Desarrollo y funcionalización del transistor de efecto de campo de grafeno activado por electrolitos para la detección de biomarcadores
1 de febrero de 2022
El presente protocolo demuestra el desarrollo del biosensor de transistor de efecto de campo de grafeno activado por electrolitos (EGGFET) y su aplicación en la detección de biomarcadores de inmunoglobulina G (IgG).
El método elimina eficazmente los residuos de PMMA al tiempo que preserva la red de grafeno subyacente. El dispositivo funcional muestra resultados consistentes en la detección de anticuerpos IgG en el suero sanguíneo. Además, el protocolo garantiza la implementación de grafeno CVD en un dispositivo de biodetección en tiempo real y sin etiquetas.
Los pasos son bastante simples y se pueden hacer con un entrenamiento mínimo. El dispositivo ofrece alta selectividad, alta sensibilidad y detección en tiempo real sobre otros dispositivos de biodetección Comience cortando la lámina de grafeno en un sustrato de cobre por la mitad con un bisturí. Aplique cinta resistente al calor para fijar las cuatro esquinas del cuadrado de grafeno en una junta giratoria.
Recubre la hoja cuadrada del grafeno con una capa delgada de 100 a 200 nanómetros de PMMA 495K A4, girando a 500 rotaciones por minuto durante 10 segundos, y luego 2, 000 rotaciones por minuto durante 50 segundos. Luego, hornee la muestra a 150 grados centígrados durante cinco minutos. Retire la parte posterior del grafeno con plasma de oxígeno a 30 vatios utilizando un flujo de velocidad de 15 centímetros cúbicos estándar por minuto durante cinco minutos.
Corte el cuadrado de grafeno tratado con plasma en una dimensión de un centímetro de ancho y dos centímetros de altura para la fabricación del dispositivo. Corte el sustrato de sílice previamente limpiado en trozos pequeños con un ancho aproximado de cuatro centímetros y una altura de dos centímetros. Graba el cobre usando el cloruro férrico de grafeno sin dilución.
Flote la muestra con el lado de cobre hacia abajo y el lado de PMMA hacia arriba en el grabado líquido. Después del grabado de cobre, levante la película de grafeno lentamente con el sustrato tratado con plasma. Seque al aire la película de grafeno transferida durante dos horas, luego hornee en una placa caliente.
Para eliminar el PMMA, comience calentando la muestra con vapor de acetona a 70 grados Celsius manteniendo la muestra aproximadamente dos centímetros por encima del vapor de acetona durante cuatro minutos con el lado del PMMA hacia abajo. Luego, sumerja la muestra en acetona durante cinco minutos. Lave la muestra con agua desionizada con precaución.
Finalmente, seque suavemente la muestra con nitrógeno. Lave el sustrato con el grafeno transferido con acetona, alcohol isopropílico y agua desionizada. Luego, hornee el sustrato en una placa caliente a 75 grados celsius durante 30 minutos.
Utilizando un evaporador de haz de electrones, deposite níquel y oro de 5 y 45 nanómetros de espesor, respectivamente, en la muestra de grafeno. Aplicar el primer proceso de fotolitografía utilizando la máscara A para el patronaje de los electrodos. Girar AZ 5214E fotorresistente positiva en la muestra a 2.000 rotaciones por minuto durante 45 segundos y curar la muestra a 120 grados centígrados durante un minuto.
Coloque la muestra en el sistema de exposición a inundaciones ultravioletas y expóngala durante aproximadamente 10 segundos por debajo de 200 milijulios por centímetro cuadrado. Desarrolle la muestra con un revelador fotorresistente AZ 300 MIF durante aproximadamente dos minutos y luego enjuague con agua desionizada. Sumergir la muestra en un grabado de oro para grabar la capa de oro durante 10 segundos, enjuagar con agua desionizada y eliminar la capa fotorresistente restante sumergiéndola en acetona durante 10 minutos.
Usando acetona, alcohol isopropílico y agua desionizada, lave la muestra seguida de hornear en una placa caliente a 75 grados celsius durante 30 minutos. Luego, aplique el segundo proceso de fotolitografía usando la máscara B para modelar los canales de grafeno. Sumerja la muestra en un grabado de níquel a 60 grados Celsius para grabar la capa de níquel durante 10 segundos.
Enjuague con agua desionizada y seque con nitrógeno. Coloque la muestra en el plasma y retire el grafeno expuesto con plasma de oxígeno. Más tarde, retire la capa fotorresistente sumergiéndola en acetona durante 10 minutos.
Lave la muestra con acetona, IPA y agua desionizada y hornee en una placa caliente a 75 grados centígrados durante 30 minutos. Aplique el tercer proceso de fotolitografía utilizando la máscara C para modelar la capa fotorresistente de pasivación para proteger el grafeno subyacente en el sustrato. Utilice los mismos parámetros de proceso que se mencionaron anteriormente, incluido el hilado con fotorresistente positivo, el curado de la muestra y el desarrollo con el desarrollador de fotorresistencia.
Más tarde, sumerja la muestra en níquel etchant a 60 grados Celsius durante 10 segundos para eliminar la capa de níquel restante, y luego enjuague con agua desionizada y seque con nitrógeno. Finalmente, hornee la muestra en una placa caliente a 120 grados centígrados durante 30 minutos. Los resultados representativos muestran el grafeno CVD transferido caracterizado por Raman y microscopía de fuerza atómica.
El pico G y los picos bidimensionales de la imagen Raman proporcionan información completa sobre la existencia y la calidad del grafeno monocapa transferido. La figura muestra el biosensor EEG FET integrado con un electrodo de referencia estándar de plata en cloruro de plata y un pozo de polidimetil siloxano para contener la muestra. Además, la vista ampliada del canal de grafeno demuestra la conexión al electrodo de la fuente a la tierra, el drenaje y los electrodos de la puerta a la fuente.
PBASE, un reactivo de funcionalización ampliamente utilizado para el grafeno, puede ser absorbido en la superficie del grafeno a través de una interacción pi-pi sin dañar las propiedades eléctricas del grafeno. Un aptámero IgG amino-modificado de 5 primos se conjuga con PBASE por los enlaces de enlace amida entre el éster de cinnamida reactivo e hidroxi-6 en PBASE, y el grupo amina en el extremo 5 primos del aptámero IgG. La incubación de albúmina sérica bovina se utilizó para bloquear los sitios no conjugados restantes después de enjuagar el dispositivo con PBS de una sola fuerza La figura muestra la detección de IgG en diferentes condiciones electrolíticas.
La calidad del grafeno es la clave para el mejor rendimiento de este dispositivo. Por lo tanto, durante el grabado por plasma, debe asegurarse de que el plasma no dañe las regiones útiles del grafeno. Además, los residuos de PMMA deben limpiarse por completo para obtener una superficie de grafeno limpia.
El dispositivo funcional muestra resultados consistentes en la detección de anticuerpos IgG humanos, por lo que el procedimiento se puede utilizar como referencia para construir dispositivos con otros nanomateriales para estudiar las interacciones de interfaz y la biodetección.
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Visión general
Este protocolo demuestra el desarrollo de un biosensor de transistor de efecto de campo de grafeno regulado por electrolito (EGGFET) para la detección de biomarcadores de inmunoglobulina G (IgG). El método asegura una alta selectividad y sensibilidad mientras permite la biodetección en tiempo real y sin etiquetas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biotecnología
- Electrónica
Antecedentes
- El grafeno es un material prometedor para aplicaciones de biodetección.
- Los transistores regulados por electrolito pueden mejorar el rendimiento de los biosensores.
- La inmunoglobulina G (IgG) es un biomarcador crucial en varias enfermedades.
- La detección en tiempo real es esencial para un diagnóstico efectivo.
Propósito del estudio
- Desarrollar un biosensor utilizando tecnología EGGFET.
- Demostrar la aplicación del biosensor en la detección de IgG.
- Proporcionar un protocolo simple para que los investigadores sigan.
Métodos utilizados
- Cortar láminas de grafeno en un sustrato de cobre.
- Aplicar cinta resistente al calor para asegurar el grafeno.
- Utilizar grafeno CVD para la fabricación del dispositivo.
- Probar el dispositivo con muestras de suero sanguíneo para la detección de IgG.
Principales resultados
- El dispositivo muestra resultados consistentes en la detección de anticuerpos IgG.
- Se lograron alta selectividad y sensibilidad.
- Se confirmaron las capacidades de detección en tiempo real.
- El método elimina eficazmente los residuos de PMMA sin dañar el grafeno.
Conclusiones
- El biosensor EGGFET es una herramienta prometedora para la detección de biomarcadores.
- Ofrece ventajas sobre los métodos de biodetección tradicionales.
- La implementación simple lo hace accesible para los investigadores.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This protocol enables the development of a label-free, real-time biosensor for detecting immunoglobulin G (IgG) biomarkers using electrolyte-gated graphene field-effect transistors (EGGFETs). The method supports early-stage target validation by providing a sensitive, reproducible platform for monitoring biomolecular interactions in complex biological matrices such as blood serum. By ensuring clean graphene transfer and effective functionalization, the approach enhances predictive confidence in biomarker detection assays, facilitating go/no-go decisions in discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of IgG biomarker interactions with high sensitivity and selectivity in native biological samples.
- Operational Value: Provides a label-free detection method that reduces assay complexity and eliminates the need for fluorescent or enzymatic tags.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by allowing real-time monitoring of binding kinetics and affinity under physiological electrolyte conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, real-time electrical readouts that enable dose-response analysis and binding specificity screening.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through standardized graphene transfer and PMMA residue removal, minimizing batch-to-batch variability.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple biomarker targets via adaptable surface functionalization with aptamers or antibodies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling IgG detection in disease-relevant sample types like human blood serum.
- Risk-Adjusted Advancement: Generates reliable biomarker signal data that inform preclinical candidate selection and assay qualification.
- Disease-Relevant System: Demonstrates functionality in clinically relevant matrices, supporting extrapolation to diagnostic and therapeutic monitoring applications.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in target validation and enabling scalable assay development for lead identification stages.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven screening of biomolecular interactions by detecting target binding in real time without labels.
- Screening: Produces standardized, quantitative outputs suitable for hit confirmation and selectivity profiling in antibody or aptamer-based assays.
- Analytics: Generates electrical signal measurements (e.g., conductance shifts) that allow comparison of binding responses across conditions and analytes.
- Translational Research: Supports continuity into preclinical work by validating biomarker detection in native biological fluids.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable biosensor platform adaptable to various biomarkers through modular surface functionalization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence through sensitive, label-free detection of IgG in complex samples.
- Operational Value: Improves reproducibility via controlled graphene transfer and effective cleaning protocols that preserve lattice integrity.
- Strategic Value: Enables faster, data-driven go/no-go decisions by delivering real-time binding data early in discovery.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of biomarker targets based on quantifiable, reproducible assay performance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfabrication, photolithography, and graphene handling for successful device production.
- Depends on access to electron beam evaporators, plasma etchers, and spin coaters for electrode deposition and patterning.
- Necessitates standardization of functionalization and blocking steps (e.g., PBASE-IgG aptamer conjugation, BSA blocking) across users and labs.
- Involves adaptation considerations when extending the platform to other biomarkers or nanomaterial interfaces.
- Includes practical limitations such as the need for careful plasma etching to avoid damaging graphene and thorough PMMA removal to ensure signal fidelity.
