïve mediante la inducción de vías de señalización utilizando activina A, Wnt y LIF39. Inconsistente con los experimentos de inhibición embrionaria, se ha demostrado que la inhibición de ERK previene la formación de tales células nEND in vitro39. Hasta ahora, tales líneas no se han derivado directamente de blastocistos.
Últimamente, se han formado modelos del embrión temprano combinando variaciones de los medios previamente desarrollados para las células hTSCs35 y nEND39, utilizando así activadores del factor de crecimiento transformador β (TGF-β), EGF y las vías de señalización Wnt28,40. Estos modelos embrionarios se forman a baja eficiencia (10% -20%) y forman células que se asemejan a la etapa post-en lugar de pre-implantación10, incluyendo análogos del epiblasto post-implantación, trofoblasto, amnios, gastrula, tejidos mesodérmicos (~ embrionario día 14) y citotrofoblastos10. Por el contrario, una triple inhibición de las vías Hippo, ERK y TGF-β guía eficientemente la formación de blastoides que comprenden células similares a los blastocistos41. Junto con el estado celular inicial, proponemos que la inhibición de vías triples (Hippo, ERK, TGF-β) es el segundo parámetro esencial para formar blastoides de alta fidelidad (Figura 1B).
Evaluación del estado celular y la etapa reflejada utilizando scRNAseq. Los estados de las células que componen blastoides se pueden evaluar a través del análisis scRNAseq. Su similitud transcripcional con etapas embrionarias específicas se puede medir utilizando células blastoides solas y en comparación con hPSCs o hTSCs cebadas que reflejan las etapas post-implantación20,35. La realización de análisis de conglomerados utilizando diferentes niveles de definición revela cómo las subpoblaciones se fusionan progresivamente cuando la definición disminuye, revelando así las similitudes de los grupos. Aunque la optimalidad en el número de clusters se puede medir42, el clustering de alta resolución también informa sobre la eventual presencia de pequeñas subpoblaciones anormales, por ejemplo reflejando las etapas post-implantación10. Los genes expresados diferencialmente entre grupos pueden proporcionar información sobre sus análogos en el proceso de desarrollo mediante la evaluación de los niveles de expresión de los conjuntos de genes de referencia que definen los linajes específicos de la etapa. Esto permite medir el enriquecimiento de las subpoblaciones blastoides ya sea a través de mapas de distancia no supervisados (por ejemplo, utilizando genes enriquecidos superiores) o mediante análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA)43. Usando este protocolo blastoide, solo se forman tres grupos principales que reflejan transcripcionalmente los tres linajes de blastocistos. Un grupo incluye tanto las hPSC iniciales ingenuas como el análogo de epiblastos de los blastoides. El análisis de células en diferentes puntos de tiempo mostró la naturaleza secuencial de la especificación de linajes (los trofoblastos comienzan a especificar dentro de las 24 h y las células endodermos primitivas dentro de las 60 h). Una agrupación de alta resolución capturó una subpoblación de células (3,2%) que expresan genes específicos de embriones en etapa de gastrulación (posiblemente mesodermo o amnios). Cabe destacar que las hPSC iniciales ingenuas también comprendieron el 5% de las células similares a la postimplantación, como se describió anteriormente44. En un segundo análisis, las células blastoides se pueden fusionar in silico con células de referencia aisladas de concepti en diferentes etapas 45,46,47 para inferir la equivalencia de etapas. Aquí, se utilizaron como puntos de referencia células aisladas de concepti preimplantación 45,46, blastocistos cultivados in vitro 45 y embriones en estadio de gastrulación47. Usando este protocolo, se cuantificó que las células blastoides no coincidentes reveladas por agrupamiento de alta resolución de hecho se agrupan con mesodermo y amnio posterior a la implantación. En pasos futuros, la evaluación comparativa del transcriptoma debe complementarse con el análisis de la expresión del transposón, la metilación del ADN y el estado del cromosoma X, que también proporcionan puntos de referencia de las etapas del desarrollo21.
Evaluación de la formación de ejes y otras funcionalidades de blastoides humanos. Un blastocisto maduro se caracteriza por la formación del eje embrionario-abembrionario que modela trofoblastos para la implantación. Utilizando este protocolo blastoideo, se forma un eje robusto ejemplificado por una maduración de los trofoblastos proximales (por ejemplo, NR2F2+/CDX2-) que adquieren la capacidad de adherirse a las células organoides endometriales solo cuando son estimuladas hormonalmente48,49. La comparación con las trofoesferas que no forman el epiblasto muestra que estas células internas inducen a los trofoblastos colindantes a madurar para mediar la unión inicial al endometrio. Cuando se cultivan en un medio de cultivo extendido diseñado para blastocistos de mono cynomolgus50, los tres linajes del blastoide se expanden constantemente durante seis días adicionales (equivalente en el tiempo del día 13), aunque su organización no refleja esa etapa de desarrollo.
La implicación de los blastoides humanos de alta eficiencia y alta fidelidad. La conservación de los principios de desarrollo que se descubrieron en los organismos modelo es inherentemente difícil de probar en el conceptus humano debido al acceso restringido y a las dificultades técnicas para manipularlo genética y físicamente. Un modelo blastoide de alta eficiencia y alta fidelidad permitiría cribas genéticas y farmacológicas de alto rendimiento, que están en la base de los descubrimientos científicos y biomédicos. Además, la incorporación de modificaciones genéticas complejas para alterar y registrar los procesos biológicos complementaría dichos estudios. En general, proponemos que la triple inhibición (Hippo, TGF-β, ERK) de las hPSC PXGL ingenuas es conductora para la formación eficiente de blastoides humanos de alta fidelidad que cumplen con los cuatro criterios mínimos. La naturaleza escalable y versátil de este protocolo lo hace adecuado para generar hipótesis específicas que luego pueden validarse utilizando blastocistos humanos. Como tal, los blastoides humanos no reemplazarán el uso de conceptus humanos para la investigación in vitro , pero podrían actuar como una forma poderosa de canalizar la investigación a través de enfoques experimentales previamente inaccesibles en el corazón del proceso de descubrimiento científico y biomédico. El protocolo muestra cómo formar blastoides humanos y también cómo analizar las células que están contenidas dentro del blastoide.

<table><tbody><tr><td>Medios neurobasales</td><td>en casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>en casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100X N2 supplemen</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>50X B27 suplemento</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>100X Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>100 mM Piruvato de sodio</td><td>Gibco</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>MEM-Aminoácidos no esenciales</td><td>Gibco 11140050</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>en casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mM 2-Mercaptoethanol</td><td>Thermofisher</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>100X Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Suero bovino Solución de albúmina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7979</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Medchem express</td><td>HY-10254</td><td></td></tr><tr><td>XAV-939</td><td>Medchem express</td><td>HY-15147</td><td></td></tr><tr><td>G&ouml; 6983</td><td>Medchem express</td><td>HY-13689</td><td></td></tr><tr><td>Factor inhibidor de la leucemia recombinante humana</td><td>en casa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Medchem express</td><td>HY-10432</td><td></td></tr><tr><td>1-oleoil Ácido lisofosfatídico (LPA)</td><td>Peprotech</td><td>2256236</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Medchem express</td><td>HY-10583</td><td></td></tr><tr><td>CMRL medio</td><td>Gibco</td><td>21530027</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Suero KnockOut de Reemplazo (KSR)</td><td>Thermofisher</td><td>10-828-028</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Biozym</td><td>solución</td><td>de desprendimiento de células</td>B423201</tr><tr><td>Geltrex</td><td>Thermofisher</td><td>A1413302</td><td>factor de crecimiento extracto de membrana basal</td></tr><tr><td>anticuerpo TROP2</td><td>R& D sistemas</td><td>MAB650</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&alfa; anticuerpo</td><td>R& Sistemas D</td><td>AF307</td><td></td></tr><tr><td>SC-144</td><td>Axon</td><td>2324</td><td></td></tr><tr><td>XMU-MP-1</td><td>Med Chem Express</td><td>HY-100526</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de membrana basal</td><td>Matrigel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de la cámara de recuento de células Countess Portaobjetos</td><td>de recuento de células</td><td>Thermo fisher</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tinción DAPI</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-570</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo para el modelado de blastoides humanos desarrollo e implantación de blastocistos

Protocol for Human Blastoids Modeling Blastocyst Development and Implantation

Un modelo del blastocisto humano formado a partir de células madre (blastoide) apoyaría los avances científicos y médicos. Sin embargo, su poder predictivo dependerá de su capacidad para recapitular de manera eficiente, oportuna y fiel las secuencias de desarrollo de blastocistos (morfogénesis, especificación, patrones), y para formar células que reflejen la etapa de blastocisto. Aquí mostramos que las células madre pluripotentes humanas ingenuas cultivadas en condiciones PXGL y luego triplemente inhibidas para el hipopótamo, transformando el factor de crecimiento β y las vías de quinasa reguladas por señales extracelulares se someten eficientemente a la morfogénesis para formar blastoides (>70%). Coincidiendo con el tiempo de desarrollo (~ 4 días), los blastoides desenrollan la secuencia de especificación del blastocisto mediante la producción de análogos del trofoblasto y el epiblasto, seguidos de la formación de análogos del endodermo primitivo y los trofoblastos polares. Esto resulta en la formación de células transcripcionalmente similares al blastocisto (>96%) y una minoría de análogos post-implantación. Los blastoides modelan eficientemente formando el eje embrionario-abembrionario marcado por la maduración de la región polar (NR2F2+), que adquiere el potencial específico para unirse direccionalmente a las células endometriales estimuladas hormonalmente, como en el útero. Tal blastoide humano es un modelo escalable, versátil y ético para estudiar el desarrollo humano y la implantación in vitro.

Típicamente, las hPSC naïve cultivadas en PXGL (Figura 2A) son estructuras agregadas y cavitadas que emergen entre 48 y 72 h después de la inducción PALLY y alcanzan un diámetro de 150-250 μm dentro de las 96 h (Figura 2B). Utilizando un número óptimo (1) de células de siembra, (2) la duración de la agregación previa al cultivo con N2B27 (0 a 24 h), (3) la concentración de componentes químicos individuales (especialmente LPA) y (4) la duración del tratamiento con PALLY, la eficiencia de inducción alcanza el 70% -80% según se define en función de los parámetros morfométricos (tamaño total de 150-250 μm, cavidad regular única, grupo de células internas únicas; Figura 2C,D) y la presencia de los tres linajes. Un estado celular inicial subóptimo y / o condiciones de inducción darán como resultado una formación de blastoides menos eficiente o nula. Para garantizar la máxima eficiencia y formar solo análogos preimplantacionales, es crucial utilizar un cultivo de alta calidad de hPSC PXGL ingenuas. Esto se puede evaluar midiendo por FACS el porcentaje de células positivas para los marcadores de superficie SUSD2 (estado ingenuo) y CD24 (estado cebado). Los marcadores de superficie adicionales específicos para los linajes extraembrionarios fuera del objetivo (por ejemplo, amnios, mesodermo extraembrionario) también serían útiles, pero, hasta donde sabemos, actualmente no están disponibles. Si la eficiencia de formación obtenida es inferior a los resultados reportados, es importante revisar cuidadosamente todos los componentes del medio blastoide, especialmente el LPA que se reconstituye en PBS y que, como ligando GPCR, puede ser más inestable en comparación con las moléculas sintéticas reconstituidas en DMSO. En la mayoría de los casos, incluso si el rendimiento no es máximo, las estructuras cavitadas todavía están compuestas por los tres linajes de blastocistos. La aparición de tres linajes de blastocistos y la formación del eje embrionario-abembrionario pueden confirmarse por la tinción de inmunofluorescencia de marcadores (EPI: NANOG, OCT4, TE: GATA3, Polar-TE NR2F2, Mural-TE: CDX2, PrE: GATA4; Figura 2E,G). Las trofosferas, que solo están compuestas de TE, ayudan a diseccionar aún más el papel de la comunicación intercelular. Las trofosferas pueden formarse con una eficiencia del 50% -60% dentro de las 96 h de la inducción (Figura 2H, I). La formación de blastoides se puede realizar no solo en matrices de micropocillos caseras, sino también en placas de pozo 96 de fijación ultra baja disponibles comercialmente con optimización de las condiciones de inducción (consulte el Protocolo y la Figura 2J). Los blastoides también tienen la capacidad de desarrollarse aún más durante 6 días adicionales, que es equivalente en el tiempo del embrión del día 13, con protocolo de diferenciación in vitro (Figura 2K).
Para caracterizar aún más el estado celular de las células blastoides, se debe utilizar la tecnología de secuenciación de ARN unicelular. UMAP se aplica comúnmente para visualizar una distribución de estados celulares y se realiza un análisis de agrupamiento no supervisado para evaluar la proximidad de estados celulares individuales. Los diferentes parámetros en el análisis de datos de una sola celda pueden afectar la forma en que se muestran las celdas en los UMAP, lo que lleva a clústeres con diferentes posiciones y formas espaciales y relativas (Figura 3A). Sin embargo, en este análisis, las células muestran perfiles de clustering marcadamente reproduciblemente distintos independientemente de los parámetros utilizados para realizar el clustering y la visualización de los datos, lo que permite distinguir con alta confianza los tres linajes de blastocistos. Utilizamos como referencia células de embriones cosechados en diferentes etapas de desarrollo. La fusión de estos conjuntos de datos muestra que la mayoría de los análogos del trofoectodermo de blastoides se agruparon con el trofoectodermo preimplantacional, pero no con los trofoblastos postimplantacionales (Figura 3B). Estos resultados también fueron confirmados por un consorcio independiente10.
Cuando se introducen embriones gastrulatantes en estadio Carnegie 7 (CS7) en el mapa de referencia, una pequeña población de células blastoides (3%) se agrupa con los linajes mesodermo y amnios de estos embriones (Figura 3C). Cuando se introducen células similares a los amnios en el mapa de referencia, una pequeña población de células blastoides (&lt; 2%) se agrupa con tales células similares a los amnios.
En general, solo las estructuras que comprenden una sola cavidad regular, un solo grupo de células internas, un tamaño total que oscila entre 150-250 μm, que comprende análogos transcriptómicos de los tres linajes de blastocistos, y en gran medida desprovistos de otros linajes (por ejemplo, amnios, mesodermo, mesodermo extraembrionario) se consideran blastoides humanos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63388/63388fig01.jpg"> Figura 1: Cuatro características y dos enfoques para generar blastoides de alta fidelidad. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63388/63388fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63388/63388fig02.jpg"> Figura 2: Blastoides y trofosferas derivadas de agregados de hPSC ingenuo. (A) Imágenes de contraste de fase que muestran hPSC naïve cultivadas en medio PXGL cocultivadas con MEF irradiado. Barra de escala: 50 μm. (B) Imágenes de contraste de fase que muestran el cambio morfológico de agregados de hPSCs naïve cultivados en una matriz de micropocillos de hidrogel no adherente con LPA de 500 nM (medio PALLY). Barra de escala: 200 μm. (C) Blastoides humanos formados en una matriz de micropocillos después de 96 h. Barras de escala: 400 μm. (D) Cuantificación del porcentaje de micropocillos que contienen un blastoide humano inducido por la condición de cultivo PALLY con concentración optimizada de LPA a partir de diferentes líneas hPSC ingenuas (n = 3 matrices de micropocillos). (E) Tinción de inmunofluorescencia de blastoides humanos con marcadores de epiblasto (EPI) (amarillo) NANOG y OCT4; los marcadores TE (cian) CDX2 y GATA3; y el marcador primitivo de endodermo (magenta) SOX17 y GATA4. Barra de escala: 100 μm. (H-I) Cuantificación del número celular (izquierda) y porcentaje de células (derecha) pertenecientes a cada linaje en blastoide (96 h) en base a tinción de inmunofluorescencia de OCT4, GATA3 y GATA4. (G) Tinción por inmunofluorescencia de blastoides humanos para CDX2 (cian) y NR2F2 (magenta). (F) Imágenes de contraste de fase de trofoes en etapa temprana y tardía en matriz de micropocillos inducidas por adición de 3 μM SC144 (H) o 2 μM XMU-MP-1 (I), respectivamente. (J) Imágenes de contraste de fase que muestran el cambio morfológico de agregados hPSCs ingenuos cultivados en placa de pocillo 96 de fijación ultra baja con 500 nM LPA (medio PALLY). (K) Imagen de contraste de fase (izquierda) y tinción de inmunofluorescencia (derecha) para OCT4 (amarillo), GATA3 (cian) y GATA4 (magenta) en blastoide cultivado en condición de cultivo postimplantacional durante 6 días. Barra de escala: 100 μm. Esta cifra se adapta de 6,10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63388/63388fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63388/63388fig03.jpg"> Figura 3: Caracterización de la composición de blastoides mediante secuenciación unicelular. (A) Análisis de agrupamiento no supervisado con diferentes parámetros en UMAP del transcriptoma de células individuales derivados de los diferentes puntos de tiempo de blastoide (24 h, 60 h, 96 h), hPSC naïve, hPSCs cebadas y hTSC (representan el citotrofoblasto postimplantación). (B) UMAP del transcriptoma de células derivadas de blastoides (96 h), hPSC naïve y hPSC cebadas integradas con conjuntos de datos publicados de embriones humanos de etapas preimplantacionales, periimplantacionales (blastocistos cultivados in vitro ) y gastrulación (etapa 7 de Carnegie, es decir, entre E16-19). Las células individuales se colorean en función de su origen en embriones humanos (izquierda), células derivadas de blastoides o células madre (centro) y el resultado del análisis de agrupamiento no supervisado (derecha). (C) UMAP del transcriptoma de células derivadas de blastoides, hPSC naïve, hPSCs cebadas, e integrados con el conjunto de datos publicados del embrión en etapa de gastrulación (etapa Carnegie 7, es decir, entre E16-19). Las células individuales se colorean en función de su origen en embriones humanos (izquierda), células derivadas de blastoides o células madre (centro) y el resultado del análisis de agrupamiento no supervisado (derecha). Esta cifra está adaptada de6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63388/63388fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla suplementaria 1: Toda la composición de los medios utilizada en este estudio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63388/Supplementary%20Table%201%20_RE.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

Un protocolo que describe la formación de blastoides humanos que generan de manera eficiente, oportuna y secuencial células similares a los blastocistos.

Protocolo para el modelado de blastoides humanos Desarrollo e implantación de blastocistos

A model of the human blastocyst formed from stem cells (blastoid) would support scientific and medical advances. However, its predictive power will depend ...

La investigación en embriones humanos está limitada por su baja disponibilidad y preocupaciones éticas, por lo que la obtención de modelos individuales que reproduzcan fielmente el desarrollo humano temprano apoyaría el progreso científico y médico. La capacidad de esta técnica para predecir el desarrollo humano depende de su capacidad para reproducir las secuencias de determinación celular de blastocistos y morfogénesis de manera efectiva, de acuerdo con la secuencia y el ritmo de desarrollo, y dicho modelado aseguraría la formación de células que realmente reflejen la etapa de blastocisto. En el futuro, los blastoides humanos pueden utilizarse para identificar dianas terapéuticas y contribuir a la modelización preclínica, por ejemplo, para mejorar un medio de fertilización in vitro o para desarrollar anticonceptivos no hormonales.Demostrando el procedimiento estarán Harunobu Kagawa, Alok Javali, Heidar Heidari Khoei, Theresa Maria Sommer y Giovanni Sestini. Para comenzar, prepare y precaliente los medios PXGL, los medios basales N2B27, el tampón de lavado, el PBS y los medios de agregación. Excluya los MEF de la suspensión de hPSC para formar blastoides.Para la exclusión de MEF, prepare una placa recubierta de gelatina agregando un mililitro de gelatina al 0.1% en el pozo de una placa de seis pocillos. Incubar las placas a 37 grados centígrados durante 30 a 90 minutos. Para cosechar las células, retire el medio y lave las células con un milímetro de PBS.Agregue 500 microlitros de solución de desprendimiento celular a cada pocillo de una placa de seis pocillos e incube a 37 grados Celsius durante cinco minutos. Revise las células bajo el microscopio para seguir la disociación de las colonias en células individuales. Diluya la solución de desprendimiento celular con un mililitro de tampón de lavado.Recoja las células de la placa pipeteando suavemente de cinco a 10 veces. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros. Gire hacia abajo las células a 200 RCF durante cuatro minutos.Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1,5 mililitros de medio PXGL en cada pocillo. Sembra las células en las placas recubiertas de gelatina para la exclusión de MEF, e incuba las placas a 37 grados Celsius durante 60 a 90 minutos. Una vez que las células naïve se siembran para la exclusión de MEF, retire el PBS de MicroWells y equilibre los pozos con 200 microlitros de medio basal N2B27 para cada chip MicroWell, e incube durante 60 minutos a 37 grados Celsius.Recoge el sobrenadante que contiene las células ingenuas no unidas. Transfiéralo a un tubo de 15 mililitros y haga girar las células a 200 RCF durante cuatro minutos. Deseche los medios y vuelva a suspender las células en un mililitro de medios basales N2B27.Cuente las celdas mediante diapositivas de recuento de celdas. Gire hacia abajo las células a 200 RCF durante cuatro minutos. Deseche el medio y agregue una cantidad adecuada de medios N2B27 que contengan 10 micromolares Y27632 para obtener una densidad celular de 30, 000 células por 50 microlitros.Retire el medio de las matrices MicroWell equilibradas y agregue 25 microlitros de medios N2B27 con 10 micromolares Y27632. Agregue 50 microlitros de suspensión celular e incube a 37 grados Celsius durante 15 minutos para permitir que las células caigan en el fondo del MicroWell. Luego agregue 125 microlitros de medio N2B27, complementados con 10 micromolares Y27632.Dentro de las 24 horas, se observarán agregados de hPSC ingenuas en el chip MicroWell. Iniciar la formación de blastoides preparando el medio PALY. Precalentarlo a 37 grados centígrados durante 30 minutos.Retire el medio de agregación y agregue 200 microlitros de medio PALY precalentado a los MicroWells. Coloque la placa de cultivo celular de nuevo en una incubadora hipóxica a 37 grados centígrados. Repita el cambio de medios el primer día.En el segundo día, retire el medio PALY y agregue 200 microlitros de medio N2B27, complementado con LPA y 10 micromolares Y27632. Repita el cambio de medios en el tercer día. La formación completa de blastoides ocurre en el cuarto día.Preparar la suspensión de células hPSC ingenuas para la formación de blastoides como se describió anteriormente. Deseche el medio y agregue una cantidad adecuada de medios N2B27 que contengan 10 micromolares Y27632 para obtener la densidad celular de 70 células por cada 100 microlitros del medio. Para agrupar las células en el fondo de los pocillos, centrífuga la placa a 200 RCF durante dos minutos a temperatura ambiente.Incubar la placa a 37 grados centígrados en condiciones de cultivo hipóxico. Dentro de las 24 horas, se observarán agregados de hPSC ingenuas en los pozos. Agregue 100 microlitros de medio PALY recién preparado y precalentado dos veces a los pozos.Vuelva a colocar la placa de cultivo celular en una incubadora hipóxica a 37 grados centígrados. Después de 24 horas, deseche la mitad del medio y reemplácelo con 100 microlitros de medio PALY precalentado. Repita el paso hasta el cuarto día.Preparar la suspensión celular HPSC ingenua para la formación de la troposfera como se describió anteriormente. Una vez que se hayan formado agregados de HPSC naïve después de 24 horas, intercambie el medio de agregación con PALY sin LIF, complementado con tres SC144 micromolares para formar trofoesferas que representen el trofoectodermo temprano. Para formar trofoesferas que representen el trofoectodermo maduro, intercambie el medio de agregación con PALY, complementado con dos micromolares XMUMP1.Refresque el medio diariamente. La formación completa de la trofosfera ocurre en el cuarto día. Para evaluar los estados celulares, compare los datos transcriptómicos de blastoides y trofoesferas con los controles apropiados, incluidas las células madre de trofoblastos humanos similares a la implantación.Las hPSC ingenuas cultivadas en PXGL fueron estructuras agregadas y cavitadas que surgieron entre 48 y 72 horas después de la inducción de PALY, y alcanzaron un diámetro de 150 a 250 micrómetros en 96 horas. Sobre la base de parámetros morfométricos y la presencia de los tres linajes, la eficiencia de inducción alcanzó el 70 al 80% Las trofosferas se formaron a una eficiencia del 50 al 60% dentro de las 96 horas posteriores a la inducción. La formación de blastoides tuvo éxito en placas de 96 pocillos de fijación ultra baja disponibles comercialmente en condiciones de inducción optimizadas.La tecnología de secuenciación de ARN unicelular se utilizó para caracterizar aún más el estado de las células blastoides. Las células muestran perfiles de agrupamiento marcadamente reproduciblemente distintos, independientemente de los parámetros utilizados para realizar la agrupación y visualización de datos, lo que permitió distinguir los tres linajes de blastocistos con confianza. Entre las 24 y las 60 horas, las células madre pluripotentes PXGL forman análogos del epiblasto y del trofoectodermo.Luego, entre 60 y 96 horas, se forman análogos del trofoectodermo polar y del endodermo primitivo. Esta es la secuencia de especificación dentro del blastocisto, por lo que los blastoides recapitulan la secuencia de desarrollo de la especificación del linaje. La fusión de conjuntos de datos de blastoides con el conjunto de datos de referencia de células aisladas de embriones en diferentes etapas de desarrollo mostró que el 97% de las células de blastoides se agruparon con las células de blastocisto, pero no con células de embriones posteriores a la implantación.Un análisis independiente confirmó que, con el tiempo, las células madre formaron células que coincidieron transcripcionalmente con las células de embriones humanos entre el día cinco y 7.5. Esta es de hecho la etapa de desarrollo durante la cual se forma el blastocisto humano. También confirmaron que más del 95% de las células dentro de los blastoides tienen un transcriptoma que coincide con los tres linajes celulares de blastocistos, mientras que el 3% de las células estaban fuera del objetivo y coincidían con las etapas posteriores a la implantación.Cabe destacar que observamos que nuestros cultivos 2D iniciales también comprenden aproximadamente el 5% de las células objetivo. La etapa de desarrollo equivalente también se puede visualizar observando los patrones de expresión de marcadores específicos como CDX2 para el trofoectodermo blastocisto y PRMD14 para el epiblasto blastocisto. La calidad del cultivo inicial de PXGL es absolutamente crucial, y el número de células dentro del agregado inicial también es crítico, y se puede controlar utilizando MicroWells.El tamaño total del agregado celular después de 24 horas debe ser de aproximadamente 50 a 70 micrómetros. La formación eficiente de blastoides completos de fase está allanando el camino para estudiar los procesos de implantación y desarrollo posterior a la implantación del embrión humano.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

En este vídeo, se demuestra el aislamiento de los blastocistos de ratón y la derivación de células madre del trofoblasto de los blastocistos. También describe las condiciones para el mantenimiento de la propiedad de células madre, así como la inducción de diferenciación en la cultura.

Derivación de células madre de ratón a partir de blastocistos Trofoblasto

El destino de una célula embrionaria individual puede ser influenciada por las moléculas hereditarias y / o por las señales de las células vecinas. Utilizando los mapas de destino de la etapa de escisión de embriones de Xenopus, blastómeras individuales pueden ser identificados por la cultura de forma aislada para evaluar las contribuciones de moléculas hereditarias frente a las interacciones célula-célula.

Los explantes blastómeras para la Prueba de Compromiso destino celular durante el desarrollo embrionario

MicroSecure Vitrification se desarrolló como un sistema de dispositivo de vitrificación cerrado aséptico y no comercial que cumple con las buenas prácticas de fabricación y manipulación de tejidos de la FDA. Debido a la retirada de las pajuelas de embriones hidrofóbicas de la industria, el procedimiento de vitrificación se modificó para incluir un sello interior antes del tapón interno de algodón estándar.

La vitrificación modificada MicroSecure: Un procedimiento altamente seguro, simple y eficaces de crioconservación de blastocistos humanos

Aquí presentamos un protocolo de Time-lapse morfométricos para seguir la intensidad de la contracción de blastocisto y re-expansión durante intervenciones previtrification y la recuperación post calentamiento. La aplicación del protocolo en vitro fecundación laboratorios con microscopios de lapso de tiempo es posible y se recomienda en el desarrollo de un método de vitrificación de blastocistos óptima.

Morfométricos de protocolo para la evaluación objetiva del comportamiento del blastocisto durante la vitrificación y el calentamiento pasos

La biopsia de blastocisto y la vitrificación son necesarias para realizar pruebas genéticas preimplantacionales de manera eficiente. Un enfoque que implica la apertura secuencial de la zona pellucida y la recuperación de 7-8 células de trophectoderm en el día 5-7 post-inseminación limita tanto el número de manipulaciones requeridas como la exposición del embrión a condiciones ambientales subóptimas.

Biopsia y vitrificación de blastocisto humano

Aquí, describimos un método para calentar blastocistos humanos vitrificados, cultivarlos a través del período de implantación in vitro, digerirlos en células individuales y recoger las células trofoblastas tempranas para su posterior investigación.

Colección de células únicas de células trofoblastas en embriones humanos en fase de implantación

Este protocolo describe metodologías para establecer un modelo de implantación embrionaria in vitro simple y eficiente para evaluar las moléculas relevantes que afectan el proceso de implantación embrionaria.

Establecimiento de un modelo de implantación embrionaria in vitro

En este estudio, describimos un método sencillo para realizar el análisis de Evans Blue Dye (EBD) en larvas de pez cebra.  Esta técnica es una herramienta poderosa para la caracterización de la integridad del músculo esquelético y la delineación de modelos de distrofia muscular de pez cebra, y es un método valioso para el desarrollo de nuevas terapias.

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

La tecnología de microarrays permite la medición cuantitativa y el perfil de expresión génica de transcripciones en todo el genoma. Por lo tanto, este protocolo proporciona un procedimiento técnico optimizado en una matriz bovina personalizada de dos colores utilizando embriones bovinos de día 7 para demostrar la viabilidad de usar una baja cantidad de ARN total.

Transcriptoma de perfiles de In-Vivo Productos fabricados preimplantación de embriones bovinos mediante plataforma de microarrays de dos colores

Aquí presentamos un protocolo que provocó la reactividad del cortisol en una muestra adolescente mexicana vulnerable utilizando una versión modificada del Test de Estrés Social de Trier (TSST). Se recogieron muestras de saliva al inicio del estudio, 15, 30 y 45 minutos después de la TSST. Las investigaciones futuras podrían utilizar este TSST modificado con jóvenes vulnerables.

Una Prueba de Estrés Social Modificada de Trier para Adolescentes Mexicanos Vulnerables

Aprenda a generar blastoides humanos que replican el desarrollo temprano mediante células madre pluripotentes inducidas. Este protocolo permite estudiar la implantación embrionaria y mejorar aplicaciones terapéuticas en reproducción asistida.

Protocolo para el modelado de blastoides humanos Desarrollo e implantación de blastocistos

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