Name: Determinación de la distribución de la longitud de la cadena de glucano del glucógeno utilizando el método de electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Aprenda a determinar la distribución de longitud de cadena del glucógeno mediante electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos. Este método permite analizar la estructura del glucógeno y comprender enfermedades metabólicas.

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Este trabajo fue apoyado por el CNRS, la Université de Lille CNRS y las becas ANR "MathTest" (ANR-18-CE13-0027).

1. Incubación con enzimas desramificantes
<ol><li>Mezclar 200 μL de glucógeno purificado a 0,5-2 mg/ml con 200 μL de 100 mM de tampón de acetato (pH 4,8). Añadir 2 μL de isoamilasa (180 U/mg de proteína) y 1,5 μL de pullulanasa (30 U/mg de proteína) (ver Tabla de Materiales), mezclar suavemente mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo, e incubar a 42 °C durante 16 h en un tubo de 1,5 ml. NOTA: La degradación o la contaminación por amilasa pueden ocurrir durante el proceso de purificación del glucógeno. Para apreciar la presencia de malto-oligosacáridos libres, las muestras se pueden incubar sin el cóctel de enzimas desramificantes en paralelo. Se incluye un estándar (por ejemplo, maltoheptodateosa) en el análisis para determinar la relación entre el tiempo de elución y el grado de polimerización.</li>
	<li>Detenga las reacciones incubando a 95 °C durante 5 min.</li>
	<li>Centrifugar a 16.100 x g durante 5 min a temperatura ambiente para peletizar y retirar cualquier material insoluble.</li>
	<li>Retire los sobrenadantes con una pipeta y transfiéralos a nuevos tubos anotados. Desalar los sobrenadantes añadiendo el equivalente a 100 μL de perlas de resina de intercambio aniónico/catiónico (AG-501-X8, ver Tabla de Materiales) y agitar.<ol>
<li>Agita regularmente las cuentas durante 5 min. Recoger las muestras mediante pipeteo y colocarlas en nuevos tubos anotados.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Liofilizar o utilizar un evaporador de vacío configurado (ver Tabla de Materiales) a 30 °C para secar las muestras.</li>
	<li>Almacene las muestras secas a temperatura ambiente o a -20 °C. NOTA: Las muestras se pueden almacenar durante 1 mes.</li>
</ol>2. Aminación reductiva
<ol><li>Mezclar las muestras secas con 2 μL de 1 M de cianoborohidruro de sodio en tetrahidrofurano (THF) y 2 μL de APTS (5 mg de APTS resuspendido en 48 μL de ácido acético al 15%) (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Incubar a 42 °C durante 16 h en la oscuridad. PRECAUCIÓN: El cianoborohidruro de sodio se maneja con equipos de protección personal adaptados y bajo una capucha química. La inhalación y el contacto con la piel son altamente tóxicos y pueden ser fatales, causando quemaduras graves en la piel y daños en los ojos. Se pueden generar gases altamente tóxicos al mezclar cianoborohidruro de sodio con ácido acético. En contacto con el agua, el cianoborohidruro de sodio libera gases inflamables, que pueden encenderse espontáneamente. Las muestras concentradas se manejan bajo una campana química y utilizando equipos de protección personal adaptados a partir de este paso.</li>
</ol>3. Análisis FACE
<ol><li>Añadir 46 μL de agua ultrapura a cada muestra.</li>
	<li>Diluir las muestras directamente a 1/50 en micro viales de 100 μL añadiendo 1 μL de la muestra a 49 μL de agua ultrapura. Mantenga las muestras en la oscuridad mientras configura el FACE (5-10 min).</li>
	<li>Realice electroforesis de polaridad inversa con un instrumento de electroforesis capilar con un detector de fluorescencia inducida por láser (LIF) (consulte la Tabla de materiales). Ajuste la polaridad en "modo inverso" para la separación, ajuste el LIF en la longitud de onda de emisión de 488 nm y el detector en 512 nm.</li>
	<li>Ajuste el tiempo de inyección durante 10 s y la presión de inyección a 0,5 psi.</li>
	<li>Llevar a cabo la separación de glucanos marcados con APTS a 30 kV en un capilar de sílice fundido desnudo de 60,2 cm de longitud con un diámetro interior de 50 μm (diámetro exterior de 375 μm) en el tampón de separación de carbohidratos ligados a N diluido a 1/3 en agua ultrapura (ver Tabla de Materiales). NOTA: El tampón de separación de carbohidratos ligado a N se reemplaza cada 20 carreras.</li>
</ol>4. Tratamiento de datos
<ol><li>Exportar el ". ASC "y ". CDF "archivos que contienen el perfil de electroferograma y los datos de integración, respectivamente.</li>
	<li>Abra el archivo . ASC y dibuje la unidad de fluorescencia relativa de acuerdo con el gráfico de tiempo.</li>
	<li>Abra el archivo . CDF , proceda con una primera integración automática y ajuste los siguientes parámetros: ancho; integración valle a valle; superficie mínima.</li>
	<li>Compruebe y corrija manualmente cualquier evento de integración incorrecto.</li>
</ol>

<ol><li>Konkolewicz, D., Thorn-Seshold, O., Gray-Weale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+randomly+hyperbranched+polymers%3A+Theory+and+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Models for randomly hyperbranched polymers: Theory and simulation.</a> The Journal of Chemical Physics. 129 (5), 054901(2008).</li>
<li>Deng, B., Sullivan, M. A., Wu, A. C., Li, J., Chen, C., Gilbert, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+for+stopping+chain+and+total-molecule+growth+in+complex+branched+polymers%2C+exemplified+by+glycogen%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">The mechanism for stopping chain and total-molecule growth in complex branched polymers, exemplified by glycogen.</a> Biomacromolecules. 16 (6), 1870-1872 (2015).</li>
<li>Besford, Q. A., Sullivan, M. A., Zheng, L., Gilbert, R. G., Stapleton, D., Gray-Weale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+cardiac+glycogen+in+healthy+mice%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">The structure of cardiac glycogen in healthy mice.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 51 (5), 887-891 (2012).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+glycogen+in+escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BioMacromolecules%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of glycogen in escherichia coli.</a> BioMacromolecules. 20 (7), 2821-2829 (2019).</li>
<li>Ball, S., Colleoni, C., Cenci, U., Raj, J. N., Tirtiaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+glycogen+and+starch+metabolism+in+eukaryotes+gives+molecular+clues+to+understand+the+establishment+of+plastid+endosymbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">The evolution of glycogen and starch metabolism in eukaryotes gives molecular clues to understand the establishment of plastid endosymbiosis.</a> Journal of Experimental Botany. 62 (6), 1775-1801 (2011).</li>
<li>Zhang, P., Nada, S. S., Tan, X., Deng, B., Sullivan, M. A., Gilbert, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+glycogen+biosynthesis+through+Monte+Carlo+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Exploring glycogen biosynthesis through Monte Carlo simulation.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 116, 264-271 (2018).</li>
<li>Melendez-Hevia, E., Waddell, T. G., Shelton, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+molecular+design+in+the+evolution+of+metabolism%3A+The+glycogen+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimization of molecular design in the evolution of metabolism: The glycogen molecule.</a> Biochemical Journal. 295 (2), 477-483 (1993).</li>
<li>Meléndez, R., Meléndez-Hevia, E., Cascante, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+did+glycogen+structure+evolve+to+satisfy+the+requirement+for+rapid+mobilization+of+glucose%3F+A+problem+of+physical+constraints+in+structure+building%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Evolution%22%5BJournal%5D)">How did glycogen structure evolve to satisfy the requirement for rapid mobilization of glucose? A problem of physical constraints in structure building.</a> Journal of Molecular Evolution. 45 (4), 446-455 (1997).</li>
<li>Meléndez, R., Meléndez-Hevia, E., Canela, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fractal+structure+of+glycogen%3A+A+clever+solution+to+optimize+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The fractal structure of glycogen: A clever solution to optimize cell metabolism.</a> Biophysical Journal. 77 (3), 1327-1332 (1999).</li>
<li>Wang, L., Wise, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+with+short+average+chain+length+enhances+bacterial+durability%5BTitle%5D)+AND+%22Naturwissenschaften%22%5BJournal%5D)">Glycogen with short average chain length enhances bacterial durability.</a> Naturwissenschaften. 98 (9), 719-729 (2011).</li>
<li>Kanungo, S., Wells, K., Tribett, T., El-Gharbawy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+metabolism+and+glycogen+storage+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Glycogen metabolism and glycogen storage disorders.</a> Annals of Translational Medicine. 6 (24), 474(2018).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+structure+of+glycogen+serving+as+a+durable+energy+reserve+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the structure of glycogen serving as a durable energy reserve in bacteria.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 36 (1), 14(2020).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+in+situ+progressive+N-terminal+is+still+controversial+truncation+of+glycogen+branching+enzyme+in+Escherichia+coli+DH5%CE%B1+on+glycogen+structure%2C+accumulation%2C+and+bacterial+viability%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Influence of in situ progressive N-terminal is still controversial truncation of glycogen branching enzyme in Escherichia coli DH5α on glycogen structure, accumulation, and bacterial viability.</a> BMC Microbiology. 15 (1), 1-14 (2015).</li>
<li>Bernard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+physiological+mechanism+of+sugar+formation+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">On the physiological mechanism of sugar formation in the liver.</a> Proceedings of the Academy of Sciences. 44 (12), 578-586 (1857).</li>
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<li>O'Shea, M. G., Samuel, M. S., Konik, C. M., Morell, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorophore-assisted+carbohydrate+electrophoresis+%28FACE%29+of+oligosaccharides%3A+Efficiency+of+labelling+and+high-resolution+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE) of oligosaccharides: Efficiency of labelling and high-resolution separation.</a> Carbohydrate Research. 307 (1-2), 1-12 (1998).</li>
<li>Koizumi, K., Fukuda, M., Hizukuri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+distributions+of+chain+length+of+amylopectins+by+high-performance+liquid+chromatography+with+pulsed+amperometric+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Estimation of the distributions of chain length of amylopectins by high-performance liquid chromatography with pulsed amperometric detection.</a> Journal of Chromatography A. 585 (2), 233-238 (1991).</li>
<li>Morell, M. K., Samuel, M. S., Shea, M. G. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+starch+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Analysis of starch structure.</a> Electrophoresis. 19, 2603-2611 (1998).</li>
<li>Guttman, A., Chen, F. -T. A., Evangelista, R. A., Cooke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+capillary+gel+electrophoresis+of+reducing+oligosaccharides+labeled+with+1-Aminopyrene-3%2C6%2C8-trisulfonate%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">High-resolution capillary gel electrophoresis of reducing oligosaccharides labeled with 1-Aminopyrene-3,6,8-trisulfonate.</a> Analytical Biochemistry. 233 (2), 234-242 (1996).</li>
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<li>Sun, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+glycogen+serves+as+a+critical+glucosamine+cache+required+for+protein+glycosylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Brain glycogen serves as a critical glucosamine cache required for protein glycosylation.</a> Cell Metabolism. 33 (7), 1404-1417 (2021).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses asociados con este trabajo.

Las propiedades fisicoquímicas de las partículas de glucógeno (por ejemplo, tamaño, morfología, solubilidad) están directamente asociadas con la longitud de los glucanos que componen las partículas. Cualquier desequilibrio entre las enzimas biosintéticas y catabólicas resulta en la alteración de la distribución de la longitud de la cadena y , per se, la acumulación de glucógeno anormal que puede ser peligroso para la célula11. El análisis FACE es un método de elección para determinar la distribución de longitud de cadena (CLD) del glucógeno. Como se muestra en la Figura 2, la determinación de CLD permite la inferencia del valor promedio de longitud de cadena del glucógeno (ACL), que refleja la estructura de las partículas de glucógeno. Los glucógenos animales con altos valores de LCA se asocian con la aparición de partículas anormales. El análisis sustractivo es un método útil para comparar dos muestras de glucógeno de diferentes orígenes genéticos (mutante versus wildtype). Al trazar en una escala logarítmica los CLD normalizados al pico máximo, por otro lado, tiene la ventaja de comparar CLD independientemente de una referencia y nos dio información sobre el mecanismo de crecimiento del glucógeno.
Además, el análisis FACE es una técnica poderosa para caracterizar las propiedades catalíticas de las enzimas metabolizadoras de glucógeno. Por ejemplo, todas las enzimas ramificadas de glucógeno se escinden (1 → 4)-α enlaces y transfieren grupos oligomaltosiles a una posición (1 → 6)-α o puntos de ramificación. Las enzimas ramificadas son distinguibles debido a su afinidad por los polisacáridos (por ejemplo, amilopectina, glucógeno) y la longitud de los glucanos transferidos a pesar del mecanismo catalítico similar22. Por lo tanto, varias fuentes de enzimas ramificadas (humanas, vegetales, bacterias) se pueden caracterizar y clasificar a través de una serie de experimentos de incubación y comparaciones de CLD utilizando el análisis FACE23.
Como se mencionó en la introducción, HPAEC-PAD es también un método alternativo para determinar la distribución de la longitud de la cadena18. Ambas técnicas requieren la hidrólisis completa de (1 → 6)-α enlaces o puntos de ramificación mediante enzimas desramificantes de tipo isoamilasa antes de separar el pool de glucanos lineales según su grado de polimerización (DP). Sin embargo, el método HPAEC-PAD alberga dos desventajas en comparación con FACE: (1) la respuesta amperométrica del pulso disminuye a medida que aumentan las cadenas de glucano, lo que no proporciona información cuantitativa. Este problema de sesgo de masa se puede eludir utilizando HPAEC-ENZ-PAD que involucra un reactor enzimático posterior a la columna entre la columna de intercambio aniónico y PAD24. El reactor enzimático de columna hidroliza los malto-oligosacáridos en residuos de glucosa permitiendo una respuesta amperométrica de pulso constante. (2) El HPAEC-PAD permite la separación de cadenas de glucano con un grado de polimerización de hasta 70. Aunque la resolución es suficiente para determinar la EPC de las muestras de glucógeno, FACE separa las cadenas con DP de hasta 150, adecuado para muestras de almidón17. Es esencial tener en cuenta que tanto el análisis HPAEC-PAD como el FACE tienen pros y contras. Por ejemplo, la reacción de aminación requiere un grupo hemiacetal libre para reaccionar con la función de amina primaria del APTS. Esto implica que el etiquetado APTS no se puede utilizar para cadenas de glucano que carecen de extremos reductores (por ejemplo, inulina). El método HPAEC-PAD no requiere la presencia de extremos reductores. Un segundo aspecto interesante del método HPAEC-PAD es que la columna de intercambio aniónico se puede cargar con unos pocos miligramos de glucanos lineales, lo que permite la purificación de malto-oligosacárido con un DP específico o 14malto-oligosacárido radiomarcado C para ensayo enzimático 18,25. Finalmente, aunque la espectrometría de masas (por ejemplo, MALDI-TOF) es una técnica rápida y sensible para determinar la distribución de la longitud de la cadena, esta técnica parece ser menos reproducible. Sobreestima la cantidad de cadenas largas de glucano26. Sin embargo, este último se puede utilizar para una aplicación específica como las imágenes MALDI para mapear la presencia de glucógeno en el tejido celular27.

El glucógeno, utilizado como almacenamiento de carbono y energía, es un homopolímero de glucosa que consiste en cadenas lineales de unidades glucosil unidas por (1 → 4)-enlaces α y unidas a través de (1 → 6)-α enlaces glicosídicos o puntos de ramificación. Aparecen como partículas β y α en el citosol de una amplia gama de organismos. β-partículas son pequeñas partículas solubles en agua observadas principalmente en procariotas. Su diámetro oscila entre 20-40 nm, probablemente dictado por las enzimas metabolizadoras de glucógeno y el obstáculo estérico 1,2.
Descritos por primera vez en células animales, las partículas α más grandes muestran hasta 300 nm de diámetro con una forma similar a la coliflor. Esta organización particular puede originarse a partir de la agregación de varias partículas β o puede surgir al surgir de una sola partícula β3. Curiosamente, un estudio reciente ha reportado la presencia de partículas de α en Escherichia coli4. Sin embargo, a diferencia de las partículas α de las células animales, estas últimas se desmoronan rápidamente durante el proceso de extracción, lo que puede explicar la falta de datos en la literatura4. La aparición de partículas de α en eucariotas y procariotas involucra enzimas metabolizadoras de glucógeno filogenéticamente no relacionadas5. Esto plantea preguntas sobre la función de tales partículas y la naturaleza de los posibles agentes de reticulación entre β partículas5.
Aunque se propusieron dos modelos matemáticos opuestos para la formaciónde moléculas de glucógeno 6,7,8,9, generalmente se acepta que las partículas de β han evolucionado en respuesta a su función metabólica como una reserva de combustible altamente eficiente para la liberación rápida de grandes cantidades de glucosa. Un gran cuerpo de evidencia indica que las propiedades del glucógeno, como la digestibilidad y la solubilidad en agua, se correlacionan con la longitud promedio de la cadena (LCA), que luego dictará el porcentaje de puntos de ramificación y el tamaño de partícula 2,6,7,8,10,11 . El LCA se define por la relación entre el número total de residuos de glucosa y el número de puntos de ramificación. Típicamente, los valores de LCA varían de 11-14 y 7-23 residuos de glucosa en eucariotas y procariotas, respectivamente10. En los seres humanos, varias enfermedades del trastorno del glucógeno se deben a la acumulación anormal de glucógeno. Por ejemplo, la enfermedad de Andersen se asocia con la actividad deficiente de una enzima ramificadora de glucógeno, lo que resulta en la acumulación de glucógeno anormal11. En procariotas, los estudios acumulativos sugieren que el LCA es un factor crítico que afecta la tasa de degradación del glucógeno y la capacidad de supervivencia bacteriana12,13. Se ha informado que las bacterias que sintetizan β partículas con un bajo valor de LCA se degradan más lentamente y, por lo tanto, resisten las condiciones de inanición por más tiempo. Por lo tanto, el conocimiento de la arquitectura de las partículas β es esencial para comprender la formación de partículas anormales de glucógeno en las enfermedades de almacenamiento de glucógeno humano y la supervivencia de los procariotas en un entorno deficiente en nutrientes.
Desde el primer aislamiento del glucógeno del hígado de perro por el fisiólogo francés Claude Bernard a finales del siglo XIX14, se desarrollaron muchas técnicas para caracterizar las partículas de glucógeno en detalle. Por ejemplo, microscopía electrónica de transmisión para la morfología del glucógeno (partículas α o β)15, espectrometría protón-RMN para determinar el porcentaje de enlaces α-1,616, cromatografía de exclusión de tamaño con multidetectores para inferir el peso molecular, electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE)17 o cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento con detección amperométrica pulsada (HPAEC-PAD) tanto para la distribución de longitud de cadena (CLD) como para ACL determinación18.
Este trabajo se centra en el método de electroforesis de carbohidratos asistidos por fluoróforos, que se basa en la aminación reductora del grupo hemiacetal por función primaria de amina. Históricamente, el ácido trisulfónico 8-amino-1,3,6-naftaleno (ANTS) se utilizó por primera vez para el etiquetado. Más tarde, fue reemplazado por el fluoróforo más sensible, el ácido trisulfónico de pireno 8-amino 1,3,6 (APTS)19.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig01.jpg"> Figura 1: La reacción de aminación reductiva con ácido 8-amino 1,3,6 pireno trisulfónico (APTS). Reacción de aminación reductiva del grupo hemiacetal por función de amina primaria de ácido 8-amino 1,3,6 pireno trisulfónico (APTS) en condiciones reductivas <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Como se muestra en la Figura 1, la función hemiacetal del extremo reductor de una cadena de glucano interactúa con la amina primaria de APTS en condiciones reductoras. Los grupos sulfónicos de APTS llevan cargas negativas que permiten la separación de las cadenas de glucano según su grado de polimerización (DP). La reacción reductiva de la amina es altamente reproducible y eficiente. Se obtiene una eficiencia media de etiquetado del 80% para DP3 a DP135 y de hasta el 88% y el 97% para la maltosa (DP2) y la glucosa, respectivamente17,20. Debido a que una molécula de APTS reacciona con el extremo reductor de cada cadena de glucano, las cadenas individuales podrían cuantificarse y compararse entre sí sobre una base molar.

<table><tbody><tr><td>AG-501-X8 Resina</td><td>BioRad</td><td>#1436424</td><td>Almacenamiento Temperatura ambiente</td></tr><tr><td>100 mM tampón de acetato de sodio, pH 4,8</td><td></td><td></td><td>Disuelva 0,82 g de acetato de sodio en 80 mL de agua. Ajuste el pH a 4.8 con ácido acético y complete el volumen a 100 mL con agua; Almacenamiento a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Solución madre de APTS</td><td>Merck</td><td>09341-5MG</td><td>Disolver 5 mg de APT en 48 mL de ácido acético 0,2 M. Almacenamiento a -20 °C.</td></tr><tr><td>Separaciones capilares</td><td>Sciex, Les Ulis, Francia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chromeleon 6.80 SR8 Build 2623</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>seleccione :Archivo>importar/restaurar>ANDI/cromatografía en la ventana abierta: seleccione "agregar" seleccione cdf&nbsp; archivo > importar > siguiente Elija la carpeta donde se descargará su archivo en el software Chromeleon> termine haga clic en QNT-Editor> parámetro "Área mínima" seleccione "Rango" 0.05 [Señal]*min.</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Abrir Excel> Nuevo archivo> guarde el archivo > menú Archivo haga clic en Importar > En la ventana abierta elija "csv." como archivo de tipo > seleccione su archivo asc > aparecerá una nueva ventana Paso 1: elija Macintosh o &nbsp; Window y, a continuación, se utilizó la configuración predeterminada para los pasos 2 y 3. > valores Y aparecen en la columna A> Agregue manualmente una columna Tiempo incrementando 0,25 segundos a cada celda que corresponda a la frecuencia (4 Hz) para los datos de adquisición. A continuación, trace el gráfico.</td></tr><tr><td>Aparato de secado libre</td><td>Christ</td><td>alpha 2-4 LO plus</td><td>antes del proceso de liofilización-secado, las muestras se almacenan a -80 & grados; C durante 1 h.</td></tr><tr><td>Isoamilasa</td><td>Megazyme</td><td>E-ISAMY</td><td>180 U/mg de proteína</td></tr><tr><td>Maltoheptosa</td><td>Merck</td><td>M7753</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de separación de carbohidratos N-Linked</td><td>Sciex Separations, Les Ulis, Francia</td><td>477623</td><td>Almacenamiento a 4 & grados; C</td></tr><tr><td>Pululanasa</td><td>Megazyme</td><td>E-PULKP</td><td>30 U/mg de proteína</td></tr><tr><td>Cianoborohidruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296813-100ML</td><td>1 M Cianoborohidruro de sodio en THF</td></tr><tr><td>Evaporador al vacío</td><td>Eppendorf</td><td>Concentrador 5301</td><td>Ajuste la temperatura a 30 ° C. Centrifugar hasta que las muestras se sequen</td></tr></tbody></table>

determinación de la distribución de la longitud de la cadena de glucano del glucógeno utilizando el método de electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (face)

Determination of Glucan Chain Length Distribution of Glycogen Using the Fluorophore-Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) Method

Las partículas de glucógeno son polisacáridos ramificados compuestos por cadenas lineales de unidades de glucosilo unidas por enlaces glucósidos α-1,4. Estos últimos están unidos entre sí por enlaces glucósidos α-1,6, conocidos como puntos de ramificación. Entre las diferentes formas de almacenamiento de carbono (es decir, almidón, β-glucano), el glucógeno es probablemente uno de los polisacáridos de almacenamiento más antiguos y exitosos que se encuentran en todo el mundo vivo. Las cadenas de glucano están organizadas para que una gran cantidad de glucosa pueda almacenarse o alimentarse rápidamente en una célula cuando sea necesario. Numerosas técnicas complementarias se han desarrollado en las últimas décadas para resolver la estructura fina de las partículas de glucógeno. Este artículo describe la electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE). Este método cuantifica la población de cadenas de glucano que componen una partícula de glucógeno. También conocido como distribución de longitud de cadena (CLD), este parámetro refleja el tamaño de partícula y el porcentaje de ramificación. También es un requisito esencial para el modelado matemático de la biosíntesis de glucógeno.

Determinación de la longitud media de la cadena de glucógeno La Figura 2 representa el flujo de trabajo necesario para inferir la distribución de la longitud de la cadena y la longitud media de la cadena (LCA) del glucógeno.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig02.jpg"> Figura 2: Flujo de trabajo para determinar la distribución de longitud de cadena (CLD) y la longitud media de la cadena. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La Figura 3 muestra los electroferogramas de la maltohexasa comercial y el glucógeno hepático bovino desramificado. Las señales de fluorescencia observadas entre 4.13-4.67 min en todos los experimentos se originaron a partir del APTS no reaccionado. El tiempo de elución de la maltohexa marcada (DP6) se estimó en 8,49 min (Figura 3A). Los glucanos marcados con APTS del glucógeno bovino se identificaron en función del tiempo de elución de DP6 (Figura 3B). No se detectó rastro de malto-oligosacárido libre en la muestra de control (glucógeno no incubado con enzimas desramificantes) (Figura 3C).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig03.jpg"> Figura 3: Electroferogramas de un glucógeno hepático estándar y bovino. (A) La elución temporal (8,49 min) de un estándar de glucano, la maltohexasa (DP6), se utilizó como referencia para determinar el grado de polimerización (DP) de los glucanos marcados con APTS liberados del glucógeno hepático bovino después de la acción de las actividades enzimáticas desramificantes (B ). El panel insertado muestra una separación de las cadenas de glucano de hasta 44 DP. Paralelamente, se etiquetó glucógeno bovino no tratado con APTS para detectar posibles trazas de malto-oligosacáridos libres en la muestra (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Se puede concluir que la liberación de glucano marcado con APTS se debe a la escisión de los puntos de ramificación por las actividades de la isoamilasa y la pullulanasa. Debe tenerse en cuenta que el perfil de electroforesis capilar se puede volver a dibujar en un formato más apropiado para crear una figura de mosaico que contenga varios perfiles. Para hacer esto, los archivos DATA que contienen valores de fluorescencia se generan con la extensión "asc" y se abren en el programa de hoja de cálculo eligiendo el formato CSV (valor separado por comas). Desafortunadamente, los valores de fluorescencia exportados no están asociados con el tiempo de elución correspondiente. En consecuencia, deben agregarse manualmente de acuerdo con la configuración de la frecuencia de adquisición en el aparato FACE (4 Hz significa una adquisición de valor cada 0,25 s).
Las áreas pico se infirieron utilizando la aplicación nativa del instrumento FACE o se exportaron como un archivo DATA con una extensión "cdf" para usar otra aplicación. Los valores de área se exportan en un programa de hoja de cálculo y se normalizan expresando el DP como un porcentaje del área de superficie total (Figura 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig04.jpg"> Figura 4: Normalización de datos, distribución de la longitud de la cadena y valor medio de la longitud de la cadena. Las áreas pico de fluorescencia fueron importadas y normalizadas en una hoja de cálculo. La distribución de la longitud de la cadena se muestra como el porcentaje de DP para cada DP. La longitud media de la cadena (LCA) se calcula sumando cada cadena porcentual multiplicada por el grado correspondiente de polimerización. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Finalmente, la longitud media de la cadena (LCA) se infiere calculando la suma de cada cadena porcentual multiplicada por el grado correspondiente de polimerización. Se llevaron a cabo experimentos similares por triplicado en glucógeno hepático de conejo (Figura 5A), en glucógeno hepático bovino (Figura 5B) y glucógeno de ostra (Figura 5C).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig05.jpg"> Figura 5: Distribución de la longitud de la cadena del glucógeno comercial. El hígado de conejo (A), el hígado bovino (B) y el glucógeno de ostra (C) se incubaron en presencia de enzimas desramificantes (isoamilasa y pullulanasa). Los glucanos marcados con APTS se separaron de acuerdo con su grado de polimerización (DP) mediante el análisis FACE. La maltosa (DP2), la maltohexaosa (DP6) la maltoheptorosa (DP7) representan los glucanos más abundantes en el hígado de conejo, la ostra y el glucógeno hepático bovino, respectivamente. El error estándar de media (SEM) se dedujo de tres experimentos independientes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La distribución de la longitud de la cadena del glucógeno hepático de conejo mostró claramente un mayor contenido de malto-oligosacárido corto (DP2) que el glucógeno hepático bovino (DP 7) o el glucógeno de ostra (DP6). Como resultado, el glucógeno hepático de conejo posee la longitud de cadena promedio más baja (LCA = 9,8) en comparación con el glucógeno hepático bovino (LCA = 11,9) y el glucógeno de ostras (LCA = 12,6). Cabe señalar que esos glucógenos comerciales se utilizan generalmente para evaluar la actividad de la glucógeno fosforilasa o glucógeno sintasa. Esto sugiere que la determinación de los parámetros cinéticos (Vmax y Km) de las actividades enzimáticas metabolizadoras del glucógeno variará según la fuente de glucógeno.
Análisis sustractivos El análisis sustractivo es un método simple para comparar la distribución de las cadenas de glucano de dos muestras. Por ejemplo, se determinaron los CLD de glucógeno producido por la cepa Synechocystis PCC6803 de tipo salvaje (WT) y las cepas mutantes isogénicas únicas glgA1 y glgA2 (Figura 6A).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63392/63392fig06.jpg"> Figura 6: Comparación de las distribuciones de longitud de cadena mediante análisis sustractivo. (A) Las distribuciones de longitud de cadena de glucógeno purificado a partir de cepas cianobacterianas: Synechocystis PCC6803 de tipo salvaje (WT) y cepas mutantes isogénicas únicas glgA1 y glgA2 se determinaron mediante el análisis FACE. El error estándar de media (SEM) se dedujo de tres experimentos independientes. (B) Los análisis sustractivos se realizaron restando el % de cada DP de WT al % de cada DP de ΔglgA1 y restando el % de cada DP de WT al % de cada DP de DP de DP ΔglgA2. Esta manipulación matemática directa muestra la alteración de las cadenas de glucano en cepas mutantes (líneas negras). (C) Las distribuciones de longitud de cadena promedio de glucógeno de tipo silvestre y mutantes de Synechocystis se normalizaron de acuerdo con el pico máximo observado para cada CLD (DP6 para todas las muestras). Dos componentes se evidencian al trazar la CLD normalizada en una escala logarítmica (Nde (DP)). Cada componente indica un mecanismo diferente de parada del crecimiento (para obtener más información, consulte la Referencia2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63392/63392fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para recordar, la mayoría de las cepas de cianobacterias poseen dos genes que codifican las actividades de la glucógeno sintasa: GlgA1 y GlgA221. Ambas enzimas transfieren el residuo de glucosa ADP a los extremos no reductores de las cadenas lineales de glucano. Como se muestra en la Figura 6A, es difícil comparar muestras mirando solo los perfiles de distribución de longitud de cadena. El análisis sustractivo consiste en restar el porcentaje de cada DP entre muestras (Figura 6B). El análisis sustractivo de %DP de WT menos % de DP ΔglgA1 mutante revela un exceso de DP3, 4 y 5 (valores negativos) y una disminución del contenido de DP 10-20. Por el contrario, el análisis sustractivo entre %DP de WT y % de DP ΔglgA2 mutante indica un efecto opuesto. Debido a que los perfiles de análisis sustractivo son diferentes entre GlgA1 y GlgA2, esto sugiere una función específica de cada isoforma de glucógeno sintasa en la biosíntesis de glucógeno21.
Es importante tener en cuenta que el análisis sustractivo solo es aplicable a experimentos que involucran una muestra de referencia realizada en paralelo con las muestras. De lo contrario, el análisis sustractivo puede ser empírico, ya que se basa en la EPC normalizada de la referencia. En 2015, Deng y sus colaboradores, que investigaron los mecanismos de detención del crecimiento de glucógeno en ratones y humanos, propusieron un trazado alternativo e interpretación de los CLD de glucógeno para abordar este problema. Esta gráfica utiliza el área máxima de pico para normalizar cada CLD. Los datos se trazan en una escala logarítmica que resalta dos componentes. Estos últimos ilustran dos mecanismos diferentes para la detención de la elongación de la cadena2. Al dibujar líneas que se ajustan al componente DP superior, se pueden utilizar parámetros absolutos (es decir, pendientes e intersecciones de las líneas) para la comparación de CLD sin normalización a un perfil de referencia. Los CLD de la cepa Synechocystis PCC6803 de tipo salvaje (WT) y los mutantes isogénicos únicos glgA1 y glgA2 se trazaron en una escala logarítmica, y se determinaron las líneas de ajuste para cada perfil (Figura 6C). El primer componente fue muy similar entre las muestras, alcanzando un máximo de DP 6. Esto ilustra que la enzima ramificadora produce explícitamente un máximo de tales cadenas. El segundo componente apareció como un hombro ancho, que ya se describió para ratones y glucógenos humanos2. La inclinación del segundo componente surgió a un DP más alto en ΔglgA1 y la pendiente de la línea de ajuste correspondiente (línea roja) fue menor que el perfil de tipo salvaje. Por lo tanto, la falta de GlgA1 ralentiza la detención de la elongación de la cadena durante la biosíntesis que se propuso que ocurriera por un obstáculo estérico para ratones y glucógeno humano2. Estos datos sugieren que la enzima alargadora restante (es decir, GlgA2) produce cadenas más largas antes de la aglomeración de la cadena. En ΔglgA2, se observó el efecto contrario con una caída más dramática de la línea de ajuste, corroborando que las cadenas producidas por el GlgA1 restante son en general más cortas que las sintetizadas por GlgA2 solo antes del obstáculo estérico. Este análisis sugiere que ambas isoformas poseen cinéticas distintas y/o que su respectiva concertación con la actividad enzimática ramificada difiere.

En el presente protocolo, la técnica de electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE) se utiliza para determinar la distribución de la longitud de la cadena (CLD) y la longitud media de la cadena (ACL) del glucógeno.

Determinación de la distribución de la longitud de la cadena de glucano del glucógeno utilizando el método de electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE)

Glycogen particles are branched polysaccharides composed of linear chains of glucosyl units linked by &#945;-1,4 glucoside bonds. The latter are attached ...

Este método proporciona una mejor comprensión de las organizaciones estructurales de las partículas de glucógeno. Es un tema importante porque la población de las cadenas de glucano, la llamada distribución de longitud de cadena, determina las propiedades físico-químicas de las partículas de glucógeno. Como la solubilidad en agua.Una ventaja importante de esta técnica es que la fluorescencia es constante independientemente de la longitud de la cadena de glucano. Sólo hay una molécula de APTS unida por el glucano. Por lo tanto, la intensidad de la fluorescencia es directamente proporcional al número de cadenas de glucano.El campo para la electroforesis capilar asistida es adecuado para resolver el mecanismo médico de las enzimas metabolizadoras de glucógeno. Por ejemplo, podemos determinar el grado de polimerización de las cadenas de glucano transferidas por las enzimas ramificadas sobre el glucano aceptado. La reacción debe realizarse en condiciones.Por lo tanto, las regiones deben protegerse de la humedad. Mezcle 200 microlitros de 0.5-2 miligramos por mililitro de glucógeno purificado con 200 microlitros de 100 tampón de acetato de pH 4.8. Añadir 2 microlitros de Isoamilasa, y 1,5 microlitros de Pullulanasa.Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Luego incuba a 42 grados centígrados durante 16 horas en un tubo de 1,5 mililitros. Detenga las reacciones incubando a 95 grados centígrados durante 5 minutos.Centrifugar a 16, 100 veces G'durante 5 minutos a temperatura ambiente para peletizar y eliminar cualquier material insoluble. Retire el súper mantenimiento con una pipeta y transfiéralos a nuevos tubos anotados. Después de agregar perlas de resina en un tubo vacío de microfuge, desalar los sobrenadantes agregando el equivalente a 100 microlitros de perlas de resina de intercambio catiónico aniónico y agitar.Recoja las muestras mediante pipeteo y colóquelas en nuevos tubos anotados. Seque congele las muestras. Guarde las muestras secas a temperatura ambiente o a 20 grados centígrados.Mezclar las muestras secas con 2 microlitros de 1 cianoborohidruro de sodio molar y tetrahidrofurano, y 2 microlitros de ácido trisulfónico de pireno 8 amino 1-3-6. Incubar a 42 grados centígrados durante 16 horas en la oscuridad. Agregue 46 microlitros de agua ultra pura a cada muestra.Para diluir las muestras 50 veces, agregue un microlitro de la muestra a 49 microlitros de agua ultra pura en microviales de 100 microlitros. En vórtice para mezclar a fondo. Coloque las muestras en la oscuridad durante 5 a 10 minutos mientras coloca la cara.Para realizar la electroforesis de polaridad inversa, configure el método, ajuste la presión de inyección a 0.5 libras de fuerza por pulgada cuadrada. A continuación, establezca la polaridad en modo inverso para la separación. Diluya el tampón de separación de carbohidratos ligado al N a un tercio en agua ultra pura.Llevar a cabo la separación de glucanos marcados con APTS en el tampón diluido a 30 kilovoltios en un capilar de sílice fundido desnudo. A continuación, configure el tiempo de inyección e inicie el análisis. Exporte los archivos ASC y CDF que contienen el perfil de electroferograma y los datos de integración, respectivamente.Abra el archivo ASC y dibuje la unidad de fluorescencia relativa de acuerdo con el gráfico de tiempo. Abra el archivo CDF. Proceda con una primera integración automática y ajuste los siguientes parámetros con integración valle a valle y área mínima.Compruebe y corrija manualmente cualquier evento de integración incorrecto. Las señales de fluorescencia observadas entre 4,13 y 4,67 minutos se originaron a partir del APTS no reaccionado. El tiempo de Aleutiana de la Maltohiosa DP 6 etiquetada se estimó en 8,49 minutos.Los glucanos marcados con APTS de glucógeno bovino se identificaron en función del tiempo de las Aleutianas de DP 6. No se detectó ningún rastro de Maltooligosacárido libre en la muestra de control en la que el glucógeno no se incubó con enzimas desramificantes. El panel insertado muestra una separación de cadenas de glucano de hasta 44 DP. La distribución de la longitud de la cadena se muestra como el porcentaje de DP para cada DP. La longitud media de la cadena se calculó sumando cada porcentaje de cadena multiplicado por el grado correspondiente de polimerización.El análisis facial mostró que los glucanos más abundantes son maltosa e hígado de conejo, maltohexaosa en la ostra y maltoheptolosa en el hígado bovino. Las distribuciones de longitud de cadena de glucógeno purificado a partir de cepas bacterianas cianobacterianas de tipo silvestre y mutantes se determinaron mediante análisis facial. Los análisis sustractivos se realizaron restando el porcentaje de cada DP de tipo salvaje del porcentaje de cada DP de mutantes.Las distribuciones de longitud de cadena promedio de glucógeno de tipo salvaje y mutantes de Synechocystis se normalizaron de acuerdo con el pico máximo observado para cada CLD. Esta técnica permite una mejor comprensión de las enfermedades humanas asociadas con un defecto en el metabolismo del glucógeno, particularmente la enfermedad de Andersen, ricos resultados de la acumulación de partículas anormales de glucógeno en las células.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Determinación de la distribución de la longitud de la cadena de glucano del glucógeno utilizando el método de electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE)

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