Determinación de la distribución de la longitud de la cadena de glucano del glucógeno utilizando el método de electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE)

Este método proporciona una mejor comprensión de las organizaciones estructurales de las partículas de glucógeno. Es un tema importante porque la población de las cadenas de glucano, la llamada distribución de longitud de cadena, determina las propiedades físico-químicas de las partículas de glucógeno. Como la solubilidad en agua.

Una ventaja importante de esta técnica es que la fluorescencia es constante independientemente de la longitud de la cadena de glucano. Sólo hay una molécula de APTS unida por el glucano. Por lo tanto, la intensidad de la fluorescencia es directamente proporcional al número de cadenas de glucano.

El campo para la electroforesis capilar asistida es adecuado para resolver el mecanismo médico de las enzimas metabolizadoras de glucógeno. Por ejemplo, podemos determinar el grado de polimerización de las cadenas de glucano transferidas por las enzimas ramificadas sobre el glucano aceptado. La reacción debe realizarse en condiciones.

Por lo tanto, las regiones deben protegerse de la humedad. Mezcle 200 microlitros de 0.5-2 miligramos por mililitro de glucógeno purificado con 200 microlitros de 100 tampón de acetato de pH 4.8. Añadir 2 microlitros de Isoamilasa, y 1,5 microlitros de Pullulanasa.

Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Luego incuba a 42 grados centígrados durante 16 horas en un tubo de 1,5 mililitros. Detenga las reacciones incubando a 95 grados centígrados durante 5 minutos.

Centrifugar a 16, 100 veces G'durante 5 minutos a temperatura ambiente para peletizar y eliminar cualquier material insoluble. Retire el súper mantenimiento con una pipeta y transfiéralos a nuevos tubos anotados. Después de agregar perlas de resina en un tubo vacío de microfuge, desalar los sobrenadantes agregando el equivalente a 100 microlitros de perlas de resina de intercambio catiónico aniónico y agitar.

Recoja las muestras mediante pipeteo y colóquelas en nuevos tubos anotados. Seque congele las muestras. Guarde las muestras secas a temperatura ambiente o a 20 grados centígrados.

Mezclar las muestras secas con 2 microlitros de 1 cianoborohidruro de sodio molar y tetrahidrofurano, y 2 microlitros de ácido trisulfónico de pireno 8 amino 1-3-6. Incubar a 42 grados centígrados durante 16 horas en la oscuridad. Agregue 46 microlitros de agua ultra pura a cada muestra.

Para diluir las muestras 50 veces, agregue un microlitro de la muestra a 49 microlitros de agua ultra pura en microviales de 100 microlitros. En vórtice para mezclar a fondo. Coloque las muestras en la oscuridad durante 5 a 10 minutos mientras coloca la cara.

Para realizar la electroforesis de polaridad inversa, configure el método, ajuste la presión de inyección a 0.5 libras de fuerza por pulgada cuadrada. A continuación, establezca la polaridad en modo inverso para la separación. Diluya el tampón de separación de carbohidratos ligado al N a un tercio en agua ultra pura.

Llevar a cabo la separación de glucanos marcados con APTS en el tampón diluido a 30 kilovoltios en un capilar de sílice fundido desnudo. A continuación, configure el tiempo de inyección e inicie el análisis. Exporte los archivos ASC y CDF que contienen el perfil de electroferograma y los datos de integración, respectivamente.

Abra el archivo ASC y dibuje la unidad de fluorescencia relativa de acuerdo con el gráfico de tiempo. Abra el archivo CDF. Proceda con una primera integración automática y ajuste los siguientes parámetros con integración valle a valle y área mínima.

Compruebe y corrija manualmente cualquier evento de integración incorrecto. Las señales de fluorescencia observadas entre 4,13 y 4,67 minutos se originaron a partir del APTS no reaccionado. El tiempo de Aleutiana de la Maltohiosa DP 6 etiquetada se estimó en 8,49 minutos.

Los glucanos marcados con APTS de glucógeno bovino se identificaron en función del tiempo de las Aleutianas de DP 6. No se detectó ningún rastro de Maltooligosacárido libre en la muestra de control en la que el glucógeno no se incubó con enzimas desramificantes. El panel insertado muestra una separación de cadenas de glucano de hasta 44 DP. La distribución de la longitud de la cadena se muestra como el porcentaje de DP para cada DP. La longitud media de la cadena se calculó sumando cada porcentaje de cadena multiplicado por el grado correspondiente de polimerización.

El análisis facial mostró que los glucanos más abundantes son maltosa e hígado de conejo, maltohexaosa en la ostra y maltoheptolosa en el hígado bovino. Las distribuciones de longitud de cadena de glucógeno purificado a partir de cepas bacterianas cianobacterianas de tipo silvestre y mutantes se determinaron mediante análisis facial. Los análisis sustractivos se realizaron restando el porcentaje de cada DP de tipo salvaje del porcentaje de cada DP de mutantes.

Las distribuciones de longitud de cadena promedio de glucógeno de tipo salvaje y mutantes de Synechocystis se normalizaron de acuerdo con el pico máximo observado para cada CLD. Esta técnica permite una mejor comprensión de las enfermedades humanas asociadas con un defecto en el metabolismo del glucógeno, particularmente la enfermedad de Andersen, ricos resultados de la acumulación de partículas anormales de glucógeno en las células.